一種凝膠電泳分離純化pcr產物的方法
2023-08-10 17:39:41
一種凝膠電泳分離純化pcr產物的方法
【專利摘要】本發明公開了一種凝膠電泳分離純化PCR產物的方法。具體步驟為：首先將目的基因用膠回收試劑盒回收，CRT－PD－1回收產物用NotⅠ/XholⅠ酶切，同時用NotⅠ和XholⅠ對pET28a(+)載體雙酶切，純化後兩者等體積混合用T4連接酶16℃連接16h～20h；連接產物轉化至預先製備好的大腸桿菌感受態細胞DH5α(DE3)，離心後棄300μl上清，重懸剩餘菌液塗於已預熱的卡那黴素的LB平板上，細菌培養箱培養過夜；第二日挑克隆接種於含有卡那黴素的LB培養液中37℃搖床振蕩過夜。其後需要經PCR及酶切鑑定後，將陽性質粒進行測序。本發明的有益效果是，所得產物經SDS－PAGE檢測後，在45kDa處顯示特異條帶，最後經WesternBlotting鑑定，所純化蛋白能被CRT抗體和PD1抗體抗體識別；獲得較純的融合蛋白，所構建的載體可為進一步研究兩者的功能和免疫學特性及腫瘤的免疫治療奠定了基礎。
【專利說明】-種凝膠電泳分離純化PCR產物的方法
【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種PCR的生成方法，具體來說，是指一種凝膠電泳分離純化PCR產物 的方法。
【背景技術】
[0002] 鈣網蛋白是屬於熱休克蛋白家族的一類高度保守內質網可溶性蛋白，分子量為46 kD，主要存在於內質網腔。研究顯示，應用蒽環類藥物和γ -射線能誘導腫瘤細胞發生凋 亡時，CRT從胞內向膜表面快速轉位並在細胞膜上簇集，出現在凋亡細胞膜上的CRT能被吞 噬細胞膜上的相應受體識別，由此活化吞噬細胞並啟動對凋亡細胞的吞噬作用，這類凋亡 的腫瘤細胞具有良好的免疫原性。程序性死亡因子及其配體ro - L1是蛋白家族的兩個新 成員，屬於I型跨膜分子。作為一種免疫共刺激分子，ro - 1主要表達於活化的淋巴細胞 膜表面，PDL1與ro - 1結合產生負向免疫調節作用，在機體的免疫穩定與耐受方面發揮正 常的調節功能。新近的體內外實驗發現，腫瘤細胞膜上高表達ro - L1分子，它與淋巴細胞 上的ro - 1結合後，將抑制效應性T細胞活性，同時降低後者IL 一 2和IFN - γ的表達 和分泌，形成腫瘤細胞免疫逃逸的微環境，促進腫瘤的生長。而可溶性PD1與ro - L1的結 合可以阻斷ro - L1的活性，促進淋巴細胞的活性，在抗腫瘤和抗病毒中具有重要作用。
【發明內容】
[0003] 為克服上述技術問題，我們提出了以下技術方案： 一種凝膠電泳分離純化PCR產物的方法，其特徵在於：首先將目的基因用膠回收試劑 盒回收，CRT - PD-1回收產物用Not I / Xhol I酶切，同時用Not I和Xhol I對pET28a (+ )載體雙酶切，純化後兩者等體積混合用T4連接酶16 °C連接16h?20 h;連接產物 轉化至預先製備好的大腸桿菌感受態細胞DH5a( DE3)，離心後棄300 μ 1上清，重懸剩餘 菌液塗於已預熱的卡那黴素的LB平板上，細菌培養箱培養過夜；第二日挑克隆接種於含有 卡那黴素的LB培養液中37°C搖床振蕩過夜。
[0004] 本發明中，其後需要經PCR及酶切鑑定後，將陽性質粒進行測序。
[0005] 本發明的有益效果是，所得產物經SDS - PAGE檢測後，在45 kDa處顯示特異條 帶，最後經Western Blotting鑑定，所純化蛋白能被CRT抗體和PD1抗體抗體識別；獲得 較純的融合蛋白，所構建的載體可為進一步研究兩者的功能和免疫學特性及腫瘤的免疫治 療奠定了基礎。
【具體實施方式】
[0006] 具體步驟為：首先將目的基因用膠回收試劑盒回收，CRT - ro - 1回收產物用 Not I / Xhol I酶切，同時用Not I和Xhol I對pET28a ( + )載體雙酶切，純化後兩者等 體積混合用T4連接酶16 °C連接16h?20 h ;連接產物轉化至預先製備好的大腸桿菌感 受態細胞DH5 a ( DE3)，離心後棄300 μ 1上清，重懸剩餘菌液塗於已預熱的卡那黴素的LB
【權利要求】
1. 一種凝膠電泳分離純化PCR產物的方法，其特徵在於：首先將目的基因用膠回收 試劑盒回收，CRT - ro - 1回收產物用Not I / Xhol I酶切，同時用Not I和Xhol I對 pET28a ( + )載體雙酶切，純化後兩者等體積混合用T4連接酶；16 °C連接16h?20 h; 連接產物轉化至預先製備好的大腸桿菌感受態細胞DH5a( DE3)，離心後棄300 μ 1上清， 重懸剩餘菌液塗於已預熱的卡那黴素的LB平板上，細菌培養箱培養過夜；第二日挑克隆接 種於含有卡那黴素的LB培養液中37°C搖床振蕩過夜。
2. 如權利要求1所述的一種凝膠電泳分離純化PCR產物的方法，其特徵在於：其後需 要經PCR及酶切鑑定後，將陽性質粒進行測序。
【文檔編號】C12N15/66GK104120140SQ201310519248
【公開日】2014年10月29日 申請日期:2013年10月29日 優先權日:2013年10月29日
【發明者】王景文 申請人:王景文