一種用於植物直接基因轉化的組合物的製作方法
2023-08-13 05:39:21 2
專利名稱：一種用於植物直接基因轉化的組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種用於植物直接基因轉化的組合物及其應用，屬於生物工程領域。
背景技術：
植物基因工程是在分子生物學深入發展和重組DNA技術日趨完善的基礎上發展起來的。在植物抗病、抗蟲、抗莠和改變植物的某些成分方面得到不少轉基因植物，有的已形成品系，為提高作物產量、抗逆能力、改進品質，進行快速、優質、穩產的良種選育提供了全新途徑。在高等植物基因工程研究中，外源基因的轉移是極為重要的一環。由於植物及其細胞自身的特殊性，因而對基因轉移方法也有一些特殊的要求。縱觀諸多外源基因轉移方法，按照載體的形式可以分為兩大類即用含外源基因Ti質粒的根癌農桿菌侵染植物和用含外源基因的DNA直接轉化植物。含外源基因DNA的直接轉化是用物理，化學和生物手段將裸露的外源DNA導入植物細胞組織或器官，並使外源DNA所包含的基因在植物細胞內進行表達。這一方法從根本上克服了Ti質粒只能侵染雙子葉植物的缺陷，使受體植物範圍大大擴展。
在植物基因工程的發展中，研究最清楚和應用最成功的是根癌農桿菌介導的遺傳轉化。1974年，人們發現根癌農桿菌在感染植物時，可將其中環狀的Ti質粒上的一段DNA插入植物基因組中，引起植物遺傳特性的變化。從此，人們開始嘗試利用這種天然的載體系統，將外源基因導入植物細胞，並利用植物細胞的全能性，藉助於細胞培養或組織培養技術，使轉化細胞再生成完整的轉基因植株，從而實現外源基因對植物的遺傳轉化。1983年獲得了第一例轉基因植物。1985年，Horsh等人首創葉盤轉化法，使得轉化過程大為簡化。此後，因該方法因具有轉基因低拷貝，遺傳穩定以及能夠轉化大片段DNA等優點而得到廣泛使用。目前，在眾多的轉基因植物中80％是由農桿菌介導轉化的。根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)，它含有Ti質粒，能誘導被侵染的植物細胞形成腫瘤，即誘發冠癭瘤。Ti質粒(包括Ri質粒)上有一段轉移DNA(又稱T-DNA)，在農桿菌侵染植物時，這段DNA可以插入到植物基因組中，使其攜帶的基因在植物中得以表達。由於T-DNA能夠進行高頻率的轉移，而且Ti質粒和Ri質粒上可插入大到50kb的外源基因。因此，Ti質粒和Ri質粒就成為植物基因轉化的理想載體系統。Ti質粒上T-DNA的轉移必須藉助於Ti質粒上vir基因編碼產生的毒蛋白virD2/E2virD2和virE2的作用才能實現轉化。但農桿菌轉化一般需要經過組織培養，受到受體植物類型，以及再生系統建立的限制。
基因槍法是目前直接轉化法中最為廣泛使用的一種方法，該法又稱粒子轟擊(particlebombardment)，高速粒子噴射技術(High-velocity particle microprojection)或基因槍轟擊技術(gene gun bombardment)，是由美國Comel大學生物化學系John.C.Santord等於1983年研究成功。並在1987年，Vlein首先報導了應用此技術將TMV(菸草花葉病毒)RNA吸附到鎢粒表面，轟擊洋蔥表皮細胞，經檢測發現病毒RNA能進行複製，並以同樣技術將CAT(氯黴素乙醯轉移酶基因)基因導入洋蔥表皮細胞。現在，該技術已在菸草、水稻、小麥、黑麥草、甘蔗、棉花、大豆、菜豆、洋蔥、番木瓜、甜橙、葡萄等多種作物上成功。該方法具有應用面廣，方法簡單，轉化時間短，由於基因槍轟擊的隨機性，外源基因進入宿主基因組的整合位點相對不固定，拷貝數往往較多，這樣轉基因後代容易出現突變、外源基因容易丟失，容易引起基因沉默等現象的發生，不利於外源基因在宿主植物的穩定表達。而且基因槍價格昂貴、運轉費用高。
花粉管通道法，最早是由周光宇1983年建立。在植物授粉後一定時間，將外源DNA注入棉花子房的中胚胎部位，使DNA沿著已形成的花粉管通道進入胚囊，從而轉化尚不具備正常細胞壁的受精卵或胚細胞。由於該方法有的是採用總DNA進行導入，後代的變異是隨機的，加之很多的試驗缺少分子驗證，而且對於外源DNA整合的機制難以解釋清楚，所以對於花粉管通道方法的廣泛使用還存在著爭議。此外，由於設計原理和操作規程本身的限制，外源的轉化元件是裸露的DNA，在其通過花粉管進入胚囊，通過受精卵的細胞膜、核膜完成整合的過程中，非常易於被降解，而且外源DNA進入胚囊主要依賴於重力和滲透作用，外源DNA缺乏整合進受體基因組的根本動力，轉化效率低，所產生的轉基因植株其後代不能穩定的遺傳等問題。
化學法一般利用植物原生質體，在沒有載體的情況下，藉助一些化學試劑的誘導能吸收外源DNA，質粒等遺傳物質，並有可能整合到植物染色體上去。常用的化學試劑有PEG(聚乙二醇)，PLD(多聚鳥氨酸)，PVA(聚乙稀醇)等，其中最為常用的是PEG。應用這一方法，在植物細胞中首次進行直接基因裝移的是戴維(Davey)和Krens等。化學法打破了根癌農桿菌侵染範圍的限制，使之可以廣泛應用於多種單子葉的禾穀類植物，目前已實現了對栽培一粒小麥，多年生黑麥，水稻，高糧和小麥等原生質體以及雙子葉植物油菜，菸草和矮牽牛的轉化。但單獨應用化學法進行轉化較難成功，轉化效率低。化學法研究的時間比較長，方法較成熟，且成本低、重複性好、易於推廣。但由於原生質體再生頻率較低，培養難度大，周期長，因而使這一方法的普及受到限制。
同時，目前廣泛應用的基因槍和農桿菌介導的植物轉化方法，始終存在選擇標記基因和載體骨架序列等非目的基因外源DNA片段引起的潛在安全性問題。而以消除選擇標記基因和載體骨架序列為目標，國內外許多實驗室近年來採用了多種策略進行大量的研究和不斷的改進並且取得了一些進展。
因此探討建立一種新的可以完全消除非目的基因外源DNA片段的安全、實用、簡便、高效、穩定，且不需經過組織培養，受體範圍廣的直接轉化系統具有重要的意義。
發明內容
本發明的目的是提供一種用於植物直接基因轉化的組合物和該組合物的安全、簡便、高效的直接基因轉化方法以及該組合物的的應用。
本發明解決其技術問題採用的技術方案是，一種用於植物直接基因轉化的組合物，該組合物含有(1)目的基因及其表達調控元件的游離核酸組分，包括質粒DNA或不含載體骨架的線性DNA片段；(2)轉化緩衝液，包括1/2MS液體培養基，或TE(pH8.0)或0.1×SSC緩衝液；(3)轉化輔助組分包括0.005％-0.02％的表面活性劑DOW CORNING Q2-5211，10mmol/L-50mmol/L Ca2+，1-10ppm 2，4-D，0.5ppm 6-BA。轉化輔助組分還包括0.1％硼酸、根癌農桿菌分泌的VirD2蛋白和VirE2蛋白。根癌農桿菌是指含有Vir區、Con區和Ori區，但不含有T-DNA轉移區的Ti質粒。VirD2蛋白和VirE2蛋白通過乙醯丁香酮誘導分泌獲得。質粒DNA是指具備完整的複製起點、目的基因、表達調控元件和邊界序列的環狀DNA或具備完整的複製起點、目的基因、表達調控元件，但不含有邊界序列的環狀DNA。線性DNA組分是指包含邊界序列、目的基因及其表達調控序列的線性DNA片段或包含目的基因及其表達調控序列，但不包含邊界序列的線性DNA片段。質粒DNA和線性DNA在組合物中游離存在，不需要轉導入根癌農桿菌中。線性DNA組分包括雙鏈DNA線形片段或單鏈DNA線形片段。雙鏈DNA線性片段可通過PCR方法從目的質粒上擴增所獲得或從目的質粒上通過酶切獲得。單鏈DNA片段由雙鏈DNA通過99℃變性後0℃迅速降溫所獲得。
一種用於植物直接基因轉化的組合物的轉化方法，可以通過共培養，浸泡，表面塗抹，注射，滴注，噴施，蘸花方法轉化；也可以通過基因槍轟擊、超聲波、電擊方法轉化。
該組合物可應用於針對受體植物細胞，包括受精卵、懸浮細胞、原生質體、單層細胞、葉肉細胞的直接轉化，可應用於針對受體植物組織，包括未成熟胚、胚性愈傷組織、分生組織的直接轉化，也可應用於針對種子的直接轉化和可應用於針對受體植物花粉、雌蕊、花柱、花粉管、子房的直接原位轉化。
本發明提供的植物基因轉化組合物及其在直接轉化中的應用，其核心技術在於提供的包含游離核酸組分、轉化緩衝液和轉化輔助組分的轉化組合物，能夠解決直接轉化中所面臨的目的基因轉化動力、轉運、保護和整合的一系列問題。
本發明所提供的轉化輔助組分，主要包括表面活性劑Dow Corning Q2-5211，Ca2+，生長調節劑2，4-D或6-BA，硼酸，以及經乙醯丁香酮誘導的根癌農桿菌所分泌到胞外的VirD2蛋白和VirE2蛋白。轉化輔助組分的結合使用，可以在轉化中起到提供轉化動力，核定位，以及保護和促進整合的作用。
Dow Corning Q2-5211超級潤溼劑是一種低分子量的非離子聚醚改性有機矽表面活性劑，當濃度為0.01％時，Dow Corning Q2-5211超級潤溼劑可以使表面張力降低至23dynes/cm，這使得轉化緩衝液可以迅速溼潤，並在難以溼潤的外植體比如蠟狀葉子表面上迅速擴散並被外植體所吸收，可以顯著提高轉化緩衝液的潤溼性、延展性和滲透性，從而有助於提高轉化的效率，並安全無毒，是理想的轉化動力來源。在本發明中，DOW CORNING Q2-5211的濃度範圍為0.005％-0.02％。
DNA可以通過鈣鹽的形式沉積在細胞的表面，並通過引發胞吞作用，實現DNA的轉移。用10mmol/L-50mmol/L的CaCl2(或磷酸鈣)處理受體細胞，可以引起細胞膨脹，增大細胞的通透性，使受體細胞易於接受外源DNA，提高轉化效率。在本發明中Ca2+的濃度範圍是10mmol/L-50mmol/L。
2，4-D和6-BA在低濃度下均為植物生長調節物質，有助於細胞處理旺盛的生長和分裂狀態，處於旺盛分裂期的細胞更有助於接受外源的DNA，提高轉化效率。本發明中2，4-D的濃度範圍是1-10ppm；6-BA的濃度是0.5ppm。
硼是一種向化性物質，可以引導花粉管由柱頭到胚株的轉移，在針對花器官的轉化中，在本發明中加入0.1％硼酸可以有助於轉化元件經柱頭或子房表面到到胚株，完成外源基因的定向傳輸和整合。
本發明所提供的轉化輔助組分中，特別利用農桿菌誘導表達的毒蛋白virD2和virE2實現游離核酸向受體的轉移，核定位、保護及整合。毒蛋白virD2可以協助帶有T-DNA左右邊界序列的目的基因及其調控序列完成轉移、核定位及在植物基因組中的整合；virE2可以在細胞膜，及核膜上建立單鏈特異性的通道，並與單鏈核酸的結合起到穩定和保護的作用，virE2具有核定位信號，協助virD2-單鏈核酸複合物向植物細胞核的定位和整合，解決目前游離核酸直接轉化過程中易被降解、轉化多拷貝、轉化效率低、重複性差等多種問題。
本發明使用只含有Vir區、Con區和Ori區，但不含有T-DNA轉移區的農桿菌Ti質粒。virD2和virE2蛋白的誘導表達主要通過以下技術方案來實現含有Ti質粒的農桿菌LBA4404或GV3101，接種於含有50mg/L的利福平和25mg/L的鏈黴素的YEB培養基中，於28℃和250rpm條件下搖動培養至生長對數期(菌液吸光度OD550為1.8-2.0)；將培養好的菌液在5000rpm條件下離心I0min，菌體重新懸浮於1/2MS液體培養基製成菌液，稀釋後的菌液濃度約為2×108cfu/ml，然後向菌液中加入乙醯丁香酮至終濃度為20mg/L，繼續在28℃和250rpm條件下搖動培養3-4個小時，3000rpm條件下離心10min離心去除菌體，上清液為含有virD2和virE2的轉化緩衝液。
農桿菌virD2/virE2蛋白輔助的直接轉化包括兩種方式。一種是針對受體植物的細胞、組織的轉化。該轉化體系的主要技術路線是(1)樣品前處理受體細胞或組織在預轉化前於70％的乙醇消毒1分鐘，MS培養基衝洗一次，升汞消毒10分鐘，MS衝洗數次，然後可選擇置於高滲緩衝液中處理10-20分鐘，高滲緩衝液的組成為MS液體培養基+47g/L甘露醇+47g/L山梨醇。(2)轉化將處理後的受體細胞或組織與含有游離轉化元件、轉化緩衝液和經乙醯丁香酮誘導的Ti質粒菌液，或含有virD2和virE2的轉化輔助溶液的轉化組合物中培養30min-1h。(3)瞬時表達分析將外植體取置於含有0.5ppm 6-BA的MS分化培養基中在20-24℃條件下黑暗共培養1-3天，根據編碼基因的特性，選擇適當的方法檢測該基因的瞬時表達。如上述的轉化組合物中添加終濃度為0.005％-0.02％的的DOW CORNINGQ2-5211，10mmol/L-100mmol/L的CaCl2，1-10ppm的2，4-D或0.5ppm的6-BA等轉化輔助組分，可以進一步提高轉化效率。第二種是針對花器官的直接原位轉化。可藉助花粉管通道法、子房注射，或子房滴注法，實現植物原位轉化。該轉化方法的主要技術路線是將含有游離轉化元件、轉化緩衝液和經乙醯丁香酮誘導的Ti質粒菌液，或含有virD2和virE2的轉化輔助溶液的轉化組合物直接滴加到切割過的柱頭或子房表面，或注射入柱頭或子房的內部，實現游離核酸對合子的轉化，收穫的種子中即可能包含有轉化基因，收穫種子直接成株後，經篩選分析，可以獲得穩定持續的轉基因後代。該方法不需要經過組織培養過程，簡便、高效，成本低廉。同樣，在轉化組合物中添加終濃度為0.005％-0.02％的Dow Corning Q2-5211，10mmol/L-50mmol/L的CaCl2；0.1％硼酸；1-10ppm的2，4-D或0.5ppm的6-BA，可以進一步提高轉化效率。
本發明中提供的含有目的基因及其表達調控元件的游離核酸組分主要包括質粒DNA組分和線性DNA組分。質粒DNA是指具備完整的複製起點、表達調控元件、包含(或不包含)邊界序列的環狀DNA，在本發明中質粒不需要轉導入菌體中，在轉化組合物中以溶液形式游離存在。線性DNA組分是指包含(或不包含)邊界序列、目的基因及其調控序列的線性DNA片段，在轉化組合物中也以溶液形式游離存在。
邊界序列主要指Ti質粒中T-DNA左右邊界的保守序列，在目的基因及其調控序列兩端加入T-DNA左右邊界的保守序列，有利於VirD2的識別，及在植物受體中的定位和整合。在本發明中，加入目的基因啟動子之前序列為T-DNA右邊界，其保守序列為5-gtttacccgccaatatatcctgtca；加入到目的基因終止子之後的序列為T-DNA左邊界，其保守序列為5-tgtttacaccacaatatatcctgcca。本發明提供的線性DNA可以是單鏈的DNA也可以雙鏈的DNA。雙鏈的線性片段可通過PCR方法從目的質粒上擴增所獲得，或從目的質粒上通過酶切獲得。單鏈DNA片段主要通過雙鏈DNA 99℃變性後0℃迅速降溫所獲得。
本發明的有益效果是，本發明提供的植物基因轉化組合物及其在直接轉化中的應用，能夠解決直接轉化過程中，目的基因所面臨的轉化動力、定位、保護和整合的一系列問題。利用僅由表達調控序列和目的基因組成的線性片段，可以實現無選擇標記基因、無載體骨架序列的轉化過程，具有生物安全性；針對花器官的直接原位轉化，可以實現無組織培養的轉化過程，從而避免了植株再生系統建立的瓶頸，擴大了轉化受體的範圍。因此，本發明提供的植物基因轉化組合物對於植物遺傳育種、品種改良或基因功能分析具有重要的意義。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明進一步說明。
實施例1GUS基因在洋蔥表皮細胞中的快速高效的瞬間表達取洋蔥下表皮用刀片劃為適當大小的組織塊，於70％的乙醇消毒1分鐘，MS培養基衝洗一次，升汞消毒5分鐘，MS衝洗數次，然後置於高滲緩衝液MS液體培養基+47g/L甘露醇+47g/L山梨醇中預處理10-20分鐘。
含有Ti質粒的農桿菌，接種於含有抗生素的YEB培養基中，於28℃和250rpm條件下搖動培養至生長對數期(菌液吸光度OD550為1.8-2.0)；③將培養好的菌液在5000rpm條件下離心10min，然後菌體重新懸浮於1/2MS液體培養基(附加乙醯丁香酮20mg/L)+轉化元件+0.01％的Dow corning Q2-5211+10mmol/L的CaCl2+0.1mmol/L亞精氨，稀釋後的菌液濃度約2×108cfu/ml；轉化元件為帶有RB+35S+GUS+NOS+LB的線性片段；④將經過預處理的洋蔥下表皮置於菌液中，25-26℃條件下緩慢搖動1.5h；⑤取出洋蔥下表皮轉入MS培養基(乙醯丁香酮200p mol/L)上，25-26℃共培養36-48小時；⑥將共培養後的洋蔥下表皮，用無菌水洗3次，再用附加500mg/L頭孢黴素的無菌水洗1次，用無菌濾紙吸乾水分；⑦將洋蔥表皮置於96孔板中，每孔放置一片洋蔥表皮，鋪平後，表面滴加X-gluc20微升，然後置於37℃培養箱中1-12個小時，於體視顯微鏡下觀察記錄GUS基因的表達情況。結果表明，洋蔥表皮在農桿菌分泌的毒蛋白virD2/E2的介導下，能夠有助於目的基因及其調控序列進入到細胞核內部，目的基因在其調控序列的作用下能夠實現目的基因的瞬間表達，且表達的GUS蛋白在細胞中呈均勻分布。瞬間表達蛋白的細胞有60-80％。
實施例2含有GUS基因的線性片段通過花粉管通道法的高效穩定轉化帶有農桿菌毒蛋白virD2/E2的緩衝液的製備含有Ti質粒的農桿菌LBA4404，接種於含有50mg/L的利福平和25mg/L的鏈黴素的YEB培養基中，於28℃和250rpm條件下搖動培養至生長對數期(菌液吸光度OD550為1.8-2.0)；將培養好的菌液在5000rpm條件下離心10min，菌體重新懸浮於1/2MS液體培養基製成菌液，稀釋後的菌液濃度約為2×108cfu/ml，然後向菌液中加入乙醯丁香酮至終濃度為20mg/L，繼續在28℃和250rpm條件下搖動培養3-4個小時，3000rpm條件下離心10min離心去除菌體，上清液為帶有virD2和virE2的緩衝液。然後將緩衝液中加入終濃度分別為0.01％的Dow Corning Q2-5211、10mmol/L的CaCl2、0.1％硼酸和0.5ppm的6-BA製作成轉化緩衝液。
轉化元件的獲得以pBI121-GUS質粒為模板，使用含有T-DNA邊界序列的引物PT1/PT2進行PCR擴增，構建基因轉化元件。PT15』-GTTTACCCGCCAATATATCCTGTCACTGCCTGCAGGTCCCCAGATTAGCCTT-3』，PT25』-TGGCAGGATATATTGTGGTGTAAACCGATCTAGTAACATAGATGACACCGC-3』，使用高保真LaTaq酶進行PCR擴增。反應條件如下95℃，5min後，94℃30s，55℃1.5min，72℃，1.5min共30個循環，72℃7min；PCR擴增產物經1％瓊脂糖凝膠電泳鑑定後，加入二倍體積無水乙醇，及1/10體積的3M的NaAc進行沉澱，定量，溶於帶有毒蛋白virD2/E2的轉化緩衝液中，終濃度為100ngμl-1，用於進一步的轉化。
在大豆自花授粉後6-32小時(花冠略高於花萼1mm左右)完整切除柱頭，將5ul轉化緩衝液滴於切口處。若氣溫較高，補滴一次。標記處理的花朵，並剪除未進行操作的花朵。成熟後收穫種子。以只含1/2MS轉化緩衝液的處理作對照。利用PCR、Southern雜交等分子手段對收穫的種子及其後代進行檢測，結果表明在毒蛋白virD2/E2介導的轉化緩衝液的作用下，線性片段以單拷貝的形式穩定整合到大豆的基因組中。
權利要求
1.一種用於植物直接基因轉化的組合物，其特徵在於，該組合物含有(1)目的基因及其表達調控元件的游離核酸組分，包括質粒DNA或不含載體骨架的線性DNA片段；(2)轉化緩衝液，包括1/2MS液體培養基，或TE(pH8.0)或0.1×SSC緩衝液；(3)轉化輔助組分包括0.005％-0.02％的表面活性劑DOW CORNING Q2-5211，10mmol/L-50mmol/L Ca2+，1-10ppm 2，4-D，0.5ppm 6-BA。
2.根據權利1所述的一種用於植物直接基因轉化的組合物，其特徵在於，所述的轉化輔助組分還包括0.1％硼酸。
3.根據權利1所述的一種用於植物直接基因轉化的組合物，其特徵在於，所述的轉化輔助組分還包括根癌農桿菌分泌的VirD2蛋白和VirE2蛋白。
4.根據權利3所述的一種用於植物直接基因轉化的組合物，其特徵在於，所述的根癌農桿菌是指含有Vir區、Con區和Ori區，但不含有T-DNA轉移區的Ti質粒。
5.根據權利3所述的一種用於植物直接基因轉化的組合物，其特徵在於，所述的VirD2蛋白和VirE2蛋白通過乙醯丁香酮誘導分泌獲得。
6.根據權利要求1所述的一種用於植物直接基因轉化的組合物，其特徵在於，所述的質粒DNA是指具備完整的複製起點、目的基因、表達調控元件和邊界序列的環狀DNA或具備完整的複製起點、目的基因、表達調控元件，但不含有邊界序列的環狀DNA。
7.根據權利要求1所述的一種用於植物直接基因轉化的組合物，其特徵在於，所述的線性DNA組分是指包含邊界序列、目的基因及其表達調控序列的線性DNA片段或包含目的基因及其表達調控序列，但不包含邊界序列的線性DNA片段。
8.根據權利要求1所述的一種用於植物直接基因轉化的組合物，其特徵在於，所述的質粒DNA和線性DNA在組合物中游離存在，不需要轉導入根癌農桿菌中。
9.根據權利要求7所述的一種用於植物直接基因轉化的組合物，其特徵在於，所述的線性DNA組分包括雙鏈DNA線形片段或單鏈DNA線形片段。
10.根據權利要求9所述的一種用於植物直接基因轉化的組合物，其特徵在於，所述的雙鏈DNA線性片段可通過PCR方法從目的質粒上擴增所獲得或從目的質粒上通過酶切獲得。
11.根據權利要求9所述的一種用於植物直接基因轉化的組合物，其特徵在於，所述的單鏈DNA片段由雙鏈DNA通過99℃變性後0℃迅速降溫所獲得。
12.根據權利要求1所述的一種用於植物直接基因轉化的組合物的轉化方法，其特徵在於，可以通過共培養，浸泡，表面塗抹，注射，滴注，噴施，蘸花方法轉化；也可以通過基因槍轟擊、超聲波、電擊方法轉化。
13.根據權利要求1所述的一種用於植物直接基因轉化的組合物，其特徵在於，該組合物可應用於針對受體植物細胞，包括受精卵、懸浮細胞、原生質體、單層細胞、葉肉細胞的直接轉化。
14.根據權利要求1所述的一種用於植物直接基因轉化的組合物，其特徵在於，該組合物可應用於針對受體植物組織，包括未成熟胚、胚性愈傷組織、分生組織的直接轉化。
15.根據權利要求1所述的一種用於植物直接基因轉化的組合物，其特徵在於，該組合物可應用於針對種子的直接轉化。
16.根據權利要求1所述的一種用於植物直接基因轉化的組合物的應用方法，其特徵在於，該組合物可應用於針對受體植物花粉、雌蕊、花柱、花粉管、子房的直接原位轉化。
全文摘要
本發明公開了一種用於植物直接基因轉化的組合物、轉化方法及其應用，組合物包括(1)目的基因及其表達調控元件的游離核酸組分，(2)轉化緩衝液，和(3)轉化輔助組分。轉化方法是通過共培養，浸泡，表面塗抹，注射，滴注，噴施，蘸花方法轉化；也可以通過基因槍轟擊、超聲波、電擊方法轉化。組合物可應用於針對受體植物細胞，包括受精卵、懸浮細胞、原生質體、單層細胞、葉肉細胞的直接轉化，針對受體植物組織，包括未成熟胚、胚性愈傷組織、分生組織的直接轉化，用於針對種子的直接轉化和可應用於針對受體植物花粉、雌蕊、花柱、花粉管、子房的直接原位轉化。本發明對於植物遺傳育種、品種改良或基因功能分析具有重要的意義。
文檔編號C12N15/82GK101016553SQ20071001019
公開日2007年8月15日 申請日期2007年1月22日 優先權日2007年1月22日
發明者楊君, 程雲清, 安利佳 申請人:大連理工大學