一種人腫瘤抑制蛋白變體及其應用的製作方法
2023-07-28 03:08:01
本發明屬於生物技術領域，具體地說，本發明涉及腫瘤抑制蛋白變體。
背景技術：
KIAA0157定位於10q26.13(NM_032182.)，mRNA全長3008bp，cDNA1248bp，編碼416個胺基酸(序列2)，分子量為47KD的蛋白質。小鼠、大鼠與人的KIAA0157同源性高達90％以上，說明它在進化過程中高度保守，可能發揮著重要的生物學功能。利用生物信息學分析顯示，KIAA0157蛋白內部215-266位胺基酸處存在著一個coiled coil結構域，此結構域通常存在於單體蛋白質中，且高度保守，通常介導蛋白與蛋白之間的相互作用。在對抗凋亡蛋白BPE(BRCA複合體亞基4)的相互作用蛋白篩選過程中，KIAA0157被篩選到。該基因及蛋白為全細胞分布，並在多種腫瘤組織中明顯下調表達。高表達KIAA0157可抑制包括肝癌細胞\肺癌細胞\神經母細胞瘤細胞的生長，並導致細胞發生G0/G1期阻滯。
在現有技術中，為了提高蛋白的活性，針對蛋白的活性位點進行特異性的突變和取代，從而尋找活性更高的變體是常規的做法。為了進一步提高該蛋白的生物活性，申請人通過大量的實驗，針對KIAA0157胺基酸序列中特定的位點進行了點突變，從而獲得了比KIAA0157蛋白本身具有更高抑制活性的變體。
發明詳述
本發明涉及親本蛋白的分離的變體，其在至少一個對應於SEQ ID NO:1的成熟多肽的位置I40H、H57Q、K85P、W94Q、Q110S、H113G、H141Y、N151A、S159P、L160P、K190I、Y213I、V220F、A222Y、R232P、V241Q、R260P、S267T、D276E、S286L、D298S、D303L、Y308K、P313K、Q316S、T319H、H322S、S328A、M331Q、R333R、G338A、P359I、G366F、S372I和P383L的位置包含修飾。具體而言，本發明的變體具有改善的抑制活性。
優選地，應用於本發明的方法、呈現改善的熱穩定性和抑制活性的蛋白變體包含至少2種任一下述修飾：I40H/A222Y、H57Q/V220F、K85P/H322S、W94Q/S328A、Q110S/H113G、H141Y/P383L、N151A/G366F、L160P/P383L、K190I/D298S、K85P/R232P、V241Q/S286L、H57Q/R260P、S286L/P383L、W94Q/D298S、Y213I/D303L、Q316S/S372I、Q110S/G338A。
本發明還涉及產生本發明的蛋白變體的方法，包括(a)培養宿主細胞；和(b)回收所述蛋白變體。
在本發明的產生方法中，使用本領域熟知的方法在適合於產生所述多肽的營養培養基中培養細胞。例如，可以通過在合適培養基中和允許表達和/或分離所述多肽的條件下進行的搖瓶培養，和實驗室或工業發酵罐中的小規模或大規模發酵(包括連續、分批、補料分批或固態發酵)來培養細胞。使用本領域已知的方法在合適的營養培養基中進行培養，所述營養培養基包含碳源和氮源和無機鹽。合適的培養基能夠從商業供應商獲得或可以根據公開的組成製備(例如，在美國典型培養物保藏中心的目錄中)。如果多肽分泌到營養培養基中，該多肽能夠從所述培養基中直接回收。如果多肽不分泌，其能夠從細胞裂解物(lysate)回收。
所得多肽可以使用本領域已知的方法回收。例如，多肽可以通過常規方法從營養培養基中回收，所述常規方法包括但不限於離心、過濾、提取、噴霧乾燥、蒸發或沉澱。
本發明的多肽可以通過多種本領域已知的方法純化，所述方法包括但不限於層析(例如，離子交換、親和、疏水、層析聚焦和大小排阻)、電泳方法(例如，製備型(preparative)等電聚焦)、差示溶解度(例如，硫酸銨沉澱)、SDS-PAGE或提取(參見，例如，Protein Purification,J.-C.Janson和Lars Ryden編,VCH Publishers,New York,1989)。
本發明的多肽用於製備相應的藥物，用於治療癌症，優選的，治療肝癌。
具體實施方式
實施例1：KIAA0157基因的獲得
提出人骨髓細胞總RNA，按反轉錄試劑盒(Promega公司)說明書進行反轉錄。取1μg定量後的RNA，加水補至10.5μl，70℃、10min，加入2μl的10×buffer、2μl的MgCl2、2μl的dNTP、1μl的oligo dT、1μl的rRNasin、1.5μl的AMV(15U)，反應體系共20μl；42℃、1h；94℃、5min；4℃、5min。RNA即反轉錄為cDNA。以5』-CGGAATTCAATGTCCTACAG AGAGCAGGTT-3』；5』-GGGGATCCTTAAATCTGGGAGG TCTGAGTG-3』為引物PCR擴增目的片段。PCR條件為：
Cycle 1(1x)
94℃5min
Cycle 2(30x)
94℃1min
55℃30s
72℃1min
Cycle 3(1x)
72℃10min
PCR產物進行1％瓊脂糖凝膠電泳，結果產生特異的DNA條帶，將該DNA片段與PMD-18-T載體(TAKARA生物公司)連接，連接產物轉化E.coli JM109，菌落PCR鑑定為陽性克隆後，再經酶切鑑定後測序。測序後的序列為序列1所示。
實施例2：相應突變後的KIAA0157的獲得方法
1.突變點的引入
(1)根據相應的突變位點設計相應的誘變引物，採用PCR定點突變法在KIAA0157基因上把野生型對應的胺基酸位點進行突變；
(2)上述PCR產物經膠回收純化後，用限制性內切酶進行酶切，與經過相同酶切的質粒pPIC9k片段連接後，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞；
2.鑑定重組質粒：用酶切、PCR方法對重組質粒進行鑑定，並測序檢驗，由此得到突變後的核苷酸序列。
實施例3、KIAA0157變體過表達抑制細胞集落形成
為了研究KIAA0157變體對細胞增殖有影響，我們構建了KIAA0157變體-myc/hisB+真核表達載體，並採用集落形成實驗檢測了KIAA0157變體在HepG2細胞中過表達後其增殖的變化情況。結果如下：
表1KIAA0157變體過表達抑制細胞集落形成情況
實施例4KIAA0157變體表達引起HepG2細胞G0/G1期阻滯
為了解KIAA0157變體對HepG2細胞周期的影響，我們在HepG2細胞轉染了帶GFP標籤的KIAA0157的真核表達載體，流式細胞儀檢測細胞周期各時相的分布。通過實驗發現，與轉染KIAA0157原始蛋白相比，轉染KIAA0157變體的真核表達載體後HepG2細胞出現G0/G1期阻滯的變化，結果如下：
表2KIAA0157變體針對HepG2細胞G0/G1期阻滯的影響水平
序列表
朱育盼
〈120〉一種人腫瘤抑制蛋白變體及其應用
〈160〉1
〈210〉1
〈211〉416
〈212〉PRT
〈213〉人種(Homo Sapiens.)
〈400〉1
Met Ala Ala Ser Ile Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Ala Val Cys Phe His 16
Ser Ala Asn Ser Asn Ala Asp His Glu Gly Phe Leu Leu Gly Glu Val 32
Arg Gln Glu Glu Thr Phe Ser Ile Ser Asp Ser Gln Ile Ser Asn Thr 48
Glu Phe Leu Gln Val Ile Glu Ile His Asn His Gln Pro Cys Ser Lys 64
Leu Phe Ser Phe Tyr Asp Tyr Ala Ser Lys Val Asn Glu Glu Ser Leu 80
Asp Arg Ile Leu Lys Asp Arg Arg Lys Lys Val Ile Gly Trp Tyr Arg 96
Phe Arg Arg Asn Thr Gln Gln Gln Met Ser Tyr Arg Glu Gln Val Leu 112
His Lys Gln Leu Thr Arg Ile Leu Gly Val Pro Asp Leu Val Phe Leu 128
Leu Phe Ser Phe Ile Ser Thr Ala Asn Asn Ser Thr His Ala Leu Glu 144
Tyr Val Leu Phe Arg Pro Asn Arg Arg Tyr Asn Gln Arg Ile Ser Leu 160
Ala Ile Pro Asn Leu Gly Asn Thr Ser Gln Gln Glu Tyr Lys Val Ser 176
Ser Val Pro Asn Thr Ser Gln Ser Tyr Ala Lys Val Ile Lys Glu His 192
Gly Thr Asp Phe Phe Asp Lys Asp Gly Val Met Lys Asp Ile Arg Ala 208
Ile Tyr Gln Val Tyr Asn Ala Leu Gln Glu Lys Val Gln Ala Val Cys 224
Ala Asp Val Glu Lys Ser Glu Arg Val Val Glu Ser Cys Gln Ala Glu 240
Val Asn Lys Leu Arg Arg Gln Ile Thr Gln Arg Lys Asn Glu Lys Glu 256
Gln Glu Arg Arg Leu Gln Gln Ala Val Leu Ser Arg Gln Met Pro Ser 272
Glu Ser Leu Asp Pro Ala Phe Ser Pro Arg Met Pro Ser Ser Gly Phe 288
Ala Ala Glu Gly Arg Ser Thr Leu Gly Asp Ala Glu Ala Ser Asp Pro 304
Pro Pro Pro Tyr Ser Asp Phe His Pro Asn Asn Gln Glu Ser Thr Leu 320
Ser His Ser Arg Met Glu Arg Ser Val Phe Met Pro Arg Pro Gln Ala 336
Val Gly Ser Ser Asn Tyr Ala Ser Thr Ser Ala Gly Leu Lys Tyr Pro 352
Gly Ser Gly Ala Asp Leu Pro Pro Pro Gln Arg Ala Ala Gly Asp Ser 368
Gly Glu Asp Ser Asp Asp Ser Asp Tyr Glu Asn Leu Ile Asp Pro Thr 384
Glu Pro Ser Asn Ser Glu Tyr Ser His Ser Lys Asp Ser Arg Pro Met 400
Ala His Pro Asp Glu Asp Pro Arg Asn Thr Gln Thr Ser Gln Ile 415