一種表達巢蛋白的睪丸間質幹細胞的分離、培養方法及其用途

2023-07-24 11:28:26 2

一種表達巢蛋白的睪丸間質幹細胞的分離、培養方法及其用途
【專利摘要】本發明公開了一種表達巢蛋白的睪丸間質幹細胞的分離、培養方法及其用途，本發明所述的方法包括：提供一種以C57BL/6為遺傳背景的巢蛋白-綠色螢光蛋白轉基因小鼠模型；飼養小鼠至1周齡或以上，分離睪丸，去除被膜和血管，暴露生精小管後用膠原酶IV消化，過濾消化後的細胞懸液；通過流式細胞儀進行分選，獲得單個細胞，收集表達綠色螢光蛋白的螢光強度是陰性對照細胞的螢光強度的10倍或以上的細胞，從而分離出所述表達巢蛋白的睪丸間質幹細胞。本發明提供了根據上述方法分離的睪丸間質來源幹/祖細胞，以及進一步在培養基中培養獲得的自我更新和增殖的細胞，並且提供了將這些細胞用於製備治療睪酮水平低下的相關疾病的組合物的用途。
【專利說明】一種表達巢蛋白的睪丸間質幹細胞的分離、培養方法及其 用途

【技術領域】
[0001] 本發明涉及幹細胞與組織工程【技術領域】，尤其涉及一種表達巢蛋白的睪丸間質幹 細胞的分離、培養方法及其用途。

【背景技術】
[0002] 隨著社會老齡化問題的進程，中老年健康問題得到國際廣泛關注。遲發性性腺功 能減退症（Late-onset hypogonadism. L0H)已經成為嚴重影響中老年男性健康和生活質量 的重要疾病之一。LOH的核心機制是分泌睪酮的睪丸間質細胞隨著年齡的增長，數量減少和 功能下降，導致體內的雄激素缺乏。睪酮不足最終可導致性慾、性功能的減退，還可造成疲 勞、肌肉體積減少、脂肪體積增加、骨質疏鬆、貧血等症狀，同時影響情緒與智力下降等嚴重 影響活質量和引發多器官功能損害（Int J Androl，2009. 32:1-10)。因此，睪酮水平的維持 對男性意義重大。目前，睪酮替代治療是解決睪酮缺乏的主要手段，臨床上主要使用的是外 源性睪酮製劑，按照給藥途徑可以分為口服睪酮製劑、肌注睪酮製劑、經皮膚黏膜吸收睪酮 製劑以及睪酮埋置劑。許多研究表明睪酮替代治療已取得了良好的治療效果，例如：提高性 欲、改善勃起功能、增加性滿意度。但隨後有報導顯示其治療效果會隨著時間的推移逐漸減 弱；LOH患者的腰椎骨密度增加；效果難以持久。其原因在於給藥後血清睪酮濃度存在高峰 和波谷，無法模擬機體睪酮的生理情況，也無法很好地預測個體的吸收模式。同時，外源性 睪酮能夠通過抑制下丘腦-垂體-性腺軸，繼而導致睪丸局部睪酮濃度下降，最終引起精液 質量下降，甚至導致男性不育。另外，體內雄激素水平升高可能會增加痤瘡、男性乳房發育、 前列腺癌、脂質代謝紊亂、心血管事件等。因此，中老年男性性腺功能低下患者使用雄激素 替代治療目前存在比較大的爭議。為此，研究人員一直在探索更為安全、有效、質優價廉的 LOH治療方法。
[0003] 葛仁山等人總結了成體睪丸間質細胞的發生過程，包括了四個發生階段：睪丸間 質幹細胞（stem Leydig cell, SLC)、睪丸間質祖細胞（Progenitor Leydig cell)、不成熟 睪丸間質細胞（immature Leydig cell)、成體睪丸間質細胞（Adult Leydig cell)。其中， 睪丸間質幹細胞可以在體外擴增並分化成為具有睪酮分泌能力的睪丸間質細胞。在大鼠出 生後7天，梭形的睪丸間質幹細胞主要分布在大鼠睪丸間質部分以及血管周圍。DavidofT 等認為睪丸的血管即血管平滑肌細胞及周細胞是睪丸間質細胞的前體細胞，被認為最理 想的種子細胞（Davidoff MS，Middendorff R，Enikolopov G，Riethmacher D, Holstein AF,Muller D.Progenitor cells of the testosterone-producing Leydig cells revealed. The Journal of cell biology 2004 ;167:935_944)。這一研究成果提不可以利 用少量儲存的幹細胞治療LOH患者進行治療，提高其臨床應用前景。然而，目前對睪丸間質 幹細胞的研究甚少，大多數局限在對其細胞器，組織結構和細胞分布上。對睪丸間質幹細胞 的體外分離及培養的探討，僅有應用Percoll密度梯度離心法，結合TOGFR-α陽性且LHR 陰性細胞的免疫選擇（Immunoselection)法，純化出大鼠睪丸中TOGFR-α陽性且LHR陰性 的細胞，並對其假定的睪丸間質幹細胞做了體外增殖培養、定向分化為睪酮分泌的睪丸間 質細胞。葛仁山等人將分離得到的睪丸間質幹細胞移植入睪丸間質細胞損傷大鼠模型中， 證明了睪丸間質幹細胞可以在體內定植，並分化成有功能的睪丸間質細胞。這些研究，提示 大鼠中的睪丸間質幹細胞可以在體外進行培養和擴增，但是現行方法存在獲得細胞量少， 細胞種類不明確，缺乏細胞鑑定標準等眾多弊端，明顯制約了臨床應用，需要進一步的深入 研究。
[0004] Nestin是VI型中間絲蛋白，是一種主要的細胞骨架蛋白，最早在神經上皮細胞和 神經系細胞發現（Lendahl Ul, Zimmerman LB, McKay RD. CNS stem cells express a new class of intermediate filament protein. Cell, 1990, 60:585-595) 〇 Nestin 除表達在 神經系統前體細胞外（如：胚胎發育過程中的小鼠、大鼠和人的神經系統），在發生病理損 傷時，Nestin也會出現返祖表達的現象。另外，在神經系統以外的其他組織，例如毛囊幹 細胞，骨髓間充質幹細胞等表達，提示Nestin可能為神經系統以外其它祖細胞的標誌之 一。目前研究發現，睪丸間質前體細胞具有表達Nestin的特徵（Curr Top Dev Biol. 2004; 316:369-376)。有文獻報導，血管平滑肌（VSMCs)和周細胞（PC)是Leydig細胞的前體細 胞，但對EDS處理後的體內模型研究認為，在體內具有細胞增殖、誘導睪丸間質細胞再生能 力的是Nestin表達的VSMCs和PC，這群細胞隨後轉分化，分化為具有類固醇分泌能力的睪 丸間質細胞且Nestin表達下調。因此，認為Nestin表達集中在PCs/VSMCs生成睪丸間質 細胞，並表達在再生的睪丸間質細胞中，這提示巢蛋白可能是尋找睪丸間質幹細胞的重要 標誌物（J Cell Biol, 2004, 167:935-944)。目前尚未見有關研究報導以巢蛋白為標記物分 離和鑑定睪丸間質幹細胞的研究。


【發明內容】

[0005] 本發明的目的在於克服睪丸間質幹細胞缺乏標誌物，簡化其分離及培養方法，提 供睪丸間質幹細胞的鑑定方法，以及其應用。
[0006] 本發明採用如下技術方案：
[0007] 本發明的表達巢蛋白的睪丸間質幹細胞的分離方法以C57BL/6為遺傳背景的巢 蛋白-綠色螢光蛋白轉基因小鼠模型；
[0008] 飼養所述轉基因小鼠模型的小鼠至1周齡，分離小鼠睪丸，用膠原酶IV消化，過濾 消化後的細胞懸液，濾過篩網，獲得單個細胞，所述細胞產生受巢蛋白增強子控制的增強型 綠色螢光蛋白；
[0009] 將上述單個細胞通過流式細胞儀進行分選，用C57B/6小鼠細胞做陰性對照細胞， 收集表達綠色螢光蛋白的螢光強度是陰性對照細胞的螢光強度的10倍或以上的細胞，從 而分離出所述表達巢蛋白的睪丸間質幹細胞。
[0010] 所述巢蛋白-綠色螢光蛋白轉基因小鼠模型包含以巢蛋白啟動子驅動表達增強 型綠色螢光蛋白的質粒，其中，包括上遊翻譯位點的啟動子區域長2. 5kb，包含第二個外顯 子3'到第三個內含子5'的增強子區域長1.8kb，多聚腺苷化位點與增強型綠色螢光蛋白 cDNA連接。
[0011] 本發明的分離方法的具體步驟如下：
[0012] 利用C57BL/6為遺傳背景的巢蛋白-綠色螢光蛋白轉基因小鼠模型；利用出生後 7天Nestin-GFP的雄性小鼠及7天的正常C57BL/6雄性小鼠，採用頸椎脫臼法處死，在無菌 條件下打開陰囊部，取出雙側睪丸並在解剖顯微鏡下去除被膜和血管，暴露生精小管，用含 1 %雙抗的IXPBS反覆衝洗，隨後用吸管及槍頭輕輕吹打，儘量使間質組織與曲精細管分 散開，並用小剪刀剪碎組織部分，隨後放入lmg/ml的IV型膠原酶溶液，於37°C、5% CO2條 件下孵育15min，加入大量含0. 5% BSA的I XPBS終止膠原酶的消化，1500rmp離心5min ; 棄去上清液，用孔徑為40 μ m的尼龍網過濾懸液，去除曲細精管，收集的濾液以1500rmp離 心5min後，將Nestin-GFP的陽性細胞懸液樣本和正常C57BL/6的陰性對照細胞樣本，經流 式分選收集表達綠色螢光蛋白的螢光強度是陰性對照細胞的螢光強度的10倍或以上的細 胞，從而分離出所述表達巢蛋白的睪丸間質幹細胞。
[0013] 本發明的分離方法得到的表達巢蛋白的睪丸間質幹細胞的培養方法如下：將分離 得到的表達巢蛋白的睪丸間質幹細胞在培養基中進行培養，產生自我更新和增殖的細胞， 經實驗表明，單純在DMEM/F12基礎培養基培養分離的巢蛋白陽性睪丸間質幹細胞不增殖， 容易分化，在第四代細胞即不能傳代。因此，本發明在DMEM/F12基礎培養基的基礎上進行 改良，優選的培養基為無血清培養基，其成分包括：DMEM-F12培養基中加入InM地塞米松、 lng/ml LIF, 5mg/liter insulin, 5mg/litertransferrin, 5ug/liter sodium selenite 的 ITS、5%雞胚提取物、0· ΙπιΜβ-巰基乙醇、1%非必需胺基酸、1% N2、2% B27 (Gibco)、20ng/ ml bFGF、20ng/ml EGF、20ng/ml PDGFBB、20ng/ml 0SM。實驗表明，將該培養用於本發明所 述的睪丸間質幹細胞的培養，細胞增殖效果非常好。3天進行一次傳代。
[0014] 本發明對分離得到的巢蛋白陽性細胞進行睪丸間質幹細胞系及幹細胞相關蛋白 表達的檢測，從分子水平分析巢蛋白陽性細胞的細胞乾性的分子生物學特點，進一步提供 該細胞的克隆形成能力、自我跟新、多向分化能力，從而對該種幹細胞進行鑑定。結果表明， 巢蛋白陽性睪丸間質幹細胞呈球狀克隆生長，並有較強的GFP螢光。培養的巢蛋白陽性 睪丸間質幹細胞表達 Nestin，PDGFR-a，LIFR，PH3, SSEA-I，SSEA-4, GATA-4,但是不表達 3 β-HSD，LHR等。該細胞具有克隆形成能力，CCK8試劑盒檢測發現該細胞具有增殖能力。 分化實驗結果表明，巢蛋白陽性睪丸間質幹細胞可分化為神經細胞（神經元和膠質細胞）、 脂肪細胞、成骨細胞、軟骨細胞。在睪丸間質細胞誘導分化條件下，可分化為睪丸間質細胞， 並分泌睪酮。
[0015] 考慮到本發明所述的分離的巢蛋白陽性睪丸間質幹細胞在體內的分化作用，將所 述細胞移植到去除睪丸間質細胞的大鼠動物模型（應用大鼠睪丸間質細胞的特異性凋亡 誘導劑二甲磺酸乙烷（EDS)，成功建立了睪丸間質細胞凋亡模型）和老年小鼠模型，評價該 細胞在睪丸微環境中的分化能力及作用。結果發現，該細胞移植後可以在大鼠及老年小鼠 睪丸內定植、分化為睪丸間質細胞、促進睪酮的分泌，同時促進精子的發生過程。因此本發 明的方法得到的睪丸間質幹細胞可以用於製備治療睪酮水平低下相關疾病的藥物。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016] 圖1是Nestin-GFP轉基因小鼠睪丸組織中獲取巢蛋白陽性細胞的流式分選培養 圖：
[0017] Nes-GFP轉基因小鼠的睪丸產後（A) 7天，（B) 14天和（C) 28天，（D)不同年齡段小 鼠睪丸中巢蛋白陽性睪丸間質幹細胞的陽性率。
[0018] 圖2是培養的巢蛋白陽性睪丸間質幹細胞基因表達圖。
[0019] 圖3是培養的巢蛋白陽性睪丸間質幹細胞從單個細胞增長到克隆球的白光和熒 光觀察圖。
[0020] 圖4是培養的巢蛋白陽性睪丸間質幹細胞增殖曲線圖。
[0021] 圖5是巢蛋白陽性睪丸間質幹細胞分化後RT-PCR圖。
[0022] 圖6是巢蛋白陽性睪丸間質幹細胞分化後免疫螢光染色檢測睪丸間質細胞相關 蛋白表達圖。
[0023] 圖7是巢蛋白陽性睪丸間質幹細胞分化後分泌睪酮圖。
[0024] 圖8是巢蛋白陽性睪丸間質幹細胞移植到EDS模型大鼠，注射了巢蛋白陽性睪丸 間質幹細胞的大鼠睪酮水平的示意圖。
[0025] 圖9是巢蛋白陽性睪丸間質幹細胞的體內分化圖。
[0026] 圖10是巢蛋白陽性睪丸間質幹細胞移植入22個月大的小鼠睪丸後，注射了巢蛋 白陽性睪丸間質幹細胞的22月齡小鼠睪酮水平示意圖。
[0027] 圖11是巢蛋白陽性睪丸間質幹細胞移植入10天後促進精子生產圖。

【具體實施方式】
[0028] 下面的實施例是對本發明的進一步詳細描述。
[0029] 實施例一：小鼠成體巢蛋白陽性睪丸間質細胞的分離
[0030] 本實施例從小鼠成體睪丸中分離獲得表達巢蛋白（Nestin)的睪丸間質幹細胞。
[0031] 選擇巢蛋白-GFP小鼠：本實驗的轉基因小鼠是來自於日本京都大學醫學院 生理學教研室構建的特異性標記巢蛋白-綠色螢光蛋白（Nestin-GFP)轉基因小鼠 模型(Yamaguchi M, Saito H, Suzuki M, Mori K. Visualization of neurogenesis in the central nervous system using nestin promoter-GFP transgenic mice. Neuror印ort2000. 11:1991-1996)。但也可選用其他巢蛋白-GFP小鼠，它們的共同特徵是： 包含以Nestin啟動子驅動表達GFP的質粒,包括上遊的翻譯位點的啟動子區域長2. 5kb,包 含第二個外顯子3'到第三個內含子5'的增強子區域長1.8kb，多聚腺苷化位點與增強型 GFP (EGFP) cDNA 連接。
[0032] 本發明利用該動物模型的研究發現，不同年齡小鼠睪丸中存在巢蛋白陽性細胞 (即表達受巢蛋白增強子控制的綠色螢光蛋白），主要分布在睪丸間質部分。本發明進一步 利用流式分選技術，成功分離得到巢蛋白陽性睪丸間質細胞。
[0033] 分離方法具體如下：
[0034] a.取出生後7天生殖系統發育健全的Nes-GFP的雄性小鼠及相同天數的正常 C57BL/6雄性小鼠，採用頸椎脫臼法處死，在無菌條件下打開陰囊部，取出雙側睪丸並在解 剖顯微鏡下去除被膜和血管，暴露生精小管，用含1 %雙抗的IXPBS反覆衝洗。隨後用吸管 及槍頭輕輕吹打，儘量使間質組織與曲精細管分散開，並用小剪刀剪碎組織部分。隨後放入 lmg/ml含少量DNase酶的IV型膠原酶溶液，於37°C、5% C02條件下孵育10?20min，加 入大量含〇. 5% BSA的IXPBS終止膠原酶的消化，1500rmp離心5min ;棄去上清液，用孔徑 為40 μ m的尼龍網過濾懸液，去除未消化的曲細精管，收集的濾液以1500rmp離心5min後， 將Nes-GFP的陽性細胞懸液樣本和正常C57BL/6的陰性對照細胞樣本，分別將細胞用流式 緩衝液重懸至已標記好的流式上樣管中。
[0035] b.使用流式細胞儀（BD influx cell sorter)先對正常的C57BL/6的陰性對照組 細胞懸液進行流式上樣，選出陰性螢光信號區域作為陰性對照。隨後對Nestin-GFP的陽性 細胞懸液進行流式上樣，分選純化出睪丸中GFP表達的陽性細胞，用培養基對分選出的細 胞進行收集。
[0036] 圖1是出生7天、14天、28天的巢蛋白-GFP小鼠睪丸中巢蛋白陽性睪丸間質幹細 胞細胞流式分選圖。如圖1所示，用C57B/6小鼠細胞做陰性對照細胞，巢蛋白-GFP小鼠 睪丸間質細胞螢光強度是對照的10倍或以上時收集細胞，為巢蛋白陽性睪丸間質幹細胞， 從圖中可以看出陽性率最高的為7天的老鼠62. 4%，並可以看出隨著年齡增長陽性率呈下 降趨勢，根據這一結果，為了獲取更多的陽性細胞，我們就可以選擇7天小鼠為主要實驗對 象。
[0037] 實施例二：巢蛋白陽性睪丸間質幹細胞自我更新和增殖能力的鑑定
[0038] 本實施例是在實施例一的基礎上，對所獲得的巢蛋白陽性睪丸間質幹細胞自我更 新和增殖能力進行鑑定。
[0039] a.巢蛋白陽性睪丸間質幹細胞自我更新能力的鑑定：
[0040] 將從小鼠成體睪丸中分選獲得的單個巢蛋白陽性細胞分別置於6孔板的各個單 孔中進行培養。培養液成分包括DMEM-F12培養基中加入InM地塞米松、lng/ml LIF，5mg/ liter insulin, 5mg/litertransferrin, 5ug/liter sodium selenite 的 ITS、5%雞胚提取 物、0· ΙπιΜβ -巰基乙醇、1%非必需胺基酸、1% N2、2% B27(Gibco)、20ng/ml bFGF、20ng/ml EGF、20ng/ml roGFBB、20ng/ml OSM。上述培養基中，分選的原代細胞貼壁生長。7天後傳 代，形成球樣生長。觀察細胞克隆的形成情況，當細胞克隆大小達到50 μ m以上、密度達到 70%，用37°C的0. 05%胰蛋白酶-EDTA對細胞消化30秒，進行傳代。
[0041] 應用免疫螢光染色的方法進行包括H)GFR-a、LIFR、胚胎幹細胞標誌物，例 如SSEA-1、SSEA-4,睪丸間質細胞標誌物LHR和3 β -HSD，GATA4以及細胞增殖相關標誌 物？113的染色，細胞切片用4%多聚甲醛固2〇1^11，？85緩衝液中浸洗51^11\3次，0.2% Triton-X-IOO穿透30分鐘，正常山羊血清室溫孵育20分鐘，加一抗，溼化盒中4°C過夜，力口 二抗，室溫孵育1小時，螢光顯微鏡觀察結果。
[0042] 圖2顯示了巢蛋白陽性睪丸間質幹細胞球的巢蛋白與上述幹細胞增殖重新編 程有關的標誌物的免疫螢光共染色結果。結果表明，巢蛋白陽性睪丸間質幹細胞球表達 PDGFR- a、LIFR、SSEA1、SSEA4、GATA4、PH3 等，但不表達 LHR、3 β -HSD。
[0043] b.巢蛋白陽性睪丸間質幹細胞增殖能力的鑑定：
[0044] 為了演示巢蛋白陽性睪丸間質幹細胞的自我更新能力，我們從P7代巢蛋白陽性 睪丸間質幹細胞消化得到單細胞，進行單細胞球體形成試驗（圖3)。圖3表明單細胞培養 10天後可形成克隆。圖4表明單細胞的播種顯示了 CCK-8細胞增殖活性檢測結果。結果表 明，巢蛋白陽性睪丸間質幹細胞具有較強的細胞增殖能力。
[0045] c.巢蛋白陽性睪丸間質幹細胞分化能力的鑑定：
[0046] 為了演示巢蛋白陽性睪丸間質幹細胞的分化能力，利用常規神經分化，成骨，成 月旨，成軟骨培養液中進行分化。分化7天後發現，巢蛋白陽性睪丸間質幹細胞具有向神經元 及星形膠質細胞的分化能力。21天後，可向成骨細胞，脂肪細胞，軟骨細胞分化。在特定睪 丸間質細胞分化培養液（DMEM-F12培養基中加入2%FCS，10ng/ml PDGF-BB，lnM T3，lng/ml LH，70ng/ml IGF-I，IOng PDGF-BB以及ITS)中分化7天。如圖5和圖6所示：巢蛋白陽 性睪丸間質幹細胞可向成熟睪丸間質細胞分化。通過RT-PCR分析，分化的細胞表達StAR， 3 β-HSD，LHR。如圖7所示，睪酮ELISA檢測結果發現，隨著分化時間的增加，睪酮分泌增 商。
[0047] 實施例三：觀察巢蛋白陽性睪丸間質幹細胞在體內組織修復中作用
[0048] a.大鼠EDS模型的建立：
[0049] 幹細胞對體內受損組織的再生能力是一個重要的特徵。因此，我們調查巢蛋白陽 性睪丸間質幹細胞是否能在睪丸間質細胞缺失的大鼠模型中促進睪丸間質的功能恢復。先 前的研究表明the cytotoxin ethane dimethanesulfonate(EDS)經過4天的處理可能耗 盡睪丸間質細胞。我們選擇三組成年大鼠，分別為正常組、模型組、細胞組。模型組和細胞 組的大鼠接種EDS，4天後PKH26-標記的IxlO 6巢蛋白陽性睪丸間質幹細胞被注入到睪丸 實質中。移植第10天時測量血清中睪酮濃度。圖8顯示，巢蛋白陽性睪丸間質幹細胞移植 促進血清睪酮增加，明顯高於對照老年鼠。
[0050] b.老年鼠模型的建立
[0051] 在雄性老鼠，血清睪酮水平隨著年齡的老化而下降。為了測試巢蛋白陽性睪丸間 質幹細胞是否能夠在衰老模型中恢復睪酮的生產，我們注入PKH26-標記的IxlO 6巢蛋白陽 性睪丸間質幹細胞到22個月的老年鼠的睪丸，並以3個月齡小鼠和沒有注入細胞的22個 月老年小鼠為對照。分別於10天時測量血清中睪酮濃度，同時分別相應時間段小鼠的睪 丸，進行冰凍切片，觀察其組織損傷修復情況。圖9顯示通過免疫螢光染色檢測PKH26陽性 細胞與P450scc、LHR共定位情況。以3個月齡年輕小鼠為對照，免疫螢光染色顯示老年小 鼠中P45〇 SCC或LHR陽性細胞的明顯減少。相反，將巢蛋白陽性睪丸間質幹細胞移植到22 個月老年小鼠的睪丸間質10天後，P45〇 SCC、LHR的表達水平增高。圖10顯示巢蛋白陽性 睪丸間質幹細胞注入老年小鼠睪丸後，促進血清睪酮增加，明顯高於對照老年小鼠。
[0052] c.蘇木精-尹紅（HE)染色
[0053] 方法同常規石蠟切片蘇木精-尹紅（HE)染色。觀察精子細胞。如圖11所示，處 理EDS的大鼠及老年小鼠發育過程中的精子細胞明顯減少，而巢蛋白陽性睪丸間質幹細胞 移植顯著促進了精子的發育過程。
[0054] 儘管已經示出和描述了本發明的實施例，對於本領域的普通技術人員而言，可以 理解在不脫離本發明的原理和精神的情況下可以對這些實施例進行多種變化、修改、替換 和變型，本發明的範圍由所附權利要求及其等同物限定。
【權利要求】
1. 一種表達巢蛋白的睪丸間質幹細胞的分離方法，其特徵在於：以C57BL/6為遺傳背 景的巢蛋白-綠色螢光蛋白轉基因小鼠模型； 飼養所述轉基因小鼠模型的小鼠至1周齡，分離小鼠睪丸，用膠原酶IV消化，過濾消化 後的細胞懸液，濾過篩網，獲得單個細胞，所述細胞產生受巢蛋白增強子控制的增強型綠色 突光蛋白； 將上述單個細胞通過流式細胞儀進行分選，用C57B/6小鼠細胞做陰性對照細胞，收集 表達綠色螢光蛋白的螢光強度是陰性對照細胞的螢光強度的10倍或以上的細胞，從而分 離出所述表達巢蛋白的睪丸間質幹細胞。
2. 如權利要求1所述的表達巢蛋白的睪丸間質幹細胞的分離方法，其特徵在於：所述 巢蛋白-綠色螢光蛋白轉基因小鼠模型包含以巢蛋白啟動子驅動表達增強型綠色螢光蛋 白的質粒，其中，包括上遊翻譯位點的啟動子區域長2. 5kb，包含第二個外顯子3'到第三個 內含子5'的增強子區域長I. 8kb，多聚腺苷化位點與增強型綠色螢光蛋白cDNA連接。
3. 如權利要求1或2所述的表達巢蛋白的睪丸間質幹細胞的分離方法，其特徵在於： 所述的分離方法的具體步驟如下： 利用C57BL/6為遺傳背景的巢蛋白-綠色螢光蛋白轉基因小鼠模型；利用出生後7天 Nestin-GFP的雄性小鼠及7天的正常C57BL/6雄性小鼠，採用頸椎脫臼法處死，在無菌條 件下打開陰囊部，取出雙側睪丸並在解剖顯微鏡下去除被膜和血管，暴露生精小管，用含 1 %雙抗的IXPBS反覆衝洗，隨後用吸管及槍頭輕輕吹打，儘量使間質組織與曲精細管分 散開，並用小剪刀剪碎組織部分，隨後放入lmg/ml的IV型膠原酶溶液，於37°C、5% CO2條 件下孵育15min，加入大量含0. 5% BSA的I XPBS終止膠原酶的消化，1500rmp離心5min ; 棄去上清液，用孔徑為40 μ m的尼龍網過濾懸液，去除曲細精管，收集的濾液以1500rmp離 心5min後，將Nestin-GFP的陽性細胞懸液樣本和正常C57BL/6的陰性對照細胞樣本，經流 式分選收集表達綠色螢光蛋白的螢光強度是陰性對照細胞的螢光強度的10倍或以上的細 胞，從而分離出所述表達巢蛋白的睪丸間質幹細胞。
4. 一種培養如權利要求1-3任一項所述的方法得到的表達巢蛋白的睪丸間質幹細胞 的方法，其特徵在於：將分離得到的表達巢蛋白的睪丸間質幹細胞在培養基中進行培養，產 生自我更新和增殖的細胞，所述的培養基為無血清培養基，其成分包括：DMEM-F12培養基 中力口入 InM地塞米松、lng/ml LIF, 5mg/liter insulin, 5mg/litertransferrin, 5ug/liter sodium selenite的ITS、5%雞胚提取物、0. ΙπιΜβ-巰基乙醇、1%非必需胺基酸、1% N2、 2% Β27(Gibco)、20ng/ml bFGF、20ng/ml EGF、20ng/ml PDGFBB、20ng/ml 0SM。
5. -種如權利要求1-4任一項所述的方法得到的表達巢蛋白的睪丸間質幹細胞用於 製備治療睪酮水平低下導致相關疾病的藥物的用途。
【文檔編號】A61P5/26GK104212767SQ201410469362
【公開日】2014年12月17日 申請日期:2014年9月15日 優先權日:2014年9月15日
【發明者】項鵬, 姜美花, 蔡炳, 臧志軍, 汪建成 申請人:中山大學