用於檢測生物分子的相互作用的方法和單元的製作方法

2023-08-13 08:55:21

專利名稱：用於檢測生物分子的相互作用的方法和單元的製作方法
技術領域：
本發明涉及使用固定有生物分子(生體関連分子)的載體檢測生物分子的相互作 用的方法以及用於在該方法中使用的單元。
背景技術：
隨著基因組解析的發展，參與各種生物的生理反應的生物分子被明確。這些生物 分子包括DNA、蛋白質、糖鏈、細胞等，功能和結構等已明確的分子被用於藥物開發或臨床檢 驗、食品檢驗、環境檢測等各種產業用途中。在以臨床檢驗為首的檢驗中，通常採用以下的方法。即，如果使檢體與載體上固定 有與要檢測的生物分子(以下稱為分析物)特異性結合的探針分子(以下稱為配體)的器 件接觸，當檢體上存在分析物時，由於和配體結合，分析物在載體上被捕獲，從而該被捕獲 的分析物被檢測到。如上所述的檢驗方法近年來也要求高速化、自動化，從而迫切希望研究出同時綜 合地計測幾百 幾萬的生物分子的檢測方法，使用固定生物分子的集成技術、所謂的MEMS 技術的器件設計成為可能，其是作為所謂的微陣列用於藥物開發研究和生物研究中的綜合 解析。作為器件的微陣列根據被固定在載體上的探針分子的種類，包括DNA微陣列(也 稱之為DNA晶片)、蛋白質微陣列(也稱之為蛋白質晶片)、細胞微陣列(也稱之為細胞芯 片)等。解析是使預先用例如螢光物質進行了螢光標記的檢體接觸微陣列上，然後洗滌微 陣列，然後檢測測定螢光物質發出的螢光信號，從而鑑定或定量檢體中所含的分析物(特 表 2006-515065 號公報)。DNA晶片等的微陣列通常被製成載玻片那樣的大小，專門在其上滴上檢體，用標本 覆蓋使之反應。今後，根據用途大量自動處理微陣列是必要的。這種情況下希望將微陣列 小型化，並且希望開發出用於自動處理小型化微陣列的有效的手段。發明概述本發明人等為了自動處理小型化了的微陣列，而將微陣列固定在支撐構件上，將 其插入容納有檢體的中空支架(holder)中，使之反應，結果發現由於檢體的容積為微量 (幾μ 幾百μ )，所以受表面張力影響，檢體與微陣列的接觸進行得不充分，導致反應不 充分。因而，本發明的課題是提供一種在小型化微陣列的自動處理中，用於使微量的檢 體與微陣列的接觸充分進行的手段。本發明人通過在將微陣列固定在支撐構件上後將其插入容納有反應液的中空支 架中使之反應之際，進行定位，使支撐構件不偏斜地插入到中空支架內，發現檢體與微陣列 的接觸得以充分進行，從而完成了本發明。S卩，本發明包含以下的發明。
(1)單元，所述單元是使用固定有生物分子的載體檢測生物分子的相互作用中使 用的單元，其具備一端具有開口部另一端封閉的中空支架和固定有載體的可插入中空支架 的載體支撐構件，所述載體固定有生物分子，在載體支撐構件被插入至中空支架的姿勢下， 載體支撐構件的後端部和中空支架開口部的邊緣咬合，由此中空支架被密封，同時，載體支 撐構件和中空支架被定位，在以定位姿勢沿包括中空支架軸心的面切開的剖面圖中，由中 空支架的內側和固定有載體的載體支撐構件的外側所構成的面積在載體支撐構件的自載 體固定部至前端部的區域，在軸心的左右是大致相同的。(2) (1)所述的單元，載體支撐構件中的載體固定部是具有底面和側面的凹部，載 體被配置於凹部的底面。(3) (2)所述的單元，載體支撐構件凹部的至少後端部一側的側面是傾斜面。(4) (3)所述的單元，傾斜面的表面粗糙度在IOym以下，傾斜面與底面所成的角 度在75°以下。(5) (2) (4)任一項所述的單元，在載體支撐構件凹部的自前端部一側的側面至 前端部形成有排液槽。(6) (1) ( 任一項所述的單元，在載體支撐構件被插入至中空支架的姿勢下， 在載體支撐構件的自載體固定部至前端部一側的區域，載體支撐構件的體積佔中空支架容 積的比例為60%以上。(7) (1) (6)任一項所述的單元，在載體支撐構件被插入至中空支架的姿勢下， 載體支撐構件的體積佔中空支架容積的比例為25 70%。(8) (1) (7)任一項所述的單元，具有分別固定有載體的多個載體支撐構件，載 體支撐構件的後端部分別被固定於表面材料，具有對應於各個支撐構件的多個中空支架。(9)使用固定有生物分子的載體檢測生物分子的相互作用的方法，包括將固定 有生物分子的載體固定於載體支撐構件，將該載體支撐構件插入到一端具有開口另一端封 閉的容納有反應液的中空支架中，由此使載體上生物分子與反應液中已被螢光標記的生物 分子進行相互作用的相互作用工序；通過洗滌載體除去沒有和載體上固定的生物分子發生 相互作用的生物分子的洗滌工序和對載體照射激發光，通過檢測器檢測螢光的檢測工序； 在載體支撐構件被插入至中空支架的姿勢下，載體支撐構件的後端部和中空支架開口部的 邊緣咬合，由此中空支架被密封，同時，載體支撐構件和中空支架被定位，在以上述定位姿 勢沿包括中空支架軸心的面切開的剖面圖中，由中空支架的內側與固定有載體的載體支撐 構件的外側所構成的面積在載體支撐構件的自載體固定部至前端部的區域，在軸心的左右 是大致相同的。(10) (9)所述的方法，載體支撐構件中的載體固定部是具有底面和側面的凹部，載 體被配置於凹部的底面。(11) (10)所述的方法，載體支撐構件凹部的至少後端部一側的側面是傾斜面。(12) (11)所述的方法，傾斜面的表面粗糙度在IOym以下，傾斜面與底面所成的 角度在75°以下。(13) (10) (1 任一項所述的方法，在載體支撐構件凹部的自前端部一側的側 面至前端部形成排液槽。(14) (9) (1 任一項所述的方法，在載體支撐構件被插入至中空支架的姿勢5下，在載體支撐構件的自載體固定部至前端部一側的區域，載體支撐構件的體積佔中空支 架容積的比例為60%以上。(15) (9) (14)任一項所述的方法，在載體支撐構件被插入至中空支架的姿勢 下，載體支撐構件的體積佔中空支架容積的比例為25 70%。(16) (9) (15)任一項所述的方法，具有分別固定有載體的多個載體支撐構件， 載體支撐構件的後端部分別被固定於表面材料，具有對應於各個支撐構件的多個中空支架。根據本發明，可提供一種在小型化微陣列的自動處理中，用於使微量的檢體與微 陣列的接觸充分進行的手段。本說明書包含作為本申請優先權基礎的特願2008-141155號的說明書、權利要求 書和附圖中記載的內容。


圖1給出了本發明的一個實施方式。圖2給出了本發明的一個實施方式。圖3給出了本發明的一個實施方式。圖4給出了本發明的一個實施方式。圖5給出了本發明的一個實施方式。圖6給出了載體支撐構件的後端部和中空支架開口部的邊緣咬合的情況(a)和不 咬合的情況(b)的比較結果。圖7給出了具有排液槽的載體支撐構件(a)、不具有排液槽的載體支撐構件(b)和 中空支架(C)的一個實施方式。圖8給出了使用具有排液槽的載體支撐構件和不具有排液槽的載體支撐構件時 的檢測結果。圖9給出了在插入到中空支架的姿勢下，載體支撐構件的體積佔中空支架的容積 的比例為80%的載體支撐構件(a)和50%的載體支撐構件(b)分別插入到容納有反應液 的中空支架中的結果。
具體實施例方式本發明中，生物分子包括DNA和RNA等核酸、肽、糖鏈和細胞、它們的複合體以及它 們與其他分子的複合體等。本發明中，肽包括寡肽、多肽和蛋白質。載體上固定的生物分子 是肽時，通常1 lOOOkDa、優選1 200kDa的肽是理想的。此外，載體上固定的生物分子 是核酸時，通常3 5000鹼基、優選10 1000鹼基的核酸是理想的。此外，載體上固定的 生物分子是糖鏈時、通常1 100糖、優選1 30糖的糖鏈是理想的。本發明中，生物分子 優選是核酸、更優選是DNA。生物分子的相互作用優選是指生物分子之間的特異性相互作用，包括例如，蛋白 質之間的相互作用、蛋白質和肽的相互作用、核酸之間的相互作用、蛋白質和核酸的相互作 用、蛋白質和化合物的相互作用等。更具體而言，可舉出核酸互補鏈之間的雜交、抗原與抗 體或其片斷的反應、酶與基質或抑制劑的結合反應、配體和受體的結合反應、親和素和生物素的結合反應、核酸和轉錄因子的結合反應、細胞粘附因子的結合反應、糖鏈和蛋白質的結 合反應、脂肪鏈和蛋白質的結合反應、磷酸基和蛋白質的結合反應、輔助因子和蛋白質的結 合反應等。本發明使用固定有生物分子的載體(有時也稱之為微陣列)檢測生物分子的相互 作用，其特徵在於，在該檢測中，使用具備一端具有開口部另一端封閉的中空支架和固定有 微陣列且可插入中空支架的載體支撐構件的單元；通過將載體支撐構件插入到容納有反應 液的中空支架中，使微陣列和反應液接觸，使生物分子相互作用。一端具有開口部另一端封閉的中空支架只要是能容納反應液，則無特殊限制。中 空支架可以是單獨的支架，也可以使用多個連結得到的支架。中空支架可舉出本技術領域 中通常使用的微型管和微滴板(例如，96孔板)等。中空支架尺寸是本領域技術人員根據 用途可適當設定的，但可使用例如開口部的直徑在6 12mm的範圍，長度在15 35mm的 管狀物。中空支架中可容納含被螢光標記了的生物分子的檢體作為反應液，通過向其中插 入載體支撐構件，使載體和反應液接觸，使載體上的生物分子與反應液中被螢光標記了的 生物分子相互作用。反應液也可容納核酸擴增產物。在通過洗滌載體除去和載體上固定的 生物分子未發生相互作用的生物分子的洗滌工序中，也可在將洗滌液容納於中空支架、發 生相互作用後再將載體支撐構件插入其中進行洗滌。也可分別使用容納檢體作為反應液的 中空支架和容納洗滌液作為反應液的中空支架。在使載體上的生物分子與反應液中的被螢光標記了的生物分子發生相互作用的 相互作用工序中，優選通過加熱中空支架來加熱反應液。本發明中，在載體支撐構件被插入 至中空支架的姿勢下，通過載體支撐構件的後端部和中空支架開口部的邊緣相咬合，中空 支架被密封，因而可在抑制反應液蒸發的同時，有效加熱。有時，在加熱之際，一部分蒸發的 反應液會在密封中空支架的載體支撐構件後端部冷卻，從而形成液滴。因而，在相互作用工 序中，通過對載體支撐構件後端部也一起加熱，可抑制液滴的形成，防止微量的反應液減少 導致反應液中生物分子的濃度發生變化。相互作用工序中的加熱溫度為30 60°C，優選為 35 55°C，載體支撐構件後端部的加熱溫度也是一樣的。本發明中，在載體支撐構件被插入至中空支架的姿勢下，載體支撐構件的後端部 和中空支架開口部的邊緣咬合，載體支撐構件和中空支架被定位。例如，如圖1所示，通過 載體支撐構件12的後端部13和中空支架11的開口部的邊緣15咬合，載體支撐構件在中 空支架內被定位在規定的位置上(圖la)，如果載體支撐構件12的後端部13和中空支架 11的開口部的邊緣15沒有咬合，每次把載體支撐構件插入中空支架，中空支架內的載體支 撐構件的位置都會發生變化，不能定位在規定的位置上(圖16)。本發明中，載體支撐構件和中空支架構成如下在以載體支撐構件被插入到中空 支架的上述定位姿勢下，沿包括中空支架軸心的面切開的剖面圖中，由中空支架的內側和 固定有載體的載體支撐構件的外側所構成的面積，在載體支撐構件的自載體固定部至前端 部的區域，在軸心的左右是大致相同的。例如，圖2給出了以載體支撐構件被插入到中空支架的上述定位姿勢下，沿包括 中空支架軸心21的面切開的剖面圖的一個例子。在該剖面圖中，中空支架的內側和固定 有載體的載體支撐構件的外側所構成的面積中，載體支撐構件的自載體固定部至前端部M的區域的面積包括軸心左側22表示的部分的面積和軸心右側23表示的部分的面積。通過 以該22的面積和23的面積大致相同的方式構成載體支撐構件和中空支架，使左右的表面 張力相等，從而可使載體14和反應液充分接觸，而不會發生反應液的液面偏斜。圖加中， 22的面積和23的面積並非大致相同，所以反應液如虛線所示發生偏斜。而圖2b中，22的 面積和23的面積大致相同，所以反應液變為水性。所謂大致相同是指相差在20%以下、優 選在10%以下、更優選在5%以下。圖2給出了沿著包括中空支架軸心21的面切開的剖面 圖中將載體14切斷的剖面圖，因而，雖然並不是相對於中空支架的軸心成左右對稱，但對 於相對於中空支架的軸心成左右對稱的界面也是同樣的。即，對於任意包括中空支架軸心 的截面上述左右的面積都是大致相同。在優選的實施方式中，例如如圖3所示，載體支撐構件的載體固定部31是具有底 面32和側面33 (33a和33b)的凹部，載體14配置於凹部的底面32。更優選載體支撐構件 凹部31的至少後端部13側的側面33a是傾斜面。優選載體支撐構件凹部31的前端部M 側的側面3 也是傾斜面。通過使後端部一側的側面33a為傾斜面，在將載體支撐構件插入 到中空支架內的反應液時可能混入的氣泡容易逃逸到上部。此外，通過使該傾斜面的表面 粗糙度在10 μ m以下、優選在1 μ m以下，使傾斜面與底面所成的角度(圖3的34)在75° 以下、優選在45°以下，氣泡更容易逃逸。如果氣泡不能順利逃逸，則載體和反應液的接觸 將受到阻礙，也可能導致生物分子的相互作用在載體的一部分上受到阻礙，但通過使之成 為氣泡可順利逃逸的上述構成，載體和反應液可達到良好的接觸。優選在載體支撐構件上從凹部前端部一側的側面到前端部形成排液槽。例如如 圖4所示，通過在凹部前端部一側的側面3 至前端部M形成排液槽41，可有效地將從中 空支架內的反應液中提拉載體支撐構件時可能殘留在凹部的反應液排液。拉出載體支撐構 件後，通過使載體支撐構件的前端部M和濾紙接觸，可更有效地排液。本發明中，在生物 分子相互作用後，在除去和載體上固定的生物分子未發生相互作用的生物分子的洗滌工序 中，通過使用含易潮解物質的洗滌液，可不乾燥載體而直接對載體照射激發光，通過檢測器 檢測螢光。在生物分子的相互作用和洗滌中，由於使用了含鹽的溶液，所以如果幹燥載體， 則會產生鹽導致的乾燥不均現象，存在乾燥不均導致的散射光強，難於正確檢測的情況。特 別是在成像光學系的檢測器中，乾燥不均導致的散射光強，和掃描型檢測器相比，存在很難 正確檢測的情況，但如果使用含易潮解物質的洗滌液不進行乾燥就進行檢測，就可抑制幹 燥不均導致的光散射的發生。在不乾燥載體就進行檢測的方式中，載體支撐構件的凹部如 果積存液體，則也有可能產生檢測誤差，但通過設置排液槽，可迅速地將凹部殘留的多餘洗 滌液排液，可降低檢測誤差。易潮解物質只要是不妨礙生物分子的相互作用，則無特殊限制，但例如可舉出氯 化鎂、氯化鈣、氫氧化鎂等鹼土金屬鹽、碳酸鉀、溴化鈉等鹼金屬鹽等。洗滌液中易潮解物質 的濃度通常為0. 01 3. Omol/1、優選為0. 05 1. Omol/1、更優選為0. 2 0. 5mol/l。在本發明優選的方式中，在載體支撐構件被插入至中空支架的姿勢下，在載體支 撐構件的自載體固定部到前端部M側的區域，載體支撐構件的體積佔中空支架的容積的 比例為60%以上，優選為80%以上，更優選為90 95%。例如在圖5中，在載體支撐構件 被插入至中空支架的姿勢下，在載體支撐構件12的自載體固定部至前端部一側的區域(虛 線以下的區域)、即載體固定部的前端部一側末端處沿與中空支架11的軸心垂直的面切開的情況下，在不含載體固定部的一側，載體支撐構件的體積佔中空支架的容積的比例為上 述值。通過將載體支撐構件的自載體固定部至前端部一側設計得稍大，可在將載體支撐構 件插入到中空支架時，中空支架中容納的反應液為微量的情況下也可使液面上升而與載體 充分接觸。因而，可使操作之際的液體的量減少。此外，在載體支撐構件被插入至中空支架的姿勢下，載體支撐構件的體積佔中空 支架的容積的比例優選為25 70%，更優選為40 50%。通過使載體支撐構件的體積的 比例為一定的值以下，可防止載體支撐構件插入時液體溢出。本發明中使用的單元也可具有多個載體支撐構件和對應於各個支撐構件的多個 中空支架。多個載體支撐構件上分別固定有載體，優選載體支撐構件的後端部分別被固定 於表面材料，可作為整體進行工作。所謂具有對應於各個載體支撐構件的多個中空支架是 指載體支撐構件分別插入到多個中空支架上而構成的。通過使用分別固定有載體的多個載 體支撐構件和多個中空支架，可有效實施大量的試驗。本發明的檢測方法中，在通過洗滌載體除去與載體上固定的生物分子未發生相互 作用的生物分子的洗滌工序之後，實施對載體照射激發光，通過檢測器檢測螢光的檢測工序。本發明中，作為檢測器優選使用成像光學系的檢測器。成像光學系的檢測器是對 載體照射激發光，檢測得到的螢光的強度的檢測器。成像光學系的檢測器通常具備用於照 射激發光的雷射器、僅使目標波長的螢光通過的螢光過濾器、用於檢測通過螢光過濾器的 螢光的光檢測部(例如、CXD照相機)。本發明中，通常，通過雷射器向整個載體傾斜地照射 一次激發光，從載體的正面檢測螢光。所謂向載體傾斜地照射激發光是指載體表面和雷射 所成的角度小於90°，通常採用30 70°，優選採用40 60°的角度進行照射。在成像 光學系的檢測器中，沒有必要雷射掃描載體的整個表面，可在短時間內實施檢測。由於向載 體一次照射激發光，所以固定生物分子的載體使用尺寸比較小的載體、例如尺寸在IOmm以 下、優選在5mm以下、更優選在3mm以下的載體、最優選在1 5mm的四方載體。固定生物分子的載體材料可使用本領域公知的材料，無特殊限制。例如可舉出鉬、 鉬黑、金、鈀、銠、銀、汞、鎢和它們的化合物等貴金屬；石墨、碳纖維為代表的碳等的導電體 材料；單晶矽、非晶矽、碳化矽、氧化矽、氮化矽等為代表的矽材料、SOI (絕緣體上的矽)等 為代表的所述矽材料的複合材料；玻璃、石英玻璃、氧化鋁、藍寶石、陶瓷、鎂橄欖石、光敏玻 璃等無機材料；聚乙烯、乙烯、聚丙烯、環狀聚烯烴、聚異丁烯、聚對苯二甲酸乙二酯、不飽和 聚酯、含氟樹脂、聚氯乙烯、聚偏氯乙烯、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇、聚乙烯醇縮醛、丙烯酸樹 脂、聚丙烯腈、聚苯乙烯、縮醛樹脂、聚碳酸酯、聚醯胺、酚醛樹脂、脲醛樹脂、環氧樹脂、密胺 樹脂、苯乙烯·丙烯腈共聚物、丙烯腈· 丁二烯苯乙烯共聚物、聚苯醚和聚碸等有機材料等。本發明中，載體優選使用表面具有碳層和化學修飾基團的載體。表面具有碳層和 化學修飾基團的載體包括襯底表面具有碳層和化學修飾基團的載體和包括碳層的襯底表 面具有化學修飾基團的載體。襯底材料可使用本領域公知的材料，無特殊限制，可使用和上 述載體材料和同樣的材料。本發明適合使用具有微細平板狀結構的載體。具有微細平板狀結構的載體容易制 造，所以優選使用包含矽材料或樹脂材料的襯底，特別是更優選包括單晶矽的襯底表面具 有碳層和化學修飾基團的載體。單晶矽包括部分結晶軸的方向發生極小變化的襯底(有時也被稱之為鑲嵌晶體)、包含原子尺寸水平的混亂(晶格缺陷)的襯底。襯底上形成的碳層無特殊限制，但優選使用合成金剛石、高壓合成金剛石、天然金 剛石、軟金剛石(例如類金剛石碳)、非晶態碳、碳類物質(例如石墨、富勒烯、碳納米管)中 的任一個、它們的混合物、或它們層合而成的物質。此外，還可使用碳化鉿、碳化鈮、碳化矽、 碳化鉭、碳化釷、碳化鈦、碳化鈾、碳化鎢、碳化鋯、碳化鉬、碳化鉻、碳化釩等碳化物。此處， 所謂軟金剛石是所謂類金剛石碳(DLC =Diamond like Carbon)等作為金剛石和碳的混合體 的不完全金剛石結構體的總稱，其混合比例無特殊限制。碳層從化學穩定性優異，能夠耐受 其後的化學修飾基團的導入和生物分子的結合反應這一點，以及可藉助靜電結合和生物分 子結合所以其鍵具有柔軟性這一點來看，是有利的。此外，在和生物分子的結合反應中，非 特異性吸附少，從這一點看也是有利的。如前所述，襯底自身也可使用包括碳層的載體。本發明中，碳層的形成可採用公知的方法進行。例如可舉出微波等離子體CVD (化 學氣相沉積)法、ECRCVD(電子迴旋共振化學氣象沉積)法、ICP(電感耦合等離子體)法、直 流濺射法、ECR(電子迴旋共振)濺射法、離子化蒸鍍法、電弧式蒸鍍法、雷射蒸鍍法、EB (電 子束)蒸鍍法、電阻加熱蒸鍍法等。高頻等離子CVD法利用因高頻而在電極間產生的輝光放電來分解原料氣體(甲 烷)，在襯底上合成DLC(類金剛石碳)層。離子化蒸鍍法利用鎢絲生成的熱電子分解並離 子化原料氣體(苯)，根據偏壓在襯底上形成碳層。也可在1 99體積％的氫氣和其餘為 99 1體積％的甲烷氣體構成的混合氣體中採用離子化蒸鍍法形成DLC層。電弧式蒸鍍法通過在固體石墨材料(陰極蒸發源)和真空容器(陽極)之間施加 直流電壓在真空中引發電弧放電，以從陰極產生碳原子的等離子體，對襯底施加比蒸發源 更負的偏壓，可使等離子體中的碳離子向襯底加速，形成碳層。雷射蒸鍍法通過向石墨靶板照射例如Nd: YAG雷射(脈衝震蕩)使之熔融，在玻璃 襯底上堆積碳原子，可形成碳層。在襯底的表面形成碳層的情況下，碳層的厚度通常是單分子層 100 μ m左右，過 薄則底層襯底的表面有可能局部露出，相反如果過厚將導致生產性變差，所以優選2nm Iym,更優選 5nm 500nmo通過向形成有碳層的襯底的表面導入化學修飾基團，可將生物分子牢固地固定在 載體上。導入的化學修飾基團本領域技術人員可適當選擇，無特殊限制，但例如可舉出氨 基、羧基、環氧基、甲醯基、羥基、金屬螯合物和活性酯基。氨基的導入例如可通過將碳層置於氨氣中照射紫外線或通過進行等離子體處理 來實施。或者，可通過將碳層置於氯氣中照射紫外線以進行氯化，再在氨氣中照射紫外線來 實施。或者，也可通過在亞甲二胺、乙二胺等多元胺類氣體中使之和氯化了的碳層反應來實 施。羧基的導入例如可通過使如前所述氨基化的碳層與適當的化合物反應來實施。為 導入羧基而使用的化合物可舉出式A-Ri-COOiK式中、X表示滷原子、R1表示碳數10 12 的2價的烴基。)表示的滷代羧酸、例如氯代醋酸、氟代醋酸、溴代醋酸、碘代醋酸、2-氯丙 酸、3-氯丙酸、3-氯丙烯酸、4-氯苯甲酸；式H00C-R2-C00H(式中、R2表示單鍵或碳數1 12的2價的烴基。)表示的二羧酸、例如草酸、丙二酸、琥珀酸、馬來酸、富馬酸、鄰苯二甲酸； 聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、偏苯三酸、丁烷四羧酸等的多元羧酸；式R3-CO-R4-COOH(式中、10R3表示氫原子或碳數1 12的2價的烴基，R4表示碳數1 12的2價的烴基。)所示的 酮酸或醛酸；式=X-OC-R5-COOH(式中、X表示滷原子，R5表示單鍵或碳數1 12的2價的 烴基。)所示的二羧酸的單醯滷、例如琥珀酸單醯氯、丙二酸單醯氯；鄰苯二甲酸酐、琥珀酸 酐、草酸酐、馬來酸酐、丁烷四羧酸酐等酸酐。環氧基的導入例如可通過使如上所述氨基化的碳層與適當的多元環氧化合物反 應來實施。或者，可通過使碳層含有的碳碳雙鍵和有機過酸反應來得到。有機過酸可舉出 過氧乙酸、過氧苯甲酸、二過氧化苯二甲酸、過氧甲酸、三氟過氧乙酸等。甲醯基的導入例如可通過使如前所述氨基化的碳層和戊二醛反應來實施。羥基的導入例如可通過使如前所述氯化的碳層和水反應來實施。活性酯基是指在酯基的醇一側具有酸度高的吸電子基以活化親核反應的酯組、即 反應活性高的酯基。其在酯基的醇一側具有吸電子基，是與烷基酯相比被進一步活化的酯 基。活性酯基對氨基、巰基、羥基等基團具有反應性。更具體而言，苯酚酯類、硫酚酯類、N-羥 基胺酯類、氰基甲基酯、雜環羥基化合物的酯類等是已知具有比烷基酯等遠高的活性的活 性酯基。更具體而言，活性酯基例如可舉出對硝基苯基、N-羥基琥珀醯亞氨基、琥珀醯亞氨 基、鄰苯二甲醯亞氨基、5-降冰片烯-2，3_二羧基醯亞氨基等，特別優選使用N-羥基琥珀醯 亞氨基。活性酯基的導入例如可通過採用氰胺或碳二亞胺(例如、1-[3_( 二甲基氨基)丙 基]-3-乙基碳二亞胺)等脫水縮合劑和N-羥基琥珀醯亞胺等化合物對如前所述導入的羧 基進行活性酯化來實施。通過該處理可介由醯胺鍵在烴基的末端形成結合有N-羥基琥珀 醯亞氨基等活性酯基的基團(特開2001-139532)。在將DNA和RNA等核酸固定的情況下，優選導入氨基、環氧基、碳二亞氨基、甲醯基 或活性酯基。在將多肽固定的情況下，優選導入氨基、碳二亞氨基、環氧基、甲醯基、金屬螯 合物或活性酯基。使用導入了金屬螯合物的載體，可有效且穩定地將聚組氨酸序列等的金 屬離子和親和性的具有標記的多肽固定。本發明的在載體上固定生物分子的方法無特殊限制。例如可通過將生物分子溶解 到緩衝液中配製溶液，在其中浸漬如上所述的載體，由此在載體表面固定生物分子。浸漬通 常在0 98°C、優選4°C 50°C下一般進行1分 M小時、優選10分 1小時。此時，通 過在浸漬一定時間後洗滌載體，可除去沒有被固定的生物分子。此外，通過使用被稱為點樣 器(spotter)的裝置，可將多種生物分子固定在載體的表面。在使用點樣器的情況下，例如 使用點樣器將生物分子溶液點樣到載體上後，在加熱的烘箱中烘烤一定時間，然後洗滌除 去沒有固定的分子。通過使用點樣器裝置可將其他種類的生物分子固定到載體上的不同位 置上，所以可一次實施多個試驗。實施例下面，使用實施例更詳細地說明本發明，但本發明的技術範圍不受下述實施例的 限制。實施例1將圖1的a和b所示的載體支撐構件插入到裝有反應液的中空支架中。結果分別 如圖6的a和b所示。圖6a中，通過載體支撐構件的後端部和中空支架開口部的邊緣咬 合，定位成載體支撐構件被插入到中空支架的中央部，結果，反應液的液面水平，載體和反應液接觸。圖6b中，由於載體支撐構件的後端部和中空支架開口部的邊緣沒有咬合，所以 載體支撐構件以在中空支架內偏右側的方式被插入，結果由於表面張力導致反應液的液面 傾斜，產生載體和反應液不接觸的部分。實施例2在3mm見方的矽襯底上使用離子化蒸鍍法按下述條件進行2層的DLC層的制膜。第1層第2層原料氣體CH44. 7547. 5(sscm)H20. 252. 5(sscm)工作壓力3. 08. 0(Pa)基板偏壓直流電壓500500(V)高頻輸出100-(W)陽極電壓5050(V)燈絲電壓77(V)電流2222(A) 在得到的表面上具有DLC層的矽襯底上按照下述條件使用氨等離子導入氨基。原料氣體NH330(sscm)工作壓力8. 0(sscm)基板偏壓直流電壓500(Pa)高頻輸出-(W)陽極電壓50(V)燈絲電壓7(V)電流22(A)在含有140mM琥珀酸酐和0. IM硼酸鈉的1_甲基_2_吡咯烷酮溶液中浸漬30分 鍾，導入羧基。在含有0. IM磷酸鈣緩衝液、0. IM 1-[3-( 二甲基氨基)丙基]-3-乙基碳二 亞胺、20mM N-羥基琥珀醯亞胺的溶液中浸漬30分鐘，進行活化，得到在矽襯底表面上具有 DLC層和作為化學修飾基團的N-羥基琥珀醯亞氨基的載體。將DNA探針用Sol. 6 (東洋鋼板制)溶解成10 μ Μ,點樣在載體上。在80°C烘烤1 小時，用2XSSC/0.2% SDS洗滌後，用超純水洗滌，離心乾燥，從而將DNA探針固定到載體 上。和上述探針雜交的區域用PCR擴增。標記使用CyDye進行。PCR溶液的組成如下。將 得到的PCR產物30 μ 1溶解到雜交溶液GXSSC/0. 2% SDS溶液)30 μ 1中，配製試樣。將 試樣50 μ 1加入到圖7c所示的中空支架中。在圖7a和b所示的載體支撐構件上分別固定 上述得到的固定有DNA探針的載體，分別插入到裝有試樣的中空支架中。圖7a所示的載體 支撐構件具有排液槽，而圖7b所示的載體支撐構件不具有排液槽。插入載體支撐構件後， 在55°C反應2分鐘，用2 X SSC/0. 2% SDS洗滌1次，用IN醋酸鈉/0. 5%吐溫20洗滌1次， 用IN MgCl2A). 5%吐溫20洗滌1次。使用冷卻CXD照相機，介由螢光過濾器(Cy5用、工F ^ > K公司制)檢測載體上相互作用了的生物分子的螢光標記。使用Φ 5mm的雷射(640nm 波長)對載體表面以50°的角度照射激發光。結果如圖8所示。使用具有排液槽的載體支撐構件(圖7a)時，液體不能在載體固定部積存，可良好 地進行檢測(圖8a)。而使用不具有排液槽的載體支撐構件(圖7b)時，可觀察到一部分的液體積存(圖8b)。實施例3以被插入至中空支架的姿勢，將載體支撐構件的體積佔中空支架的容積的比例為 80%的載體支撐構件(圖9a)和50%的載體支撐構件(圖9b)分別插入到容納有反應液的 中空支架中。可知，在圖9a的情況下，插入時有氣泡生成，而在圖9b的情況下，插入時不生 成氣泡，反應液和載體的接觸良好。本說明書中引用的全部的出版物、專利和專利申請全都作為參考直接引入本說明 書中。符號說明11 中空支架、12 載體支撐構件、13 載體支撐構件的後端部、14 載體、15 中空 支架開口部、21 中空支架軸心、24 載體支撐構件的前端部、31 載體固定部、32 載體固定 部的底面、33 載體固定部的側面(傾斜面)、34 底面與側面(傾斜面)所成的角度、41 排液槽。
權利要求
1.單元，所述單元是在使用固定有生物分子的載體檢測生物分子的相互作用中使用的 單元，其中，具備一端具有開口部另一端封閉的中空支架和固定有載體的可插入中空支架的載體 支撐構件，所述載體固定有生物分子，在載體支撐構件被插入至中空支架的姿勢下，載體支撐構件的後端部和中空支架開口 部的邊緣咬合，由此中空支架被密封，同時，載體支撐構件和中空支架被定位，在以定位姿勢沿包括中空支架軸心的面切開的剖面圖中，由中空支架的內側和固定有 載體的載體支撐構件的外側所構成的面積在載體支撐構件的自載體固定部至前端部的區 域，在軸心的左右是大致相同的。
2.權利要求1所述的單元，其中，載體支撐構件中的載體固定部是具有底面和側面的 凹部，載體被配置於凹部的底面。
3.權利要求2所述的單元，其中，載體支撐構件凹部的至少後端部一側的側面是傾斜
4.權利要求3所述的單元，其中，傾斜面的表面粗糙度在10μ m以下，傾斜面與底面所 成的角度在75°以下。
5.權利要求2 4任一項所述的單元，其中，在載體支撐構件凹部的自前端部一側的側 面至前端部形成有排液槽。
6.權利要求1 5任一項所述的單元，其中，在載體支撐構件被插入至中空支架的姿勢 下，在載體支撐構件的自載體固定部至前端部一側的區域，載體支撐構件的體積佔中空支 架容積的比例為60%以上。
7.權利要求1 6任一項所述的單元，其中，在載體支撐構件被插入至中空支架的姿勢 下，載體支撐構件的體積佔中空支架容積的比例為25 70%。
8.權利要求1 7任一項所述的單元，其中，具有分別固定有載體的多個載體支撐構 件，載體支撐構件的後端部分別被固定於表面材料，具有對應於各個支撐構件的多個中空 支架。
9.使用固定有生物分子的載體檢測生物分子的相互作用的方法，包括下述工序將固定有生物分子的載體固定於載體支撐構件，將該載體支撐構件插入到一端具有開 口另一端封閉的容納有反應液的中空支架中，由此使載體上生物分子與反應液中已被螢光 標記的生物分子進行相互作用的相互作用工序；通過洗滌載體除去沒有和載體上固定的生物分子發生相互作用的生物分子的工序；對載體照射激發光，通過檢測器檢測螢光的檢測工序；在載體支撐構件被插入至中空支架的姿勢下，載體支撐構件的後端部和中空支架開口 部的邊緣咬合，由此中空支架被密封，同時，載體支撐構件和中空支架被定位，在以所述定位姿勢沿包括中空支架軸心的面切開的剖面圖中，由中空支架的內側和固 定有載體的載體支撐構件的外側所構成的面積在載體支撐構件的自載體固定部至前端部 的區域，在軸心的左右是大致相同的。
10.權利要求9所述的方法，其中，載體支撐構件中的載體固定部是具有底面和側面的 凹部，載體被配置於凹部的底面。
11.權利要求10所述的方法，其中，載體支撐構件凹部的至少後端部一側的側面是傾斜面。
12.權利要求11所述的方法，其中，傾斜面的表面粗糙度在IOym以下，傾斜面與底面 所成的角度在75°以下。
13.權利要求10 12任一項所述的方法，其中，在載體支撐構件凹部的自前端部一側 的側面至前端部形成排液槽。
14.權利要求9 13任一項所述的方法，其中，在載體支撐構件被插入至中空支架的姿 勢下，在載體支撐構件的自載體固定部至前端部一側的區域，載體支撐構件的體積佔中空 支架容積的比例為60%以上。
15.權利要求9 14任一項所述的方法，其中，在載體支撐構件被插入至中空支架的姿 勢下，載體支撐構件的體積佔中空支架容積的比例為25 70%。
16.權利要求9 15任一項所述的方法，其中，具有分別固定有載體的多個載體支撐構 件，載體支撐構件的後端部分別被固定於表面材料，具有對應於各個支撐構件的多個中空 支架。
全文摘要
本發明涉及一種單元，所述單元是用於在使用固定有生物分子的載體檢測生物分子的相互作用中使用的單元，其具備一端具有開口部另一端封閉的中空支架和固定有載體的可插入中空支架的載體支撐構件，所述載體固定有生物分子，在載體支撐構件被插入至中空支架的姿勢下，載體支撐構件的後端部和中空支架開口部的邊緣咬合，由此中空支架被密封，同時，載體支撐構件和中空支架被定位，在以定位姿勢沿包括中空支架軸心的面切開的剖面圖中，由中空支架的內側和固定有載體的載體支撐構件的外側所構成的面積在載體支撐構件的自載體固定部至前端部的區域，在軸心的左右是大致相同的。
文檔編號G01N37/00GK102047122SQ200980119720
公開日2011年5月4日 申請日期2009年5月26日 優先權日2008年5月29日
發明者丹花通文, 山野博文, 龜井修一 申請人:東洋鋼鈑株式會社