一種檢測微囊藻產毒的方法

2023-07-27 11:35:01 3

專利名稱：一種檢測微囊藻產毒的方法
技術領域：
本發明涉及藍藻中的微囊藻，更具體涉及檢測微囊藻是否產毒的方法。
我國湖泊等水體發生的藍藻水華絕大多數為微囊藻水華。在微囊藻中，有些種類產微囊藻毒素，有些則不產生微囊藻毒素。即使在同一種類中，也有產毒和非產毒株系之分，如銅綠微囊藻Microcystisaeruginosa。
傳統的微囊藻分類主要以形態學特徵為依據，如群體大小、形態和膠鞘有無等。大量的研究表明，上述作為分類依據的形態學特徵在不同種類之間並沒有顯著的差別，並且，即便是同一種類，這些特徵也會隨其生長環境的變動而產生差異。由於上述原因，使得微囊藻種間水平的鑑別顯得尤為困難。通過形態學分類的方法無法鑑別微囊藻是否產生毒素。
現有檢測產毒微囊藻的分子生物學方法如下抽提待檢測藻樣的總DNA，然後以總DNA作為模板。由於微囊藻毒素合成酶基因mcyB僅存在於產毒微囊藻中，根據mcyB序列設計出特異引物TOX1P/1M和TOX2P/2M。用TOX1P/1M和TOX2P/2M兩對引物，通過PCR的方法特異性地擴增出產毒微囊藻中mcyB的某些片段，從而鑑定微囊藻樣品是否產毒。
該方法的不足之處在於抽提細胞的總DNA耗時長、效率低、樣品需要量較大，且抽提DNA所用的去汙劑很難完全去除，影響PCR檢測的準確性和重現性；另一方面，抽提總DNA需要的試劑、儀器設備複雜，無法用於現場水華樣品的直接檢測，使得其應用範圍受到限制。
為了達到上述目的，本發明按下列步驟順序進行1、取含有0.1～5毫克微囊藻的藻液，用3000～6000轉/分鐘離心5～10分鐘，去除上清液；2、加入1～5毫升無菌的去離子水，充分混勻，用3000～6000轉/分鐘離心5～10分鐘，去上清；
3、將步驟2重複3～5次，再加入1～5毫升無菌去離子水，充分混勻，得到藻細胞懸液；4、根據TOX1P/1M和TOX2P/2M的序列合成TOX1P/1M和TOX2P/2M兩對引物，序列如下TOX1P5』-CGATTGTTACTGATACTCGCC-3』TOX1M5』-TAAGCGGGCAGTTGCTGC-3』TOX2P5』-GGAACAAGTTGCACAGAATCCGC-3』TOX2M5』-CCAATCCCTATCTAACACAGTAACTCGG-3』5、將下列試劑加入到試管中牛血清白蛋白(BSA)20pmol，2微升含1.5毫摩爾MgCl2的10倍熱穩定DNA聚合酶反應緩衝液，四種單核苷酸(dNTPs)各0.2微摩爾的混合物；引物對TOX1P/1M 20pmol；熱穩定的DNA聚合酶(Taq DNA Polymerase)0.5個單位；6微升藻細胞懸液，再加入去離子水至總體積20微升；如果總體積為20～100微升，上述相關試劑用量按相應比例擴大；6、用DNA聚合酶鏈式擴增反應(PCR)儀，進行PCR；採用下列參數起始變性93～96℃，1分鐘，循環數30個(92～96℃，15～25秒；55～57℃，25～40秒；72℃，50～60秒)，後處理過程72℃，7分鐘，得到引物對TOX1P/1M擴增的片段；7、將步驟5中的引物對TOX1P/1M換成引物對TOX2P/2M，其它試劑與步驟5相同，重複步驟6的操作，得到引物對TOX2P/2M擴增的片段；
8、選取確定產毒的微囊藻擴增到的特異性片段作為陽性對照，用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，如果微囊藻樣品中擴增的特異性片段與陽性對照中特異性片段在同一條直線上，則表明該片段與陽性對照的大小一致，是產毒微囊藻。
上述產毒微囊藻中，引物對TOX1P/1M擴增的片段約為1300bp，引物對TOX2P/2M擴增的片段約為350bp。
全細胞PCR與常規PCR的區別為，在全細胞PCR中加入一定量的BSA。在PCR反應的起始變性階段，溫度達到95℃，使得部分藻細胞的DNA釋放出來，作為PCR反應的模板。如果沒有BSA，DNA可能會被核酸酶(DNase)降解，BSA有穩定反應的作用，防止DNA的降解，從而使反應順利進行。全細胞PCR不需要複雜的反應程序或要求特殊的熱循環儀。另外，BSA價格低廉，且用量很小。
本發明與現有技術相比具有以下優點1、對材料的要求不高，無論以實驗室培養物、自然水樣或以幹藻粉等作為材料都可獲得較好的擴增效果，因此，可直接應用於野外樣品的檢測；2、省去了抽提DNA等煩瑣的步驟，操作較為簡單易行，省時省力；3、成本低廉，對操作和儀器的要求不高，檢測通量大；4、檢測所需時間短、重現性好、靈敏度和準確性高、結果直觀，為及時預報自然水體中的產毒微囊藻提供了靈敏、可靠的技術。
2、加入2毫升無菌的去離子水，充分混勻，用5000轉/分鐘離心5分鐘，去上清；3、將步驟2重複3次，再加入2毫升無菌去離子水，充分混勻，得到藻細胞懸液；4、根據TOX1P/1M和TOX2P/2M的序列合成TOX1P/1M和TOX2P/2M兩對引物，序列如下TOX1P5』-CGATTGTTACTGATACTCGCC-3』TOX1M5』-TAAGCGGGCAGTTGCTGC-3』TOX2P5』-GGAACAAGTTGCACAGAATCCGC-3』TOX2M5』-CCAATCCCTATCTAACACAGTAACTCGG-3』5、將下列試劑加入到試管中牛血清白蛋白(BSA)20pmol，2微升含1.5毫摩爾MgCl2的10倍熱穩定DNA聚合酶反應緩衝液，四種單核苷酸(dNTPs)各0.2微摩爾的混合物；引物對TOX1P/1M 20pmol；熱穩定的DNA聚合酶(Taq DNA Polymerase)0.5個單位；6微升藻細胞懸液，再加入去離子水至總體積20微升；6、用DNA聚合酶鏈式擴增反應儀，進行PCR；採用下列參數起始變性96℃，1分鐘，循環數30個(94℃，15秒；57℃，25秒；72℃，60秒)，後處理過程72℃，7分鐘，得到引物對TOX1P/1M擴增的片段；7、將步驟5中的引物對TOX1P/1M換成引物對TOX2P/2M，其它試劑與步驟5相同，重複步驟6的操作，得到引物對TOX2P/2M擴增的片段；
8、選取Microcystis sp.PCC7806(微囊藻屬PCC7806)擴增到的特異性片段作為陽性對照，用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，Microcystiswesenbergii 908中擴增的特異性片段和Microcystis sp.PCC7806中擴增的特異性片段在同一條直線上，表明Microcystis wesenbergii 908是產毒微囊藻。
TOX1P5』-CGATTGTTACTGATACTCGCC-3』TOX1M5』-TAAGCGGGCAGTTGCTGC-3』TOX2P5』-GGAACAAGTTGCACAGAATCCGC-3』TOX2M5』-CCAATCCCTATCTAACACAGTAACTCGG-3』5、將下列試劑加入到試管中牛血清白蛋白(BSA)20pmol，2微升含1.5毫摩爾MgCl2的10倍熱穩定DNA聚合酶反應緩衝液，四種單核苷酸(dNTPs)各0.2微摩爾的混合物；引物對TOX1P/1M 20pmol；熱穩定的DNA聚合酶(Taq DNA Polymerase)0.5個單位；6微升藻細胞懸液，再加入去離子水至總體積20微升；6、用DNA聚合酶鏈式擴增反應儀，進行PCR；採用下列參數起始變性96℃，1分鐘，循環數30個(95℃，20秒；56℃，30秒；72℃，55秒)，後處理過程72℃，7分鐘，得到引物對TOX1P/1M擴增的片段；7、將步驟5中的引物對TOX1P/1M換成引物對TOX2P/2M，其它試劑與步驟5相同，重複步驟6的操作，得到引物對TOX2P/2M擴增的片段；8、選取Microcystis sp.PCC7806擴增到的特異性片段作為陽性對照，用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，Microcystis aeruginosa 937中擴增的特異性片段和Microcystis sp.PCC7806中擴增的特異性片段不在同一條直線上，表明Microcystis aeruginosa 937不是產毒微囊藻。
權利要求
1.一種檢測微囊藻產毒的方法，其特徵在於，該方法按下列步驟順序進行A、取含有0.1～5毫克微囊藻的藻液，用3000～6000轉/分鐘離心5～10分鐘，去除上清液；B、加入1～5毫升無菌的去離子水，充分混勻，用3000～6000轉/分鐘離心5～10分鐘，去上清；C、將步驟B重複3～5次，再加入1～5毫升無菌去離子水，充分混勻，得到藻細胞懸液；D、根據TOX1P/1M和TOX2P/2M的序列合成TOX1P/1M和TOX2P/2M兩對引物，序列如下TOX1P5』-CGATTGTTACTGATACTCGCC-3』TOX1M5』-TAAGCGGGCAGTTGCTGC-3』TOX2P5』-GGAACAAGTTGCACAGAATCCGC-3』TOX2M5』-CCAATCCCTATCTAACACAGTAACTCGG-3』E、將下列試劑加入到試管中牛血清白蛋白(BSA)20pmol，2微升含1.5毫摩爾MgCl2的10倍熱穩定DNA聚合酶反應緩衝液，四種單核苷酸(dNTPs)各0.2微摩爾的混合物；引物對TOX1P/1M 20pmol；熱穩定的DNA聚合酶(Taq DNA Polymerase)0.5個單位；6微升藻細胞懸液，再加入去離子水至總體積20微升；F、用DNA聚合酶鏈式擴增反應儀，進行PCR；採用下列參數起始變性93～96℃，1分鐘，循環數30個(92～96℃，15～25秒；55～57℃，25～40秒；72℃，50～60秒)，後處理過程72℃，7分鐘，得到引物對TOX1P/1M擴增的片段；G、將步驟E中的引物對TOX1P/1M換成引物對TOX2P/2M，其它試劑與步驟E相同，重複步驟F的操作，得到引物對TOX2P/2M擴增的片段；H、選取確定產毒的微囊藻擴增到的特異性片段作為陽性對照，用瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，如果微囊藻樣品中擴增的特異性片段與陽性對照中特異性片段在同一條直線上，則表明該片段與陽性對照的大小一致，是產毒微囊藻。
全文摘要
本發明公開了一種檢測微囊藻產毒的方法，該方法根據微囊藻毒素合成酶基因mcyB僅存在於產毒微囊藻的原理，用mcyB序列設計出特異引物TOX1P/1M和TOX2P/2M，利用全細胞PCR，通過樣品的製備、引物的合成、PCR反應、電泳檢測來確定微囊藻是否產毒。本發明檢測時間短、重現性好、靈敏度和準確性高，所需儀器設備和試劑相對簡單，可大批量快速鑑別培養物或自然水樣中的微囊藻是否產毒。
文檔編號C12Q1/04GK1428434SQ02139280
公開日2003年7月9日 申請日期2002年11月14日 優先權日2002年11月14日
發明者宋立榮, 潘卉, 翟超, 甘南琴, 劉永定 申請人:中國科學院水生生物研究所