水通道蛋白-4自身抗體的檢測方法及融合表達病毒載體和應用的製作方法

2023-08-02 07:38:01

水通道蛋白-4自身抗體的檢測方法及融合表達病毒載體和應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種水通道蛋白-4自身抗體的檢測方法及融合表達病毒載體和應用。所述病毒載體為pCDH-MCS-AQP4-EF1-copGFP，其核苷酸序列如序列表如SEQIDNO.2所示。本發明更進一步公開了融合表達病毒載體在製備用於提高視神經脊髓炎和多發性硬化的臨床診療水平方面的應用。本發明採用靈敏度和特異性更高的螢光免疫細胞染色結合流式細胞檢測技術，用於臨床定性、定量檢測AQP-4抗體，使檢測結果更加穩定，且極大節約人力和時間成本。該項目的建立將極大提高視神經脊髓炎疾病譜和多發性硬化的診療水平，提高患者的勞動能力和生活質量，將產生很大的社會效益和經濟效益。
【專利說明】水通道蛋白-4自身抗體的檢測方法及融合表達病毒載體和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種流式細胞術檢測水通道蛋白-4自身抗體的方法及其融合表達病毒載體。水通道蛋白(aquaporin，AQP)_4抗體陽性是視神經脊髓炎診斷的重要支持條件，抗體滴度與患者病情的嚴重程度、預後、復發具有相關性。本發明屬於疾病分子鑑定和診斷領域，結合病毒載體構建，轉染，螢光免疫染色及流式細胞分析技術，主要應用於NMO和MS的臨床鑑別診斷，提高NMO和MS的診斷水平；能輔助作為用藥療效、病情監測、復發預測的指標;AQP_4檢測平臺的建立能為進一步研究AQP-4抗體的致病機制提供基礎。
【背景技術】[0002]多發性硬化(MultipleSclerosis, MS)和視神經脊髓炎(neuromyelitisoptica, NMO)是中樞神經系統最為常見的脫髓鞘疾病，已成為中青年非外傷致殘首要疾病之一。兩種疾病均常累及視神經和脊髓，因此臨床上較難區分，尤其是發病早期。目前研究認為MS是由CD4輔助T細胞(包括Thl和Thl7亞群)介導的自身免疫疾病，故治療多以免疫調節為主，如β -幹擾素等。而NMO以體液免疫為主,治療多以免疫抑制為主。因此，早期鑑別診斷對指導兩種疾病的治療和評估預後非常重要。2004年Lennon等通過間接免疫螢光染色方法檢測發現視神經脊髓炎病人血清中存在著一種特異性自身抗體NMO-1gG，它在視神經炎(Optic neuritis, ON)、長節段橫貫性脊髓炎(Longitudinally extensivetranverse myelitis, LETM)患者血清中的陽性率也較高,2006年Wingerchuk DM修訂了NMO診斷標準，將NMO-1gG抗體陽性做為診斷的重要支持條件，該診斷標準強調了水通道蛋白-4抗體在NMO診斷中的重要價值。在此基礎上，Wingerchuk DM又於2007年提出了視神經脊髓炎疾病譜，認為0N、LETM (包括伴有自身免疫病和/或有顱內病灶)為視神經脊髓炎的限定型，連同視神經脊髓型多發性硬化(OSMS)—同被歸為NMO的疾病譜。後續研究還發現，AQP4抗體滴度與患者病情的嚴重程度、預後、復發具有相關性，臨床上用免疫球蛋白和血漿置換治療NMO療效較好。NMO患者屍檢的病理顯示病灶中血管周圍有大量的免疫球蛋白和補體沉積、星型膠質細胞破壞和再生，其分布與AQP-4表達的分布相一致。通過AQP-4抗體陽性血清與轉染AQP-4cDNA的HEK293細胞孵育，並用抗人IgG示蹤已結合的抗體，發現NMO中的AQP-4抗體為IgGl，而IgGl具有激活補體功能。進一步的體外實驗證實AQP-4抗體與表達AQP-4分子的HEK細胞結合後能激活補體。2009年Bennett等研究發現，在已經誘導出EAE的大鼠鞘內注射人工合成的AQP-4抗體能夠導致病灶內星型膠質細胞的死亡，與NMO病灶病理改變相似。這提示AQP4抗體可能不僅僅是NMO的標誌物，有可能是致病性抗體。
[0003]目前國際上檢測AQP-4抗體的技術主要有間接免疫螢光法(IndirectImmunofluorescence, HF)、突光免疫沉澱法(Fluoroimmunoprecipitation Assay,FIPA)、放射免疫沉澱法(Radioimmunoprecipitation Assay, RIPA)、突光免疫細胞染色法(Cell-Based Assay, CBA)(文獻支持 Clin Immunol.2011 Mar; 138(3):239-46,Neurology.2012 Feb 28;78 (9):665-71 ；)及酶聯免疫吸附法(Enzyme-LinkedImmunoSorbent Assay, ELISA)。其中以CBA和FIPA的敏感性和特異性最為理想。然而，CBA法平均檢測周期超過兩天，螢光效率不穩定，而且需要人為觀察，費時費力，而且可能會增加檢測中的人為誤差；FIPA法涉及到同位素的應用，環境危害性大大增加。此外，針對AQP-4自身抗體的檢測國內目前只少數研究者利用CBA和FIPA做了科研研究，尚未常規應用於臨床，因此何種方法作為「金標準」被推薦應用於臨床AQP-4抗體的檢測尚待闡明。
[0004]傳統檢測AQP-4的方法如間接免疫螢光法、酶聯免疫吸附法等敏感性和特異性均不高，放射免疫沉澱法涉及放射源汙染問題。因此，我們應用穩定轉染AQP-4的細胞系，採用靈敏度和特異性更高的螢光免疫細胞染色法(CBA)結合流式細胞檢測技術，用於臨床定性、定量檢測AQP-4抗體。
[0005]傳統CBA方法應用的質粒為EGFP標記的人AQP4 cDNA質粒及對照EGFP cDNA質粒，應用聚乙烯亞胺(PEI)或脂質體方法進行瞬時轉染。耗時長，人力物力損耗大，且螢光效率不穩定。因此需要更為穩定的轉染方法以獲得更敏感穩定的結果。

【發明內容】

[0006]本發明通過提供一種流式細胞術檢測水通道蛋白-4自身抗體的方法，及其融合表達病毒載體。採用靈敏度和特異性更高的螢光免疫細胞染色結合流式細胞檢測技術，用於臨床定性、定量檢測AQP-4抗體，使檢測結果更加穩定，且極大節約人力和時間成本。AQP4抗體檢測技術的平臺的建立，有利於提高視神經脊髓炎和多發性硬化的臨床診療水平。應用於NMO和MS的臨床鑑別診斷，提高NMO和MS的診斷水平；能輔助作為用藥療效、病情監測、復發預測的 指標;AQP-4檢測平臺的建立能為進一步研究AQP-4抗體的致病機制提供基礎。
[0007]因此，本發明的一個目的是一種水通道蛋白-4自身抗體融合表達病毒載體，其特徵在於所述表達病毒載體為pCDH-MCS-AQP4-EFl-copGFP，具有SEQ ID N0.2所示序列。
[0008]構建好的病毒載體的完整序列: acgcgtgtagtcttatgcaatactcttgtagtcttgcaacatggtaacgatgagttagcaacatgccttaca
aggagagaaaaagcaccgtgcatgccgattggtggaagtaaggtggtacgatcgtgccttattaggaaggcaacagacgggtctgacatggattggacgaaccactgaattgccgcattgcagagatattgtatttaagtgcctagctcgatacaataaacgggtctctctggttagaccagatctgagcctgggagctctctggctaactagggaacccactgcttaagcctcaataaagcttgccttgagtgcttcaagtagtgtgtgcccgtctgttgtgtgactctggtaactagagatccctcagacccttttagtcagtgtggaaaatctctagcagtggcgcccgaacagggacctgaaagcgaaagggaaaccagagctctctcgacgcaggactcggcttgctgaagcgcgcacggcaagaggcgaggggcggcgactggtgagtacgccaaaaattttgactagcggaggctagaaggagagagatgggtgcgagagcgtcagtattaagcgggggagaattagatcgcgatgggaaaaaattcggttaaggccagggggaaagaaaaaatataaattaaaacatatagtatgggcaagcagggagctagaacgattcgcagttaatcctggcctgttagaaacatcagaaggctgtagacaaatactgggacagctacaaccatcccttcagacaggatcagaagaacttagatcattatataatacagtagcaaccctctattgtgtgcatcaaaggatagagataaaagacaccaaggaagctttagacaagatagaggaagagcaaaacaaaagtaagaccaccgcacagcaagcggccactgatcttcagacctggaggaggagatatgagggacaattggagaagtgaattatataaatataaagtagtaaaaattgaaccattaggagtagcacccaccaaggcaaagagaagagtggtgcagagagaaaaaagagcagtggga
【權利要求】
1.一種水通道蛋白-4自身抗體融合表達病毒載體,其特徵在於所述表達病毒載體為pCDH-MCS-AQP4-EFl-copGFP 具有 SEQ ID N0.2 所示序列。
2.—種產生水通道蛋白-4自身抗體融合表達病毒載體的構建方法，其特徵在於按如下的步驟進行: I)載體構建:構建強組成型啟動子CMV介導的融合表達人AQP-4基因及螢光標記基因EGFP的慢病毒載體； 無終止密碼子的人AQP-4基因與EGFP基因用5個胺基酸組成的柔性序列(GGGGS)相連接，AQP-4-GGGGS-EGFP(如SEQ ID N0.1所示)，EGFP在整個融合蛋白的N端，以保證AQP-4蛋白的天然狀態的拓撲結構、亞細胞位置和兩個蛋白相對獨立的功能；pEGFP-ΝΙ載體上擴增EGFP序列，所用引物如下:
EGFPF: 5』- CTA GGATCC ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3』 和 EGFPR: 5』- CAG GTCGACGAATTC GCGGCCGC CTCGAG CTGCAG TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3』， 擴增片段切膠回 收後連入T載體，經測序比對序列正確後將其用BamHI和SalI雙酶切後與經同樣酶雙酶切後的pCDH-CMV-MCS-EFl-CopGFP載體片段相連接，用EGFP置換掉原載體中的EFl-copGFP序列； 以人視神經cDNA為模板，擴增AQP-4 (Ml)序列，所用引物為:
AQP4F: 5』 -ACTTCTAGAATGAGTGACAGACCCACAGCAAG-3』 和 AQP4R: 5』 -CCAAGATCTTGAACCGCCTCCACCTACTGAAGACAATACCTCTCCAGATTG-3』，擴增片段切膠回收後連入T載體，經測序比對序列正確後將其用XbaI和BglII雙酶切後與經XbaI和BamHI雙酶切後的步驟I獲得質粒載體相連接，得到慢病毒質粒載體，如SEQ ID N0.2所/Jn ο
3.—種檢測來自個體的生物樣品中是否存在水通道蛋白-4自身抗體的方法，其特徵在於按如下的步驟進行: 1)載體構建:構建強組成型啟動子CMV介導的融合表達人AQP-4基因及螢光標記基因EGFP的慢病毒載體； 無終止密碼子的人AQP-4基因與EGFP基因用5個胺基酸組成的柔性序列(GGGGS)相連接，AQP-4-GGGGS-EGFP(如SEQ ID N0.1所示)，EGFP在整個融合蛋白的N端，以保證AQP-4蛋白的天然狀態的拓撲結構、亞細胞位置和兩個蛋白相對獨立的功能；pEGFP-ΝΙ載體上擴增EGFP序列，所用引物如下:
EGFPF: 5』- CTA GGATCC ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3』 和 EGFPR: 5』- CAG GTCGACGAATTC GCGGCCGC CTCGAG CTGCAG TTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3』，擴增片段切膠回收後連入T載體，經測序比對序列正確後將其用BamHI和SalI雙酶切後與經同樣酶雙酶切後的pCDH-CMV-MCS-EF1-CopGFP載體片段相連接，用EGFP置換掉原載體中的EFl-copGFP序列；以人視神經cDNA為模板，擴增AQP-4 (Ml)序列，所用引物為:AQP4F: 5』 -ACTTCTAGAATGAGTGACAGACCCACAGCAAG-3，和 AQP4R: 5，-CCAAGATCTTGAACCGCCTCCACCTACTGAAGACAATACCTCTCCAGATTG-3』，擴增片段切膠回收後連入T載體，經測序比對序列正確後將其用XbaI和BglII雙酶切後與經XbaI和BamHI雙酶切後的步驟I獲得質粒載體相連接，得到慢病毒質粒載體(如SEQ ID N0.2所示)； 2)病毒包裝及HEK293穩定轉染細胞系的獲得:細胞系及其培養:人胚腎HEK293細胞系由本室常規培養，細胞置於含有10%滅活胎牛血清的DMEM培養基中，放入37°C，5% CO2孵箱，按常規方法培養，取處於對數生長期的細胞用於實驗； 細胞的復甦和傳代:預先向50ml離心管中加入20mL DMEM培養基，從液氮罐取出凍存的細胞迅速投入37°C水浴中並不斷搖動使其在最短時間內解凍，用70%酒精消毒凍存管外表後，將細胞存儲液轉移至上述離心管中，1000rmp離心10分鐘，棄上清，重懸細胞置於含10%胎牛血清的DMEM培養基中，37°C、5%C02、飽和溼度下培養； 待HEK293細胞長至70%密度時，撤掉舊的培養基，用PBS清洗細胞，利用CaCl2法包裝表達AQP-4-EGFP(pCDH-MCS-AQP4-EFl-copGFP)融合蛋白的慢病毒，收集病毒懸液在6 μ g/ml Polybrene存在的情況下感染HEK293細胞，I周后，分選陽性穩定轉染細胞；繼續傳代培養後進行二次篩選，獲得100%轉染過的穩定表達融合蛋白的HEK293細胞系；所述的傳代培養指的是細胞生長至對數生長期，用胰酶消化貼壁細胞2-5分鐘，後傳代至培養皿繼續培養; 3)細胞免疫螢光染色法結合流式細胞術測定血清AQP-4抗體: 獲得待檢血清後，用含1%BSA (Sigma) DMEM-Hepes洗液稀釋待測血清，收集轉染及未轉染的HEK293細胞，按I:1的比例混合，總數為5X105，用流式staining緩衝液(1XPBS含3%的馬血清及0.02%的疊氮鈉NaN3)清洗I次，離心後棄去上清，用100 μ I稀釋過的血清或人Ig對照重懸細胞，4度孵育30min,然後加入流式staining緩衝液清洗I次,離心收集細胞後加入IOOul稀釋後的Fast blue標記的山羊抗人IgG，4度避光孵育30 min，流式staining緩衝液清洗I次，然後用300ul流式staining緩衝液重懸細胞,流式細胞儀雙通道檢測螢光信號，以未轉染細胞亞群及人Ig染色組為對照，判斷AQP-4抗體陽性樣本，依據EGFP陽性細胞類群中的Fast blue信號強弱用來標示抗體濃度的相對量； 4)統計分析:使用GraphPadPrism 4軟體對數據進行繪圖及統計分析得出結果。
4.權利要求1所述水通道蛋白-4自身抗體融合表達病毒載體在製備用於提高視神經脊髓炎和多發性硬化臨床診療方面的應用。
【文檔編號】C12N15/867GK103937836SQ201410139698
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2014年4月4日 優先權日:2014年4月4日
【發明者】閆亞平, 施福東, 金薇娜, 李敏淑, 齊媛 申請人:天津醫科大學總醫院