一種山黧豆LsSYMRK基因及其在促進菌根形成和增加植物生物量方面的應用的製作方法
2023-07-28 00:35:26 2
專利名稱：一種山黧豆LsSYMRK基因及其在促進菌根形成和增加植物生物量方面的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域，尤其涉及一種山黧豆LSSYMRK基因及其在促進菌根形成和增加植物生物量方面的應用。
背景技術：
菌根(mycorrhiza)是植物和真菌形成的一種互利共生體。泡囊叢枝菌根 (vesicular arbuscular mycorrhiza， VAM， ■禾爾 JA 豐支胃卞艮，AM) ^ 胃巾白勺一力 g。才直物從菌根中主要得到生長發育所需的磷，而菌根真菌得到植物光合作用產物——糖，菌根對於植物的生長發育具有重要意義。共生體形成的過程中，共生受體類似激酶基因 SYMRK(symbiosisrec印tor-like kinase, SYMRK)起到極其關鍵的作用。SYMRK基因對於其與真菌和細菌的共生是必需的，對於根瘤因子的識別傳導起著一個承上啟下傳承的作用，SYMRK基因在叢枝菌根真菌由根表皮細胞向皮層外層細胞通道中起著重要作用。
發明內容
本發明的目的在於提供一種山黧豆SYMRK基因，其核苷酸序列如SEQID NO :1所
7J\ ο本發明的第二個目的在於提供一種山黧豆SYMRK基因編碼的蛋白質，其胺基酸序列如SEQ ID NO 2所示。本發明的第三個目的在於提供一種含有所述山黧豆SYMRK基因的植物表達載體。本發明的第四個目的在於提供用所述植物表達載體轉化的植物細胞、組織或植株。本發明的第五個目的在於提供山黧豆SYMRK基因在促進菌根形成和增加植物生物量方面的應用。本發明的技術路線為1、利用分子生物學方法克隆山黧豆SYMRK基因，命名為=LSSYMRK ；2、構建LsSYMRK植物雙元表達載體，用根癌農桿菌轉化菸草，獲得轉LsSYMRK基因菸草；3、用叢枝菌根真菌(AMF)侵染轉基因菸草和對照菸草，染色檢測菸草根尖的菌根侵染情況，結果表明轉基因菸草其根在AMF侵染後的初期，發育比對照快；4、接種叢枝菌根真菌(AMF)後，側生物量，結果表明轉基因植株在生物量上有顯
者提尚。本發明克隆了一種山黧豆LsSYMRK基因，構建LsSYMRK雙元表達載體，用根癌農桿菌轉化菸草，獲得轉LsSYMRK基因菸草，實驗證明LsSYMRK基因能加快菸草菌根的發育，增加植物生物量。
圖1是LsSYMRK基因編碼的蛋白功能域預測分析圖；圖2是LsSYMRK基因植物雙元表達載體構建流程圖；圖3是LsSYMRK基因植物雙元表達載體p3300-tb-LsSYMRK_N0S質粒圖譜；圖4是轉基因植株PCR檢測電泳圖，a 轉基因植株DNA水平的PCR檢測，b 以轉基因植株RNA為模板的PCR檢測，c 轉基因植株RT-PCR檢測；1_8為轉基因植株，9為野生型植株負對照，10為陽性對照。圖5是轉基因菸草接種AMF40天後相關基因的相對表達量分析圖，圖下面為對應的相對定量值，LsSYMRK轉基因菸草，WT，野生型對照，誤差線為方差。
具體實施例方式以下結合具體實施例對本發明的技術路線做進一步詳細說明。實施例1 LsSYMRK基因克隆利用3』 RACE和5』 RACE獲得LsSYMRK基因片段兩側的未知序列，具體步驟如下1)利用豆科植物SYMRK基因的保守區域設計特異引物，上遊引物LsSYMRK2_5』，下遊引物LsSYMRK2-3』，擴增得到LsSYMRK基因中間片段；2)3，RACE 針對 mRNA3，段具有 polyA 的結構特徵，利用 Oligo (dT) 18 與 polyA 互補以及已知基因片段特異引物擴增基因的3』端序列；3) 5，RACE 在已知片段序列的上遊利用TDT酶添加PolyC片段，然後利用PolyG引物(AAP)錨定上遊，已知基因片段特異引物為下遊引物擴增整個基因的5』端序列；4)分析已經得到的cDNA序列，然後設計LsSYMRK的編碼區全長的上遊引物 LsSYMRK5』和下遊引物LsSYMRK3』，以Oligo (dT) w逆轉錄的產物為模板，利用ExTaq進行 PCR擴增，得到LsSYMRK基因全長，經過測序得到全長為2，775bp序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1 所示。實施例1所用引物具體序列如表1所示。表 權利要求
1.一種山黧豆SYMRK基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示。
2.權利要求1所述山黧豆SYMRK基因編碼的蛋白質，其胺基酸序列如SEQID N0:2所7J\ ο
3.含有權利要求1或2所述山黧豆SYMRK基因的植物表達載體。
4.用權利要求3所述植物表達載體轉化的植物細胞、組織或植株。
5.權利要求1或2所述山黧豆SYMRK基因在促進菌根形成和增加植物生物量方面的應用。
全文摘要
本發明涉及基因工程領域，公開了一種山黧豆LsSYMRK基因及其在促進菌根形成和增加植物生物量方面的應用。本發明構建了LsSYMRK雙元表達載體，用根癌農桿菌轉化菸草，獲得轉LsSYMRK基因菸草，實驗證明LsSYMRK基因能加快菸草菌根的發育，增加植物生物量。
文檔編號C12N9/12GK102453723SQ201010527478
公開日2012年5月16日 申請日期2010年11月2日 優先權日2010年11月2日
發明者林忠平, 胡鳶雷, 譚之京 申請人:林忠平