一種靶向納米藥物載體及其製備方法和應用與流程

2023-07-05 15:30:26 4

本發明涉及納米藥物技術領域，更具體地，涉及一種靶向納米藥物載體及其製備方法和應用。

背景技術：

納米藥物是一種新型藥物製劑，通過修飾靶向探針和藥物，納米顆粒可以有效改善生物分布，增加細胞攝取和藥效。通過優化了納米顆粒的尺寸和表面特徵，可以增加血液循環壽命。最近，樹枝狀大分子已經被用於癌症的診斷和治療，因為它們具有優異的水溶性，極大的藥物遞送潛力。聚醯胺-胺型(pamam)樹枝狀大分子是一類高度的具有精確結構的支化聚陽離子大分子和低分散性。pamam作為一種優良的納米級單分子表面活性劑、具有良好的增溶和穩定的作用。在生物醫藥領域作為藥物、基因、疫苗的載體，用於藥物緩釋、體外診斷、體外基因轉移、基因治療、核磁成像等應用。pamam的大小也可以在逐步合成過程中的很好的控制。此外，pamam還通過延長其循環時間來改善藥物載體滲透到脈管系統和腫瘤細胞中。

her2是人類表皮生長因子受體-2，它的過度表達會過度傳遞信號，刺激癌細胞增殖。研究表明，her2在20-30％的乳腺癌中過度表達，her2過表達的乳腺癌浸潤性強，無病生存期短，預後差。卵巢癌，胃癌和子宮頸癌等多種腫瘤中都有her2的過度表達，her2已經成為治療癌症的重要靶標。

目前，針對her2胞外區的抗體藥物研究比較深入，部分藥物已經市場化，如赫賽汀和西妥昔單抗等。赫賽汀是一種人源化單克隆抗體，選擇性地作用於her2的胞外部位，1998年被fda批准上市用於轉移性乳腺癌的治療，治療效果明顯好於現有的抗乳腺癌藥物，現在已成her2陽性乳腺癌患者的首選治療藥物。

然而抗體藥物存在著製備繁瑣、穩定性較差、費用昂貴、穿透力弱等缺點。因此，為了提高乳腺癌診斷和治療的特異性和準確性，彌補抗體的缺陷，迫切需要尋求新的藥物載體和試劑，以作為檢測和治療乳腺癌的有效方法。

技術實現要素：

為了解決上述技術問題或者至少部分地解決上述問題，本發明提供了一種靶向納米藥物載體，該載體包括聚醯胺-胺型樹枝狀大分子、聚乙二醇和靶向多肽；聚醯胺-胺型樹枝狀大分子外圍的部分或全部nh2基各自連接一個聚乙二醇分子，部分聚乙二醇的另一端連接靶向多肽；聚醯胺-胺型樹枝狀大分子外圍的nh2基團與聚乙二醇的摩爾比為1:48-1:96；聚醯胺-胺型樹枝狀大分子與靶向多肽的摩爾比為1:5-20；靶向多肽是能夠與表達或過量表達her2的癌症細胞或癌症組織靶向結合的多肽。

在本發明中，採用上述結構以及特定比例的納米藥物載體可以有效地降低與上述載體的毒性，更好地作為傳遞能治療癌症藥物如dox的載體，減少對正常細胞的傷害。另外，本發明的載體與her2蛋白結合能力強，能夠有效地通過該蛋白來對腫瘤病人進行靶向治療。

在本發明的實施方式中，在聚醯胺-胺型樹枝狀大分子外圍的nh2基連接聚乙二醇分子的個數由聚醯胺-胺型樹枝狀大分子外圍的nh2基團與聚乙二醇的摩爾比值決定，也由聚醯胺-胺型樹枝狀大分子與所述靶向多肽的摩爾比決定，以確保只有部分聚乙二醇的另一端與靶向多肽連接，而非所有的聚乙二醇的另一端均與靶向多肽連接。

在本發明中，載體是以聚醯胺-胺型樹枝狀大分子為中心，外圍連接有peg，在peg外側分布有靶向多肽。該靶向多肽有序分散在peg外側，優選地，等間距分散在peg外側，即聚醯胺-胺型樹枝狀大分子外側。即在一個優選實施方式中，靶向多肽呈等間距與部分聚乙二醇的另一端連接，在由聚醯胺-胺型樹枝狀大分子為中心形成的納米球的外側呈等間距分布。

在本發明一個優選實施方式中，peg也呈等間距分散在聚醯胺-胺型樹枝狀大分子的外圍，其間距比靶向多肽的分散間距小。

在本發明一個優選實施方式中，為了增強對her2的特異性，靶向多肽為h6、h10或由其形成的二價體或多價體。

其中，h6的多肽序列為：ylffvfer，如seqidno.1所示；

h10的多肽序列為：klrlfwnr，如seqidno.2所示。

靶向多肽可以為h6形成的二價體或多價體，也可以為h10f形成的二價體或多價體。其中，二價體或多價體可以通過連接分子共價連接形成，或是通過與多聚體混合非共價連接形成的，本領域技術人員可以根據需要選用多聚體，如聚乙二醇或環糊精。在本發明中，多價指二價以上。

聚醯胺-胺型樹枝狀大分子pamam為一種優良的納米級單分子表面活性劑、具有良好的增溶和穩定作用。在本發明一個優選實施方式中，為了得到適用於上述特定多肽且對正常細胞傷害最低的載體，聚醯胺-胺型樹枝狀大分子pamam為第3-6代聚醯胺-胺型樹枝狀大分子，優選為第4代聚醯胺-胺型樹枝狀大分子，即g4pamam樹枝狀大分子。

在本發明的實施方式中，本發明的靶向納米藥物載體可以制為納米顆粒，也可稱為納米球。當使用本發明的載體與藥結合時，可稱為載有藥物的納米球。

在本發明的實施方式中，聚乙二醇peg的分子量可以根據需要來選擇，可以選用分子量為1000或是2000的聚乙二醇。同時，為了得到本發明的載體結構，可以使用雙功能的聚乙二醇與pamam樹枝狀大分子反應以及靶向多肽反應，其中，雙功能中一活化劑可以為如nhs類的物質，另一活化劑可以為如mal類的物質。

也可以先使聚乙二醇的一側先被nhs活化，並與pamam反應得到pamam-peg，再使用如mal類的物質使pamam-peg中peg另一側活化，使其順利與靶向多肽反應。在本發明一個優選實施方式中，雙功能聚乙二醇指聚乙二醇分子的兩端均被nhs(n-羥基琥珀醯亞胺)功能化。

在本發明一個優選實施方式中，為了減少載體的毒性，聚醯胺-胺型樹枝狀大分子表面的nh2基團與聚乙二醇的摩爾比為1:48-1:96，優選為1:50-1:80，進一步優選為1:60。

在本發明一個優選實施方式中，為了減少載體的毒性，聚醯胺-胺型樹枝狀大分子與所述靶向多肽的摩爾比為1:10-20，優選為1:6-10，進一步優選為1:7.5。

在本發明一個優選實施方式中，聚乙二醇的另一端與靶向多肽為化學鍵連接，優選為碳氮鍵連接，即可以表示為：

其中，pamam為本發明的聚醯胺-胺型樹枝狀大分子，n指peg中-ch-ch-o-單元的個數，該解釋也適用下述反應歷程中結構式。當靶向多肽為h6時，得到的靶向納米載體可以簡寫為pamam-peg-h6。

在本發明的實施方式中，可以使用本領域中常用的方法來製備上述靶向納米藥物載體，為了使合成更加方便，本發明還提供了上述多肽靶向納米藥物載體的製備方法，該製備方法的反應歷程為：

其中，nh2-peptide為本發明的靶向多肽，聚醯胺-胺型樹枝狀大分子pamam與靶向多肽的摩爾比為1:10-20，優選為1:6-10，進一步優選為1:7.5。

在一個優選實施方式中，該製備方法包括以下步驟：

1)合成pamam-peg；

2)使用馬來醯亞胺(mal)活化pamam-peg，即並與靶向多肽按配比室溫反應，即得pamam-peg-肽。

其中，為了簡化工藝，步驟1)具體為：

在meoh和dmso的混合溶劑中，pamam與nhs活化的peg按配比在室溫下反應，純化，即得上述pamam-peg。

混合溶劑中，meoh和dmso的體積比優選為1:1。

在pamam-peg的製備中，在混合溶劑中，pamam樹枝狀聚合物表面的nh2基團與nhs活化的peg按配比在室溫下連續攪拌反應10-15分鐘，優選15分鐘，用sephadexg-50柱純化反應混合物以除去未反應的peg。

在步驟2)中，先用馬來醯亞胺mal活化步驟1)中得到的pamam-peg，並與靶向多肽按配比在室溫下連續攪拌下進一步反應20-30小時，優選24-30小時，然後將反應後的混合物透析並凍幹，即可得到pamam-peg-靶向多肽樹枝狀聚合物，通常為白色固體。

即在一個優選實施方式中，可以使用下述方法來製備得到pamam-peg-靶向多肽樹枝狀聚合物，該載體與藥物結合時靶向性能最佳。

製備方法如下：

1)在混合溶劑中，pamam樹枝狀聚合物表面的nh2基團與nhs活化的peg按配比在室溫下連續攪拌反應10-15分鐘，純化，即得pamam-peg；

2)先用馬來醯亞胺mal活化步驟1)中得到的pamam-peg，並與靶向多肽如h6或h10按配比在室溫下連續攪拌下進一步反應24-30小時，然後將反應後的混合物透析並凍幹，即可得到pamam-peg-靶向多肽樹枝狀聚合物，通常為白色固體。

在本發明的實施方式中，也可以先將peg的一端先用nhs活化，另一端與mal活化，得到nhs-peg-mal，再與pamam樹枝狀聚合物反應得到pamam-peg-mal，將pamam-peg-mal與靶向多肽如h6或h10按配比反應，得到pamam-peg-靶向多肽。

在本發明的實施方式中，可以使用發散方法通過重複麥可反應加入氨基與丙烯酸甲酯合成，通過透析後核磁氫譜(1h-nmr)進行不同代數的pamam樹枝狀大分子的結構鑑定。

本發明還提供了上述靶向納米藥物載體以及上述製備方法在製備治療癌症藥物或腫瘤放射靶向標記物中的應用。

優選地，癌症為her2蛋白過表達的癌症，進一步優選為乳腺癌、肺癌、胃癌、肝癌、結腸癌、膀胱癌或子宮頸癌中的任意一種。

在本發明中，冶療癌症藥物可以被制為能殺傷癌細胞的化學藥物、生物藥物、納米藥物、放射性藥物、光熱治療或光動力治療藥物或包裹這些藥物中的任意一種。也可以被制為烷化劑、抗代謝藥物、抗腫瘤天然藥物、抗腫瘤抗生素、激素或金屬絡合物中的任意一種。

在上述應用中，上述藥物中還可以包括多種能殺傷癌細胞的製劑和/或顯像製劑。

在上述應用中，可以將得到的靶向納米藥物載體包載藥物，如dox等。

本發明的靶向納米藥物載體具有靶向her2蛋白的作用，可以作為靶頭增加藥物載體如納米材料、脂質體等在her2陽性細胞中的含量，再添加藥學上可接受的輔料或佐劑製成新型的更有效的靶向抗癌藥物。且本發明的靶向納米藥物載體可以採用化學合成的方法製備得到，純度高，分子量小，特異性強，無免疫原性，安全可靠。該發明的載體對腫瘤標誌物her2蛋白的靶向作用明顯，選擇性強，同時具有高的藥物包載效率，而且幾乎沒有毒性，極大的提高了藥物載體的安全性，為乳腺癌和其他her2陽性腫瘤的診斷和治療提供了新的選擇與思路。

附圖說明

圖1為本發明實施例1中靶向納米藥物載體的tem和dls圖；

圖2為使用本發明實施例1的載體包載化療藥物dox(即pamam-peg-peph6-dox)的反應流程圖；

圖3為使用本發明實施例中pamam-peg-peph6-dox的藥物體外釋放圖；

圖4為本發明實施例中pamam-peg-peph6-dox對her2蛋白的體外等離子共振成像親和力圖；

圖5a為本發明實施例pamam-peg-peph6-dox、游離dox、pamam-peg-peph6在不同濃度的正常細胞中的細胞毒性圖；

圖5b為本發明實施例pamam-peg-peph6-dox、游離dox、pamam-peg-peph6在不同濃度的her2陽性的腫瘤細胞中的細胞毒性圖。

具體實施方式

下面結合實施例，對本發明的具體實施方式作進一步詳細描述。以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。

若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規技術手段。若未特別指明，實施例中所用的試劑為市售。

實施例1

靶向納米藥物載體pamam-peg-h6肽的製備

(1)第四代聚醯胺-胺型(g4pamam)樹枝狀大分子使用發散方法通過重複麥可反應加入氨基與丙烯酸甲酯合成，其次通過透析(mwco3500)後1h-nmr光譜法進行了pamamg4的結構鑑定。

(2)在meoh和dmso(1:1)的溶劑混合物中，pamam樹枝狀聚合物的外圍nh2基團與nhs活化的peg以1:64的摩爾比室溫反應15分鐘合成pamam-peg。用sephadexg-50柱純化以除去未反應的peg。

(3)為了合成目標pamam-peg-h6肽，通過馬來醯亞胺(mal)活化pamam-peg，並與肽h6以1:16的摩爾比在室溫下連續攪拌下進一步反應30小時，將反應混合物透析並凍幹，得到pamam-peg-h6樹枝狀聚合物，為白色固體。

圖1中進行tem和dls測量其尺寸和形態，修飾聚乙二醇和多肽後平均大小從約4nm增加到7nm，pamam，並且ζ電位測量顯示帶正電(3.60mv)，納米載體的正電荷與帶負電荷的腫瘤細胞膜的進行有效的靜電相互作用增加攝取。

實施例2

在本實施例中，具體包括以下步驟：

(1)使用實施例1中的靶向納米藥物載體包載化療藥物dox，線路圖見圖2所示。使用光譜法測定載量納米載體包載化療藥物dox的含量。結果顯示，每個納米載體可能潛在的平均包封14歌dox分子。

(2)來自pamam-peg-h6/dox的體外dox釋放研究

在酸性條件下，使用透析法進行。將在中性ph條件.10mg載有dox的納米球分別重懸於2mlph7.4和ph5.5pbs緩衝液中，然後加入透析液中袋(mwco3500)。透析袋懸掛在含有200毫升的pbs緩衝液中，37℃攪拌均勻。在不同時間段取樣，並通過螢光分光光度法測定。圖3結果顯示在酸性條件下，納米載體上包載的dox釋放速率明顯比ph7.4更快，ph值可能是由於帶正電的dox分子在pamam樹支在酸性環境中，通過質子化排斥加速dox從疏水樹枝狀大分子的釋放提高藥效。

實施例3

在本實施例中，具體包括以下步驟：

將1mg/ml的pamam-peg-h6顆粒修飾到晶片上，在4℃溼潤條件下孵育過夜，然後用10×pbs清洗10min，再用1×pbs清洗10min，最後用去離子水清洗2次，每次10min，浸入含5％牛奶的1×pbs中，4℃條件下孵育過夜，然後用10×pbs清洗10min，1×pbs清洗10min，最後用去離子水清洗2次，每次10min，用氮氣吹乾，裝晶片上機(plexeraht表面等離子共振成像系統)。

流動相依次通過1×pbs、2×pbs、2.5μg/ml、5μg/ml和10μg/ml的人her2純化蛋白，記錄分析spri信號。

由圖4可以看出，pamam-peg-h6的spri信號隨著人her2蛋白濃度的增加逐漸增強，親和解離常數kd達到了7.48×10-10摩爾/升，說明本發明的靶向載體對her2是有強結合的，可以作為靶向her2腫瘤的藥物載體用於相關的研究應用。

實施例4

在本實施例中，評價藥物載體的體外抗腫瘤效果，具體方法如下：

(1)分別將skbr-3和293t細胞種分別傳到96孔板中培養，每個孔5000個細胞，培養過夜；

(2)當細胞融貼壁後，分別加入含0.01、0.1、0.5、1、10和100mm的dox,pamam–peg–h6和pamam–peg–h6/dox37℃孵育48h；

(3)吸掉藥物溶液，加入0.5mg/ml的mtt溶液37℃度孵育4個小時；

(4)吸掉液體，加入200μl二甲基亞碸(dmso)，經過10分鐘震蕩混勻後，使用酶標儀測定570nm處的光密度od570值，並分析數據。

如圖5a所示，在正常細胞中，與游離dox(freedox)相比，pamam-peg-h6幾乎沒有細胞毒性，進而說明其作為載體的安全性。圖5b中，pamam–peg–h6/dox對her2陽性的腫瘤細胞的毒性比游離dox表現出更高的細胞毒性，說明是由於h6靶向作用導致更高效的細胞毒作用。

本發明的靶向納米藥物載體是一種對her2蛋白高靈敏度高特異性結合的載體，與能殺傷癌細胞的製劑相綴合或混合，用於多種腫瘤的靶向治療。

最後，本發明的方法僅為較佳的實施方案，並非用於限定本發明的保護範圍。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。

序列表

國家納米科學中心

一種靶向納米藥物載體及其製備方法和應用

khp171111887.5

2

patentinversion3.5

1

8

prt

人工序列

1

tyrleuphephevalphegluarg

15

2

8

prt

人工序列

2

lysleuargleuphetrpasnarg

15