一種高活力高產物特異性蔗糖異構酶生產菌株的高通量篩選方法
2023-08-06 02:12:16 3
專利名稱：一種高活力高產物特異性蔗糖異構酶生產菌株的高通量篩選方法
技術領域：
本發明屬於發酵工程和酶工程技術領域，具體涉及一種產蔗糖異構酶(SIase)的微生物菌株的選育方法。
背景技術：
蔗糖異構酶是一類重要的葡萄糖基轉移酶，它是製備功能性糖醇-異麥芽酮糖醇的關鍵酶。異麥芽酮糖醇(Isomalt)是近年來國際上新興的功能性糖醇，具有低能量、低吸收、防齲齒性能，可供糖尿病人群和減肥人士食用，食用安全性高，更值得一提的是異麥芽酮糖醇擁有極低的吸溼性和純正的口味，這是木糖醇和麥芽糖醇等其他功能糖醇難實現的。由於這些特點，異麥芽酮糖醇成為目前最受歡迎的蔗糖替代品。
異麥芽酮糖醇生產分兩步，第一步是由蔗糖異構酶EC 5.4.99.11(Sucrose isomerase)，或叫異麥芽酮糖合成酶(Isomaltulose syntheses)，蔗糖葡萄糖基變位酶(Sucroseglucosylmutase)，α-葡糖基轉移酶(α-glucosyltransferase)催化蔗糖生成異麥芽酮糖，第二步是異麥芽酮糖在催化劑作用下氫化為異麥芽酮糖醇。已知有一些菌種能產生蔗糖異構酶。美國專利4,390,627描述了從Protaminobacter rubrum(紅色精朊桿菌)固定蔗糖變位酶生產異麥芽酮糖的方法。美國專利4,670,387描述了使用Erwinia rhapontici，Protaminobacter rubrum，Serratia plymuthica(粘質沙雷氏菌)的固定化菌體生產異麥芽酮糖的過程，大約可以轉化70-95％蔗糖。美國專利4,857,461公開了從Protaminobacterrubrum，Serratia plymuthica和Erwinia carotovora菌得到的固定化粗酶連續生產異麥芽酮糖的過程。美國專利No.5,229,276和No.5,336,617描述了用Agrobacterium radiobacter(放射性土壤桿菌)的固定化菌體生產海藻酮糖和異麥芽酮糖的過程，異麥芽酮糖佔10％以下。
雖然上述幾種細菌能夠把蔗糖轉變成異麥芽酮糖，但產量很不穩定，轉化率為8～85％。而且，除了主產物外，酶轉化液中還存在部分海藻酮糖和少量的異麥芽糖、異松三糖、葡萄糖和果糖等副產物，一般異麥芽酮糖與海藻酮糖的比例為3∶1～5∶1。產物特異性不高，一方面降低了目的產物的收率，另一方面使下遊過程變得十分困難，生產成本大大增加。因此目前，異麥芽酮糖醇製備工藝的瓶頸主要在於蔗糖異構酶催化製備異麥芽酮糖這一過程。
值得關注的是副產物海藻酮糖和異麥芽酮糖性質類似，也是一種新型甜味劑。因此篩選獲得主產海藻酮糖的蔗糖異構酶產生菌，對進一步開發新型甜味劑市場同樣也具有積極的意義。
篩選能夠高效生產蔗糖異構酶的菌株，在提高SIase酶活的同時，研究影響SIase產物特異性的內在因素並改善SIase產物特異性，對異麥芽酮糖及其糖醇的工業生產以及開發新型甜味劑具有重要意義。然而微生物菌株的篩選是一項繁重的工作，常規的篩選方法工作量很大，需要消耗大量的人力物力，篩選周期很長，而且往往得不到目的菌株，篩選的盲目性很大，因此建立一個高效、快速、微量、準確的篩選方法是提高蔗糖異構酶酶活、改善其產物特異性的關鍵。
微孔板是一類在生物工程領域常用的實驗器皿，六十年代中期，微量培養板在臨床化學中是作為大容積試管的小巧微型替代物而被開發出來的，近年來已經成功地被用作自動搜索活性成分的可靠平臺，主要用於PCR擴增、酶標儀檢測、biolog鑑定系統等，常用規格有48孔板、96孔板、384孔板等，未見將微孔板應用於菌株篩選的報導。
發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種方便快捷的高通量篩選方法，以篩選出高活力、高產物特異性的蔗糖異構酶生產菌株。
為解決上述技術問題，本發明所採用的技術方案如下 一種高活力高產物特異性蔗糖異構酶生產菌株的高通量篩選方法，其特徵在於該方法包括以下步驟 1、微培養 將待篩選的蔗糖異構酶生產菌(如經過化學誘變的菌株或基因改造的工程菌)接入含有培養基的微孔板I中，25～35℃，轉速100～200rpm，振蕩培養8～20h。
2、酶轉化 將微孔板I離心去除上清液，每孔加入0.1～2mL，50～500g/L的蔗糖溶液進行酶轉化反應。
3、初篩 轉化結束後，微孔板I離心，將微孔板I中每孔的上清液稀釋50～100倍後依次轉移至另一微孔板II中。向微孔板II中加入顯色試劑，如DNS試劑(3，5-二硝基水楊酸)，將微孔板II置於沸水浴中反應5分鐘，DNS與還原糖發生氧化還原反應，生成的3-氨基-5-硝基水揚酸在煮沸條件下顯棕紅色，且在一定濃度範圍內顏色深淺與還原糖含量成比例關係，根據這個原理棄去顏色淺的即總轉化率低的菌株。然後利用分光光度計檢測顯色較深的菌株轉化液的吸光值，選擇轉化率提高10％以上的菌株進行復篩。
4、復篩 將初篩後得到的菌株在搖瓶(或搖管)中培養，加入50～500g/L蔗糖溶液，蔗糖溶液的加入量為10～100mL/g溼菌，進行酶轉化反應，轉化液點薄層色譜(TLC)，色譜條件正丁醇∶乙酸乙酯∶乙酸∶水＝7∶10∶7∶6，顯色劑苯胺-二苯胺-磷酸。異麥芽酮糖和海藻酮糖在此條件下顯色不同，根據色斑顏色的深淺及斑點的大小篩選高產異麥芽酮糖或高產海藻酮糖的菌株(斑點越大、顏色越深，表明異麥芽酮糖或海藻酮糖的含量越多)。
對篩選出來的高產異麥芽酮糖或高產海藻酮糖的菌株的轉化液進行高效液相色譜定量檢測，確定菌株的異麥芽酮糖或海藻酮糖產量。色譜條件Agilent1200型HPLC，示差折光檢測器(Shodex R101)，色譜柱為Shodex SP0810，流動相為純水，流速為0.8mL/min，柱溫為80℃。該法可同時檢測異麥芽酮糖或海藻酮糖的濃度。
其中，步驟2或步驟3中所述的離心條件為使用酶標板離心機，5000～10000rpm，10～30min。
本發明的有益效果本發明介紹了一種高活力、高產物特異性蔗糖異構酶生產菌株的篩選方法，綜合微培養板培養方式、酶學反應的性質(微孔板快速檢測)及薄層色譜復篩法，建立了簡便、高效的高通量篩選方法。該篩選方法利用直觀的顯色反應，以及酶標板微培養、連續加樣器和排槍的作用，可達到每人200樣/日以上的處理量，為高產物特異性蔗糖異構酶產生菌的篩選提供了簡便、高效、微量的篩選方法。
圖1為本發明的高產物特異性蔗糖異構酶生產菌株的高通量篩選方法的流程圖。
具體實施例方式 實施例1篩選高產異麥芽酮糖的菌株。
將蔗糖異構酶產生菌培養至對數生長期，離心收集菌體製成菌懸液(約108個)，加入化學誘變劑硫酸二乙酯原液0.2ml，30℃，150rpm振蕩培養30min後終止反應，用磷酸鉀緩衝液(0.1mol/L，pH7.0)洗滌兩次，離心後取不同的稀釋度塗布平板，置30℃培養箱中培養。共獲得410株單菌落。
將單菌落接入含有液體培養基的96孔板中，30℃，轉速120rpm，振蕩培養12h。
將96孔板離心，去除上清液，每孔加入1mL、100g/L的蔗糖溶液進行轉化。
轉化結束後離心取上清液，依次稀釋50倍後，各取100uL轉至另一96孔板中，加等體積的無菌水和DNS試劑(3，5-二硝基水楊酸)，在沸水浴中充分反應5分鐘，棄去顏色淺的即總轉化率低的菌株，初篩工作在一天內完成，得到總轉化率較好的菌株112株。然後利用分光光度計檢測這112株轉化液的吸光值，選取55株總轉化率提高10％以上的菌株進行搖瓶復篩。
將初篩後得到的菌株在搖瓶中培養，加入100g/L蔗糖溶液5mL進行酶轉化反應，轉化液點薄層色譜(TLC)，色譜條件正丁醇∶乙酸乙酯∶乙酸∶水＝7∶10∶7∶6，顯色劑苯胺-二苯胺-磷酸。在此條件下，異麥芽酮糖顯綠色而海藻酮糖顯紅色，根據色斑顏色的深淺及斑點的大小，篩選獲得高產異麥芽酮糖或海藻酮糖的菌株19株，其中目的菌株即高產異麥芽酮糖的菌株11株。
最後對11株菌株進行液相色譜定量檢測，Agilent1200型HPLC，示差折光檢測器(Shodex R101)，色譜柱為Shodex SP0810，流動相為純水，流速為0.8mL/min，柱溫為80℃。最終獲得產生異麥芽酮糖∶海藻酮糖大於8∶1的菌株6株。整個篩選工作共計5天。實施例2篩選高產海藻酮糖的菌株。
設計一對引物，正向引物5′-TTAAGCTTCCATGGATTCTCAAGGATT-3′ 反向引物5′-TTGGATCCCTCGAGCGGATTAAGTTTATAAATG-3′ 通過PCR擴增反應(PCR擴增條件95℃，3min；94℃，30s；50℃，30s；72℃，5min，共30個循環)得到Erwinia rhapontici NCPPB1579中的蔗糖異構酶基因，經過Nco I和Xho I雙酶切後，與載體PET-22b連接，得到重組質粒，轉化大腸桿菌DH5α，構建正確表達蔗糖異構酶的基因工程菌，通過與其他菌屬的蔗糖異構酶基因進行比對，並參考相關文獻，利用快速定點突變試劑盒(TAKALA)對該蔗糖異構酶基因的多個保守序列進行隨機突變，然後在大腸桿菌DH5α中表達，得到有酶活的菌株317株。
將單菌落接入含有液體培養基的96孔板中，35℃，轉速200rpm，振蕩培養20h。
將96孔板離心，去除上清液，每孔加入0.2mL、500g/L的蔗糖溶液進行轉化。
轉化結束後離心取上清液，依次稀釋100倍後，各取50uL轉至另一96孔板中，加等體積的無菌水和DNS試劑(3，5-二硝基水楊酸)，在沸水浴中充分反應5分鐘，棄去顏色淺的即總轉化率低的菌株，初篩工作在一天內完成，得到總轉化率較好的菌株98株。然後利用分光光度計檢測這98株轉化液的吸光值，選取48株總轉化率提高10％以上的菌株進行搖瓶復篩。
將初篩後得到的菌株在搖管中培養，加入500g/L蔗糖溶液2mL進行酶轉化反應，轉化液點薄層色譜(TLC)，色譜條件正丁醇∶乙酸乙酯∶乙酸∶水＝7∶10∶7∶6，顯色劑苯胺-二苯胺-磷酸。在此條件下，異麥芽酮糖顯綠色而海藻酮糖顯紅色，根據色斑顏色的深淺及斑點的大小，篩選獲得高產異麥芽酮糖或海藻酮糖的菌株15株，其中目的菌株即高產海藻酮糖的菌株7株。
最後對7株菌株進行液相色譜定量檢測，色譜條件Agilent1200型HPLC，示差折光檢測器(Shodex R101)，色譜柱為Shodex SP0810，流動相為純水，流速為0.8mL/min，柱溫為80℃。最終獲得產生海藻酮糖∶異麥芽酮糖大於8∶1的菌株3株。整個篩選工作共計5天。
權利要求
1、一種高活力高產物特異性蔗糖異構酶生產菌株的高通量篩選方法，其特徵在於該方法包括以下步驟
(1)將待篩選的蔗糖異構酶生產菌接入含有培養基的微孔板I中，振蕩培養；
(2)將微孔板I離心去除上清液，加入蔗糖溶液進行酶轉化反應；
(3)轉化結束後，微孔板I離心，將微孔板I中每孔的上清液稀釋後依次轉移至微孔板II中，向微孔板II中加入顯色試劑，並檢測吸光值，篩選出蔗糖異構酶高產菌株；
(4)將蔗糖異構酶高產菌株放大培養，加入蔗糖溶液進行酶轉化反應，用薄層色譜檢測蔗糖轉化液中的產物比例，得到高產異麥芽酮糖的菌株或高產海藻酮糖的菌株。
2、根據權利要求1所述的高活力高產物特異性蔗糖異構酶生產菌株的高通量篩選方法，其特徵在於步驟(1)中所述的振蕩培養條件為25～35℃，轉速100～200rpm，振蕩培養8～20h。
3、根據權利要求1所述的高活力高產物特異性蔗糖異構酶生產菌株的高通量篩選方法，其特徵在於步驟(2)或步驟(3)中所述的離心條件為使用酶標板離心機，5000～10000rpm，10～30min。
4、根據權利要求1所述的高活力高產物特異性蔗糖異構酶生產菌株的高通量篩選方法，其特徵在於步驟(3)中所述的顯色試劑為DNS試劑。
5、根據權利要求1所述的高活力高產物特異性蔗糖異構酶生產菌株的高通量篩選方法，其特徵在於步驟(3)中篩選出的蔗糖異構酶高產菌株為轉化率提高10％以上的菌株。
6、根據權利要求1所述的高活力高產物特異性蔗糖異構酶生產菌株的高通量篩選方法，其特徵在於步驟(2)或步驟(4)中所述的蔗糖溶液濃度為50～500g/L。
7、根據權利要求6所述的高活力高產物特異性蔗糖異構酶生產菌株的高通量篩選方法，其特徵在於步驟(2)中蔗糖溶液每孔加入量為0.1～2mL。
8、根據權利要求6所述的高活力高產物特異性蔗糖異構酶生產菌株的高通量篩選方法，其特徵在於步驟(4)中蔗糖溶液的加入量為10～100mL/g溼菌。
9、根據權利要求1所述的高活力高產物特異性蔗糖異構酶生產菌株的高通量篩選方法，其特徵在於步驟(4)中所述的菌株放大培養為搖瓶培養或搖管培養。
全文摘要
本發明公開了一種高活力高產物特異性蔗糖異構酶生產菌株的高通量篩選方法，即將待篩選的蔗糖異構酶生產菌接入含有培養基的微孔板中振蕩培養，離心去除上清液，加入蔗糖溶液進行酶轉化反應，反應結束後，將每孔的上清液依次轉移至另一微孔板中，加入顯色試劑，並檢測吸光值，篩選出蔗糖異構酶高產菌株再進行搖瓶復篩，利用薄層色譜篩選產物特異性較好的菌株，最終得到高產異麥芽酮糖的菌株或高產海藻酮糖的菌株。該篩選方法利用直觀的顯色反應，以及酶標板微培養、連續加樣器和排槍的作用，可達到每人200樣/日以上的處理量，為高產物特異性蔗糖異構酶產生菌的篩選提供了簡便、高效、微量的篩選方法。
文檔編號G01N30/36GK101289687SQ20081012384
公開日2008年10月22日 申請日期2008年6月10日 優先權日2008年6月10日
發明者虹 徐, 莎 李, 環民霞, 賁 任, 馮小海, 恆 蔡, 歐陽平凱 申請人:南京工業大學