一種識別對蝦白斑杆狀病毒的單鏈抗體a1及其用途的製作方法

2023-08-01 07:05:41

專利名稱：一種識別對蝦白斑杆狀病毒的單鏈抗體a1及其用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及水產養殖生物病毒的抗體，更具體涉及一種能識別對蝦白斑杆狀病毒的單鏈抗體。
1993年以來，我國蝦病爆發性流行，引起養殖的對蝦大面積死亡，經濟損失慘重。研究表明，其主要是由一種新的沒有包涵體的C型杆狀病毒—對蝦白斑杆狀病毒所致。該病毒可以感染我國所有人工養殖的對蝦種類，感染性強，發病快，死亡率高，給對蝦養殖業帶來極大的危害；據報導，其它國家和地區也有類似情況。目前，對對蝦病毒病尚無有效的治療方法，避免與病毒病源接觸被認為是最有效的預防措施，而這主要依賴於早期的快速診斷。目前的診斷方法主要有PCR、核酸探針技術和酶聯免疫吸附技術。PCR檢測法雖然靈敏度非常高，但費用昂貴。核酸探針技術對技術條件要求高，檢測時間長，廣大蝦農掌握此技術難度很大，難以推廣；酶聯免疫吸附技術雖可在養蝦場應用，但由於此法所需的多克隆抗體和單克隆抗體製備麻煩、費用高，限制了該技術的應用和發展。
因此，早期快速、簡便地診斷對蝦白斑杆狀病毒的關鍵是能大批量、方便、低價製備識別對蝦白斑杆狀病毒的抗體。
本發明的目的是提供一種能識別對蝦白斑杆狀病毒的單鏈抗體A1，該單鏈抗體可批量生產，並可用於對對蝦白斑杆狀病毒的快速診斷。
本發明的一種能識別對蝦白斑杆狀病毒的單鏈抗體A1，其DNA序列如下GCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGAAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGGCGAGGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAAGTTTCTGGCTTCAACATTAAAGACTACTATATGAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAATGGATTGGATGGATTTATCCTGACAATGGTAATACTATATATGACCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCAGAATAACAGCAGATACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGTTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTAGTGGTGGTAACCCCTGGGTACTGGGGTCAAGGCACCACTCTCTCCGTGTCACAGGTGGAGGCGGCTCTGGTGGCGGTGGCAGTGGCGGCGGAGGTTCTAGACGTCGTGATGACCCAGTCTCAAAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCGTCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGGTACTAATGTAGCCTGNTATCNACAGAAACCAGGGCGATCTCCTAAAACACTGATTTACTCGGCATCCTACCGGTACAGTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAATGTGCAGTCTGAAGACTTGGCAGAGTATTTCTGTCAGCAATATAGCAGCTATCCTCTCACATTCGGTGGTGGGACCAAGTTGGAAATCAAGCGCGCGGCCGCA其製備方法為首先從感病斑節對蝦的血淋巴液中分離純化白斑杆狀病毒，將抗體片段的基因克隆到絲狀噬菌體N-末端第三蛋白基因區域，表達的融合蛋白在噬菌體尾尖表面展示。具有抗原結合活力的抗體片段若由重鏈和輕鏈的可變區域組成，由一可彎曲的小肽連接成為胺基酸單鏈的形式，稱為單鏈抗體。單鏈抗體片段的獲得是通過PCR技術對免疫過或未免疫的小白鼠脾臟mRNA進行反轉錄和擴增，克隆到噬菌體表達載體上。具有抗原結合活力的噬菌體抗體可直接利用抗原親和性從重組噬菌體抗體文庫中淘選，通過再感染大桿菌及菌體擴增培養，可獲得本發明所述的A1單鏈抗體。
其具體製備方法包括如下步驟
1、採用蔗糖密度梯度超速離心法，用電鏡檢測，從感病斑節對蝦的血淋巴液中分離純化白斑杆狀病毒。
2、用蛋白量為20～150μg純化的完整對蝦白斑杆狀病毒粒子注射小鼠，用Titremax佐劑或福氏佐劑或氫氧化鋁等常用佐劑，經17～26天進行二次或三次免疫，再經3～5天用酶聯免疫印跡法和酶聯免疫吸附法測定抗體效價，取抗體效價最高的小鼠脾臟，從中提取mRNA。
3、將此mRNA反轉錄為cDNA，再用對應於重鏈和輕鏈抗體可變部位DNA的引物通過PCR技術將抗體的重鏈和輕鏈的可變片段的DNA擴增。
4、用一編碼可彎曲小肽的DNA小片段將重鏈和輕鏈DNA片段連接起來組成單鏈抗體DNA，再用對應單鏈抗體DNA的引物用PCR技術將整個片段擴增。
5、將單鏈抗體DNA片段兩端的限制性內切酶位點(SfiI和NotI)酶切，再與具同樣酶切位點的噬菌體表達載體連接，電轉移至大腸桿菌中，可獲得較高效價的噬菌體抗體cDNA文庫(＜107)。
6、用吸附在朔料管壁上的對蝦白斑杆狀病毒對上述噬菌體抗體文庫進行1～4次淘選，用酶聯免疫吸附法篩選可得到抗原結合專一性的陽性克隆，該陽性克隆分泌的單鏈抗體可專一性識別對蝦白斑杆狀病毒。
7、選取具有較強ELISA信號的菌株，用於製備可溶性單鏈抗體，即為可專一識別對蝦白斑杆狀病毒的A1單鏈抗體。
本發明的優點與效果單鏈抗體A1可直接用於診斷對蝦白斑杆狀病毒，適合對蝦病毒病的早期檢測，通過大桿菌的繁殖，即可獲得大量的單鏈抗體，比多克隆抗體和單克隆抗體的製備要簡便和便宜得多。
實施例對蝦白斑杆狀病毒的診斷。1)將5μL待測樣品對蝦血淋巴液點於硝酸纖維素膜上。2)將膜放入10ml 4％脫脂奶粉/PBS中，於室溫放置1分鐘。3)再將膜浸入5ml 0.025mol/L重鉻酸鉀溶液中，室溫放置10分鐘，使對蝦血淋巴中的氧化酶類失活。4)用PBS將膜洗3次。5)將膜與3ml含有單鏈抗體A1的大腸桿菌培養液，在室溫下保溫10分鐘。6)用0.1％吐溫-20/PBS將膜洗3次，再用PBS洗三次。7)將膜與3ml 4％脫脂奶粉/PBS 1∶8000倍稀釋的抗單鏈抗體E-tag的免抗鼠IgG/辣根過氧化物酶在室溫下保溫10分鐘。8)將膜用吐溫-20/PBS洗3次，再用PBS洗3次。9)將6mg二氨基聯苯胺，10μl H2O2加入到10ml 50mmol/L三羥甲基氨基甲烷-鹽酸(Tris-Hcl)，PH 7.6中，製成底物溶液，再將膜放入底物溶液中，反應10分鐘，有褐色斑點即為病毒陽性。
權利要求
1.一種識別對蝦白斑杆狀病毒的單鏈抗體A1，其特徵是，該單鏈抗體的DNA序列如下GCGGCCCAGCCGGCCATGGCCGAGGTGAAGCTGCAGCAGTCTGGAGCTGAGCTGGCGAGGCCTGGGGCTTCAGTGAAGCTGTCCTGCAAAGTTTCTGGCTTCAACATTAAAGACTACTATATGAACTGGGTGAAGCAGAGGCCTGAACAGGGCCTGGAATGGATTGGATGGATTTATCCTGACAATGGTAATACTATATATGACCCGAAGTTCCAGGGCAAGGCCAGAATAACAGCAGATACATCCTCCAACACAGCCTACCTGCAGTTCAGCAGCCTGACATCTGAGGACACTGCCGTCTATTACTGTGCTAGTGGTGGTAACCCCTGGGTACTGGGGTCAAGGCACCACTCTCTCCGTGTCACAGGTGGAGGCGGCTCTGGTGGCGGTGGCAGTGGCGGCGGAGGTTCTAGACGTCGTGATGACCCAGTCTCAAAAATTCATGTCCACATCAGTAGGAGACAGGGTCAGCGTCACCTGCAAGGCCAGTCAGAATGTGGGTACTAATGTAGCCTGNTATCNACAGAAACCAGGGCGATCTCCTAAAACACTGATTTACTCGGCATCCTACCGGTACAGTGGAGTCCCTGATCGCTTCACAGGCAGTGGATCTGGGACAGATTTCACTCTCACCATCAGCAATGTGCAGTCTGAAGACTTGGCAGAGTATTTCTGTCAGCAATATAGCAGCTATCCTCTCACATTCGGTGGTGGGACCAAGTTGGAAATCAAGCGCGCGGCCGCA。
2.一種實現權利要求1所述的單鏈抗體A1的用途，其特徵在於，該單鏈抗體可用於對對蝦白斑杆狀病毒的診斷。
全文摘要
本發明公開了一種識別對蝦白斑杆狀病毒的單鏈抗體A1及其用途,給出了單鏈抗體A1的DNA序列,及其該單鏈抗體的製備方法,以及該單鏈抗體在對蝦白斑杆狀病毒診斷中的應用。單鏈抗體A1可直接用於診斷對蝦白斑杆狀病毒,適合對蝦病毒病的早期檢測,通過大桿菌的繁殖,即可獲得大量的單鏈抗體A1,比多克隆抗體和單克隆抗體的製備要簡便,並且費用要低得多。
文檔編號C07K16/08GK1356340SQ0013123
公開日2002年7月3日 申請日期2000年12月8日 優先權日2000年12月8日
發明者高宏, 趙新顏, 張憲孔, 戴玲芬, 趙若虹, M Hanmingsen) 韓明申(Seam, 戴和平 申請人:中國科學院水生生物研究所