一種針對蚊媒病毒的懸浮晶片多重非診斷性檢測方法
2023-08-02 02:03:11
專利名稱：一種針對蚊媒病毒的懸浮晶片多重非診斷性檢測方法
技術領域：
本發明提供一種針對蚊媒病毒的懸浮晶片多重非診斷性檢測方法。
背景技術：
聚合酶鏈反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)是80年代中期發展起來的體外核酸擴增技術，也是目前核酸檢測的主流技術，PCR產物的檢測判定方法為瓊脂糖凝膠電泳，而瓊脂糖凝膠僅可區分相差約IOObp的DNA片段。片段長度相差不大或者相等的PCR產物，瓊脂糖凝膠電泳將無能無力。另外，瓊脂糖凝膠電泳通過紫外光激發螢光染料產生螢光來判斷是否存在PCR產物，檢測靈敏度相對較低。且瓊脂糖凝膠電泳通過片段的大小對產物進行判斷，特異性差，對非特異擴增的大小相似的片段不能區分。而且電泳時常用的染料如溴化乙錠等具有致癌性，常接觸對身體健康不利。蚊媒病是一組以蚊蟲為媒介而傳播的疾病，包括黃熱病、登革熱、流行性乙型腦炎、西尼羅熱等，是重要的公共健康問題。隨著全球氣候逐漸上升、城市化進程的加快、旅遊和貿易的快速發展、生態環境的不斷變化，全球蚊媒傳染病發病呈上升趨勢，原有疾病的流行區域不斷擴展、疾病的流行頻度不斷增加。隨著疾病譜發生變化，相應的檢測和監測技術要及時跟進，以適應新的疾病監測需求。檢測及監測蚊蟲攜帶的病原體，在傳染病監測中屬於早期監測和發現傳染病流行的方法，對於蚊媒傳播疾病的有效預警和控制有重要的意義。以往的研究都是針對一種病原體檢測，且有些非診斷性檢測方法靈敏度不夠高，不能夠早期發現蚊媒傳染病的流行；此外，從生物學分類角度來看，蚊媒病原體涉及微生物學與寄生蟲學專業，目前蚊媒病監測也是針對單病種，不同病原體分類專業人員分別從自身專業領域進行檢測，浪費人力、財力，且各專業獨力實施，不利於高效、綜合採取防治措施。因而，對於蚊媒病的檢測應當綜合考慮。懸浮晶片(suspensionarray)也稱液相晶片(liquid array, liquid chip),是一種非常靈活的多功能技術平臺，可以進行蛋白、核酸等生物大分子檢測、受體和配體識別分析等研究。懸浮晶片主要通過可偶聯探針的螢光編碼微球與兩束雷射檢測，對被測物的定性和定量分析，一個反應孔內可以完成100種不同的生物學反應，從而實現對核酸的多重檢測。但傳統的懸浮晶片的非診斷性檢測方法耗時長，步驟繁瑣，在多重檢測中，由於多重探針的存在，雜交溫度的選擇也是一個技術開發時的瓶頸。
發明內容
針對現有技術存在的問題，本發明的目的在於提供一種檢測靈敏度高，特異性好的針對蚊媒病毒的懸浮晶片多重非診斷性檢測方法。為實現上述目的，本發明一種針對蚊媒病毒的懸浮晶片多重非診斷性檢測方法，具體為
I)根據PCR擴增區域內的核苷酸序列設計特異性檢測引物，並提交GENEBANK檢測弓丨物的特異性，合成時將上遊引物5』末端連接特異Tag，下遊引物5』末端進行生物素標記；2)PCR反應結束後將反應產物分別與相應的編碼微球雜交；
3)微球上的Anti-Tag在一定的條件下特異的捕獲PCR產物上的Tag序列；
4)加入鏈黴親和素一藻紅蛋白與微球上捕獲的PCR產物上的生物素結合，利用懸浮晶片LUMINAX系統進行檢測，通過激發微球基質上的紅色分類螢光和微球表面經特異性反應結合上的藻紅蛋白，對待檢測物進行定性和定量分析；
其中，所涉及的引物序列為
權利要求
1.一種針對蚊媒病毒的懸浮晶片多重非診斷性檢測方法，其特徵在於，該方法具體為1)根據PCR擴增區域內的核苷酸序列設計特異性檢測引物，並提交GENEBANK檢測引物的特異性，合成時將上遊引物5』末端連接特異Tag，下遊引物5』末端進行生物素標記；2)PCR反應結束後將反應產物分別與相應的編碼微球雜交；3)微球上的Anti-Tag在一定的條件下特異的捕獲PCR產物上的Tag序列；4)加入鏈黴親和素一藻紅蛋白與微球上捕獲的PCR產物上的生物素結合，利用懸浮晶片LUMINAX系統進行檢測，通過激發微球基質上的紅色分類螢光和微球表面經特異性反應結合上的藻紅蛋白，對待檢測物進行定性和定量分析；其中，所涉及的引物序列為2
2.如權利要求I所述的非診斷性檢測方法，其特徵在於，所述引物上遊引物5』端需要人工添加一段標籤並且之間用間隔序列相連，下遊引物5』端經生物素標記。
3.如權利要求I所述的非診斷性檢測方法，其特徵在於，所述雜交中同時加入微球，PCR擴增產物，SA-PE，條件為37°C進行雜交，同時此條件下可以進行鏈黴親和素一藻紅蛋白與微球上捕獲的PCR產物上的生物素結合。
4.一種改進的針對蚊媒病毒的懸浮晶片多重非診斷性檢測方法，其特徵在於，所述方法包括以下步驟I) PCR檢測弓I物標記Tag和生物素，2 ) PCR擴增待檢樣品；3 )加入相應的微球與PCR產物雜交；4)上機對雜交後的微球進行檢測；其中，根據待檢測的病毒，設計檢測所用的特異引物，上遊引物5』標記不同的Tag，引物與Tag之間連接C9或C18作為加臂，下遊引物5』進行生物素標記，以便檢測。
5.如權利要求4所述的非診斷性檢測方法，其特徵在於，所述非診斷性檢測方法涉及的引物序列為
6.如權利要求5所述的非診斷性檢測方法，其特徵在於，所述引物上遊引物5』端需要人工添加一段標籤並且之間用間隔序列相連，下遊引物5』端經生物素標記。
7.如權利要求5所述的非診斷性檢測方法，其特徵在於，所述雜交中同時加入微球，PCR擴增產物，SA-PE，條件為37°C進行雜交，同時此條件下可以進行鏈黴親和素一藻紅蛋白與微球上捕獲的PCR產物上的生物素結合。
全文摘要
本發明提供一種蚊媒病毒的懸浮晶片多重非診斷性檢測方法，還涉及對懸浮晶片非診斷性檢測方法中反應條件及步驟的改進。本方法中的晶片主要由帶有標籤微球、帶有標籤及生物素化的引物、鏈黴親和素－藻紅蛋白組成。本發明主要針對野外採集的蚊蟲綜合檢測多種攜帶的病原體,如黃病毒屬病毒、甲病毒屬病毒等。將野外採集蚊蟲樣本同批次處理後高通量檢測，經濟、高效檢測蚊傳病原體，可為衛生防病部門提供簡化的檢測、監測步驟和程序，提高效率和減少重複工作量。
文檔編號C12Q1/70GK102943128SQ201210420139
公開日2013年2月27日 申請日期2012年10月29日 優先權日2012年10月29日
發明者王靜, 王旺, 楊宇, 劉麗娟, 趙婷婷, 韓輝, 孫肖紅 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院