一種檢測山羊stat3基因單核苷酸多態性的方法及其應用的製作方法
2023-07-11 02:59:21 1
一種檢測山羊stat3基因單核苷酸多態性的方法及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種檢測山羊STAT3基因單核苷酸多態性的方法及應用，以包含STAT3基因的待測山羊全基因組DNA為模板，以引物對P1、P2或P3為引物，PCR擴增山羊STAT3基因；用限制性內切酶DdeI消化PCR擴增產物之後，再對酶切後的擴增片段進行瓊脂糖凝膠電泳；根據瓊脂糖凝膠電泳結果鑑定山羊STAT3基因第45204位、第62058位或第62230位的單核苷酸多態性。3個位點能夠作為提高西農薩能奶山羊體高的分子標記，1個位點作為提高海南黑山羊管圍的分子標記，1個作為提高海南黑山羊體長指數的標記，這些有利於中國地方山羊生長性狀的標記輔助選擇（MAS），有利於快速建立遺傳資源優良的山羊種群。
【專利說明】—種檢測山羊STAT3基因單核苷酸多態性的方法及其應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於現代生物技術與家畜育種領域，涉及基因單核苷酸多態性(SNP)的檢測，特別涉及一種檢測山羊STAT3基因單核苷酸多態性的方法及應用。
【背景技術】
[0002]基因多態性(polymorphism)是指不同物種或者同一物種內的不同個體間基因組序列的差異，這些差異是由於染色體中DNA等位基因中核苷酸改變引起，主要包括鹼基的替換、插入、缺失以及重複序列拷貝數的變化。在生物醫學和動物生產實踐中，基因多態性的檢測及其應用具有重要意義。例如:研究人類某些重要功能基因多態性與疾病的易感性的關聯，可闡明人體對疾病、毒物和應激的易感性，為臨床醫學、遺傳病學、預防醫學的發展開拓了新的研究領域；研究動物某些基因多態並分析它們與生長發育、泌乳等生產性能的關係，將有利於標記輔助選擇(MAS)技術為基礎的分子育種。目前，基因多態性的主要形式是單核核苷酸多態性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP)。
[0003]SNP是由美國麻省理工學院人類基因組研究中心學者Lander (1996)提出的一類遺傳標記系統，是指基因組DNA序列中由於單個核苷酸(A/T/C/G)的替換而引起的多態性。因此，通常所說的SNPs包括鹼基的替換、插入、缺失以及重複序列拷貝數的變化。一個SNP表示在基因組某個位點上有一個核苷酸的變化，主要由單個鹼基的轉換或者顛換所引起；具有轉換型變異的SNPs約佔2/3，其他幾種SNP在相似的水平上。CpG 二核苷酸的胞嘧啶是基因組中最易發生突變的位點，其中大多數是甲基化的，可自發地脫去氨基而形成胸腺嘧啶。 [0004]在任何已知或未知的基因內或附近都可能找到數量不等的SNPs，根據它們在基因組中分布的位置可分為基因編碼區SNPs (Coding-region SNPs, cSNPs)、基因周邊SNPs (Perigenic SNPs, pSNPs)和基因間 SNPs (Intergenic SNPs, iSNPs)等三類。研究表明，位於編碼區內的cSNPs比較少，因為在外顯子內的變異率僅佔周圍序列的1/5，但它在遺傳病和育種的研究中卻具重要意義，因此倍受關注。近年來，研究人員對基因內含子SNP及其功能的關注度逐漸升高。由於內含子屬於非編碼序列，曾一度被認為「它的存在沒有意義」，但隨著功能基因組研究的深入，越來越多的研究發現，內含子並不是基因組的「垃圾」，而是在基因表達調控中具有重要的生物學功能。近年來，若干研究發現，內含子突變能夠引起某些基因功能的重大改變，從而在動物生產實踐中具有重要應用和推廣價值，其中最著名的例子是「豬IGF2基因內含子突變」。胰島素樣生長因子2 (Insulin-like growthfactor2, IGF2)基因是歐洲科學家歷時10年鑑定的一個影響家豬數量性狀的呈印跡遺傳的主效基因，位於該基因第3內含子3072位核苷酸的G/A替換，改變了順式作用元件與阻抑蛋白的結合，提高了 30%IGF2在肌肉中的表達量，從而增加了肌肉產量，降低了背部脂肪沉積。IGF2基因第3內含子的G3072A突變對生長肥育性狀的重要影響，在專門化父系的選育中具有重大應用價值。
[0005]此外，在原核生物基因中，不存在內含子或著含有少量的內含子，而在真核生物基因中內含子的存在是普遍現象，而且內含子的長度遠遠大於外顯子的長度，甚至在人類基因組中非編碼序列佔到95%~97%。由此可見，隨著生物進化程度越高，其內含子所含比例也越高，這也進一步說明內含子是具有生物學功能的。從生物進化角度講，內含子也必定在生命活動中執行著某種功能。因此，目前關於內含子的研究會越來越多，關於內含子多態性及其應用功能正成為當前研究的熱點。
[0006]由於SNPs是二等位基因分子標記，所以，理論上在一個二倍體生物群體中，SNPs可能是由2個、3個或4個等位基因構成，但實際上3個或4個等位基因的SNPs很罕見，故SNPs通常被簡單地稱為二等位基因分子標記。目前，主要採用幾種不同的路線來發現SNPs:即DNA序列測定方法、PCR-SSCP與DNA測序結合法、AS-PCR方法、引物延伸法和寡核苷酸連接反應等。在這些SNP檢測技術中，DNA序列測定法是最為準確的SNP檢測方法，但是，其檢測費用極其昂貴，且需要有DNA測序儀等大型儀器，同時，在測序過程中需要非常熟練的技術人員和經驗，所以，DNA序列測定法不是一種應用於生產實際的理想SNP檢測方法；當然，利用PCR-SSCP與DNA測序結合法檢測SNP可以適當降低檢測費用，但是，PCR-SSCP的實驗過程比較長，操作比較繁瑣，且實驗過程中存在假陽性問題，所以，也並非理想的SNP檢測手段;AS-PCR方法作為一種新型的SNP檢測方法，在未來的應用領域中具有非常廣闊的前景，但是，該方法需要設計特別的引物，且只能針對特定的基因位點，同時，檢測過程中還存在誤檢的概率，因此，目前不具有普遍應用的特點；而引物延伸法和寡核苷酸連接反應技術檢測SNP位點，需要平板讀數儀、基因晶片、微球陣列技術和質譜儀等檢測平臺，對於一般的分子實驗室來說可實施性不強。
[0007]在這種情況下，PCR-RFLP就成為檢測SNP的理想技術，在發現SNP位點後使用限制性內切酶進行切割，然後進行瓊脂糖、聚丙烯凝膠電泳分析，就能準確地鑑別SNP位點。PCR-RFLP方法不僅具有DNA測序法的準確性，又克服了費用昂貴、繁瑣操作、假陽性的缺點，而且對所檢測的序列位點無特殊性要求。
[0008]分子育種，即分子標記輔助育種(MolecularMark-Assist Selection, MAS),該技術是藉助DNA分子標記對遺傳資源`或育種材料進行選擇，對畜禽的綜合性狀進行品種改良，它是利用現代分子生物學和傳統遺傳育種相結合的方法，進行新品種選育。在羊育種中，人們期望通過對生長性狀密切相關，並且與數量性狀緊密連鎖的DNA標記的選擇，達到早期選種和提高育種值準確性的目的，從而在實際育種中獲得更大的遺傳進展。
[0009]為此，藉助分子遺傳標記輔助選擇，即將現代生物技術與常規選擇方法相結合，通過對遺傳標記的選擇來間接選擇控制某性狀的數量性狀位點(QTL)，使之能夠同時利用標記位點信息和數量性狀的表型信息，更準確估計動物個體的育種值，提高選擇效率，將加快育種進展。標記輔助選擇主要經歷了三個階段:第一階段是家畜各性狀之間的遺傳分析；第二階段是蛋白質(酶)標記對數量性狀的標記階段；第三個階段是分子遺傳標記階段。隨著分子標記技術日漸成熟與豐富，使覆蓋整個基因組的標記成為可能，通過與QTL間的連鎖分析，實現分子標記輔助選擇的目標。SNP作為新的遺傳標記已廣泛應用於基因定位、克隆、遺傳育種及多樣性的研究。
[0010]信號轉導及轉錄活化因子(signaltransducers and activators oftranscription; STAT)是一類脫氧核糖核酸(DNA)結合蛋白，由750~850個胺基酸組成，分子量為 84 ~113kDa (8.4X IO4 ~11.3 X IO4U)。作為 JAK (Janus Kinase)-STAT 途徑中JAKs的重要底物，STATs在細胞因子(cytokine;CK)的信號轉導中起著關鍵性的作用。截止目前，發現STATs由STAT3和其他6種STATs蛋白組成(如:STATl、STAT2、STAT4、STAT5a、STAT5b 和 STAT6)。
[0011]STAT3是在1994年作為白細胞介素_6信號傳遞中的急性期反應因子(acute-phaseresponse factor;APRF)被純化的。STAT3廣泛表達於不同類型的細胞和組織中，對STAT3缺陷小鼠的研究顯示STAT3在早期胚胎發育和骨髓細胞的分化中發揮著不可或缺的重要作用。此外，STAT3還參與了細胞生長、分化、增生、惡性轉化及凋亡抑制等生理功能的調控。組織特異性的基因敲除結果表明，STAT3對於上皮細胞的凋亡，哺乳後期乳腺的發育、皮膚重建、角質細胞遷移、巨噬細胞失活與Th細胞反應中的炎性因子下調等都具有重要的調控作用。總之，STAT3在胚胎早期發育、細胞分化、哺乳後期乳腺的發育等方面具有很重要的作用，因此，研究中國地方羊STAT3基因的遺傳變異和分子遺傳特徵具有重要的理論和實踐意義。然而，目前對於STAT3基因的研究多集中在小鼠和人類上，並主要對其功能進行了大量研究。對中國地方山羊STAT3基因遺傳變異領域的研究匱乏該基因位點的功能研究更是空白。
【發明內容】
[0012]本發明解決的問題在於利用Ddel、RsaI和TaqI Forced-PCR-RFLP方法檢測山羊STAT3基因的多態性，並將其與生長性狀進行關聯分析，驗證其是否可以作為山羊分子育種中輔助選擇的分子標記，從而加快良種選育速度。
[0013]本發明是通過以下技術方案來實現:
[0014]一種檢測山羊STAT3基因單核苷酸多態性的方法，以包含STAT3基因的待測山羊全基因組DNA為模板，以引物對PI為引物，PCR擴增山羊STAT3基因；用限制性內切酶Dde I消化PCR擴增產物之後，再對酶切後的擴增片段進行瓊脂糖凝膠電泳；根據瓊脂糖凝膠電泳結果鑑定山羊STAT3基因第45204位的單核苷酸多態性；
`[0015]以引物對P2為引物，用限制性內切酶RsaI消化PCR擴增產物之後，再對酶切後的擴增片段進行瓊脂糖凝膠電泳；根據瓊脂糖凝膠電泳結果鑑定山羊STAT3基因第62058位的單核苷酸多態性；
[0016]以引物對P3為引物，用限制性內切酶TaqI消化PCR擴增產物之後，再對酶切後的擴增片段進行瓊脂糖凝膠電泳；根據瓊脂糖凝膠電泳結果鑑定山羊STAT3基因第62230位的單核苷酸多態性；
[0017]所述的引物對Pl為:
[0018]上遊引物:tgtgtgagtgtgtaggtttc agaat ；
[0019]下遊引物:agataggtta ttaattaatc aactga ；
[0020]所述的引物對P2為
[0021]上遊引物:aaatccagcc tgagggagaa ttcct ；
[0022]下遊引物:gagtctcttt gaaagtccac tttgta ；
[0023]所述的引物對P3為:
[0024]上遊引物:tgggaaagatacttgctg ；
[0025]下遊引物:gacctgaatc acaggaggaa aagatc。[0026]所述的PCR擴增反應程序為:
[0027]94.(TC，預變性 5min ；94.0°C，變性 30s ；50.8°C復性 30s ；72.(TC延伸 60s，35個循環之後72.(TC延伸10min，4.(TC保存擴增產物。
[0028]所述的瓊脂糖凝膠電泳為質量濃度3%瓊脂糖凝膠電泳。
[0029]根據瓊脂糖凝膠電泳結果鑑定山羊STAT3基因第45204nt的單核苷酸多態性為:CC基因型表現為264bp和26bp兩條條帶；CT基因型表現為290bp、264bp和26bp三條條帶；TT基因型表現為290bp —條條帶；
[0030]根據瓊脂糖凝膠電泳結果鑑定山羊STAT3基因第62058nt的單核苷酸多態性為:GG基因型表現為222bp、97bp和25bp三條條帶；AG基因型表現為222bp、122bp、97bp和25bp四條條帶；AA基因型表現為222bp和122bp兩條條帶；
[0031]根據瓊脂糖凝膠電泳結果鑑定山羊STAT3基因第62230nt的單核苷酸多態性為:CC基因型表現為233bp、126bp和27bp三條條帶；CT基因型表現為260bp、233bp、126bp和27bp四條條帶；TT基因型表現為260bp和126bp兩條條帶。
[0032]山羊STAT3基因的45204位的CC基因型、62058位的AA基因型、62230位的TT基因型作為西農薩能奶山羊的DNA標記在輔助選擇育種中的應用。
[0033]所述的DNA標記是作為提高西農薩能奶山羊的體高的分子標記。
[0034]山羊STAT3基因的45204位的CC和CT基因型、62058位的AA和GG基因型，作為海南黑山羊的DNA標記在輔助選擇育種中的應用。
[0035]所述的45204位的CC和CT基因型DNA標記是作為提高海南黑山羊的管圍的分子
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[0036]所述的62058位的AA和GG基因型DNA標記是作為提高海南黑山羊的體長指數的分子標記。
[0037]與現有技術比較，本發明具有以下有益的技術效果:
[0038]本發明根據STAT3基因的序列設計引物，分別以2種山羊品種的基因組DNA為模板，進行PCR擴增，並對PCR產物進行測序，測序後獲得山羊的STAT3基因的部分序列。
[0039]針對STAT3基因第45204,62058及62230位的SNP多態性，本發明還公開了其篩查和檢測方法，通過特定引物經PCR擴增含特定限制性內切酶位點的片段再酶切鑑定，能夠簡單、快速、低成本、精確的檢測其單核苷酸的多態性。
[0040]本發明對2個山羊品種的SNPs基因型進行了檢測和基因頻率分析，對上述SNPs位點與山羊部分生長性狀(如體高、管圍和體長指數)進行關聯分析，結果表明，3個SNP位點能夠作為提高西農薩能奶山羊體高的分子標記，I個位點可以作為提高海南黑山羊管圍的分子標記，I個可以作為提高海南黑山羊體長指數的標記，這些有利於中國地方山羊生長性狀的標記輔助選擇(MAS)，有利於快速建立遺傳資源優良的山羊種群。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0041]圖1為山羊STAT3基因擴增包含第45204位多態位點的PCR產物電泳結果；
[0042]圖2為山羊STAT3基因第45204位SNP的測序圖。帶框的字母g表示該位點發生突變:AC_000176:g.45204C>T。
[0043]圖3為山羊STAT3基因包含第45204位的多態位點的290bp PCR產物的DdeI酶切電泳結果；
[0044]圖4為山羊STAT3基因擴增包含第62058位多態位點的PCR產物電泳結果；
[0045]圖5為山羊STAT3基因第62058位SNP的測序圖。帶框的字母
【權利要求】
1.一種檢測山羊STAT3基因單核苷酸多態性的方法，其特徵在於，以包含STAT3基因的待測山羊全基因組DNA為模板，以引物對PI為引物，PCR擴增山羊STAT3基因；用限制性內切酶DdeI消化PCR擴增產物之後，再對酶切後的擴增片段進行瓊脂糖凝膠電泳；根據瓊脂糖凝膠電泳結果鑑定山羊STAT3基因第45204位的單核苷酸多態性； 以引物對P2為引物，用限制性內切酶RsaI消化PCR擴增產物之後，再對酶切後的擴增片段進行瓊脂糖凝膠電泳；根據瓊脂糖凝膠電泳結果鑑定山羊STAT3基因第62058位的單核苷酸多態性； 以引物對P3為引物，用限制性內切酶TaqI消化PCR擴增產物之後，再對酶切後的擴增片段進行瓊脂糖凝膠電泳；根據瓊脂糖凝膠電泳結果鑑定山羊STAT3基因第62230位的單核苷酸多態性； 所述的引物對Pl為: 上遊引物:tgtgtgagtg tgtaggtttc agaat ； 下遊引物:agataggtta ttaattaatc aactga ； 所述的引物對P2為 上遊引物:aaatccagcc tgagggagaa ttcct ； 下遊引物:gagtctcttt gaaagtccac tttgta ； 所述的引物對P3為: 上遊引物:tgggaaagat `acttgctg ； 下遊引物:gacctgaatc acaggaggaa aagatc。
2.如權利要求1所述的檢測山羊STAT3基因單核苷酸多態性的方法，其特徵在於，所述的PCR擴增反應程序為:
94.(TC，預變性 5min ；94.0°C，變性 30s ；50.8°C復性 30s ；72.(TC延伸 60s，35 個循環之後72.(TC延伸10min，4.(TC保存擴增產物。
3.如權利要求1所述的檢測山羊STAT3基因單核苷酸多態性的方法，其特徵在於，所述的瓊脂糖凝膠電泳為質量濃度3%瓊脂糖凝膠電泳。
4.如權利要求1所述的檢測山羊STAT3基因單核苷酸多態性的方法，其特徵在於，根據瓊脂糖凝膠電泳結果鑑定山羊STAT3基因第45204nt的單核苷酸多態性為:CC基因型表現為264bp和26bp兩條條帶；CT基因型表現為290bp、264bp和26bp三條條帶；TT基因型表現為290bp —條條帶； 根據瓊脂糖凝膠電泳結果鑑定山羊STAT3基因第62058nt的單核苷酸多態性為:GG基因型表現為222bp、97bp和25bp三條條帶；AG基因型表現為222bp、122bp、97bp和25bp四條條帶；AA基因型表現為222bp和122bp兩條條帶； 根據瓊脂糖凝膠電泳結果鑑定山羊STAT3基因第62230nt的單核苷酸多態性為:CC基因型表現為233bp、126bp和27bp三條條帶；CT基因型表現為260bp、233bp、126bp和27bp四條條帶；TT基因型表現為260bp和126bp兩條條帶。
5.山羊STAT3基因的45204位的CC基因型、62058位的AA基因型、62230位的TT基因型，作為西農薩能奶山羊的DNA標記在輔助選擇育種中的應用。
6.如權利要求5所述的應用，其特徵在於，所述的DNA標記是作為提高西農薩能奶山羊的體聞的分子標記。
7.山羊STAT3基因的45204位的CC和CT基因型、62058位的AA和GG基因型，作為海南黑山羊的DNA標記在輔助選擇育種中的應用。
8.如權利要求7所述的應用，其特徵在於，所述的45204位的CC和CT基因型DNA標記是作為提高海南黑山羊的管圍的分子標記。
9.如權利要求7所述的應用，其特徵在於，所述的62058位的AA和GG基因型DNA標記是作為提高海南 黑山羊的體長指數的分子標記。
【文檔編號】C12Q1/68GK103866032SQ201410130751
【公開日】2014年6月18日 申請日期:2014年3月28日 優先權日:2014年3月28日
【發明者】潘傳英, 賈文超, 藍賢勇, 陳宏 , 雷初朝, 徐鐵山 申請人:西北農林科技大學