一組酮胺氧化酶及其編碼基因和應用的製作方法

2024-01-20 11:11:15

一組酮胺氧化酶及其編碼基因和應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一組酮胺氧化酶及其編碼基因和應用。本發明提供的酮胺氧化酶是如下（a）至（p）中的任意一種：（a）序列3第1至438位組成的蛋白質；（b）序列3所示蛋白質；（c）序列5第1至438位組成的蛋白質；（d）序列5所示蛋白質；（e）序列7第1至438位組成的蛋白質；（f）序列7所示蛋白質；（g）序列9第1至438位組成的蛋白質；（h）序列9所示蛋白質；（i）序列11第1至438位組成的蛋白質；（j）序列11所示蛋白質；（k）序列13第1至438位組成的蛋白質；（l）序列13所示蛋白質；（m）序列15第1至438位組成的蛋白質；（n）序列15所示蛋白質；（o）序列17第1至438位組成的蛋白質；（p）序列17所示蛋白質。與現有的酮胺氧化酶相比，本發明提供的各個酮胺氧化酶的酶活性大大提高，具有重大的應用價值。
【專利說明】—組酮胺氧化酶及其編碼基因和應用
【技術領域】
[0001]本發明涉及一組酮胺氧化酶及其編碼基因和應用。
【背景技術】
[0002]美拉德反應，又稱為非酶催化糖基化反應，是一類自然界常見的反應。還原糖(最常見的是葡萄糖)與氨基化合物在常溫或是高溫下發生反應，生成Amadori產物，並進一步交聯得到高級糖基化終產物以及類黑素類物質。該反應在食品的加工和儲存過程中發揮著重要的作用，對食品的色澤，風味和營養成分等都有重要的影響。近年來的研究發現，在生物體內也存在美拉德反應，反應的產物與人類的衰老，糖尿病併發症等病症有密切的關係，從而受到廣泛的關注。
[0003]酮胺氧化酶( fructosylamine oxidases,縮寫為FAOXs)是一類存在於微生物體內的去糖基化酶，可以催化降解Amadori產物，通常生成氨基化合物、葡糖醛酮和過氧化氫。在該酶發現之初，最先應用於糖尿病的檢測，目前基於FAOXs的檢測已經成為糖尿病檢測和診斷中的一項「金指標」。同時，這類蛋白酶在食品質量控制，洗滌劑添加劑以及糖尿病治療等方面也展現出了巨大的應用前景。但是，目前已知的酮胺氧化酶都只能作用於小分子底物，如糖基化胺基酸或是糖基化二肽，這也極大地限制了該酶的應用。
[0004]來源於煙麴黴Aspergillus fumigatus 的酮胺氧化酶 AmadoriaseII於1997年首次被分離，可以直接作用於一種較大分子量的底物糖基化金剛烷胺(fructosyl-adamantanamine)。該酶的晶體結構在2008年被報導，晶體結構顯示，在該酶表面有兩個柔性的Loop區域(胺基酸殘基序列自N末端第58-66位的殘基區域以及第110-119位的殘基區域)，位於底物通道入口附近，在底物結合過程起到重要作用。

【發明內容】

[0005]本發明的目的是提供一組酮胺氧化酶及其編碼基因和應用。
[0006]本發明提供了一組酮胺氧化酶，是如下(a)至(P)中的任意一種:(a)由序列表中序列3自N末端第I至438位胺基酸殘基組成的蛋白質；(b)由序列表中序列3所示的胺基酸殘基組成的蛋白質；(c)由序列表中序列5自N末端第I至438位氣基酸殘基組成的蛋白質；(d)由序列表中序列5所不的氣基酸殘基組成的蛋白質；Ce)由序列表中序列7自N末端第I至438位氣基酸殘基組成的蛋白質；(f)由序列表中序列7所不的氣基酸殘基組成的蛋白質；(g)由序列表中序列9自N末端第I至438位氣基酸殘基組成的蛋白質；(h)由序列表中序列9所示的胺基酸殘基組成的蛋白質；(i)由序列表中序列11自N末端第I至438位氣基酸殘基組成的蛋白質；(j)由序列表中序列11所不的氣基酸殘基組成的蛋白質；(k)由序列表中序列13自N末端第I至438位氣基酸殘基組成的蛋白質；(I)由序列表中序列13所示的胺基酸殘基組成的蛋白質；(m)由序列表中序列15自N末端第I至438位氣基酸殘基組成的蛋白質；(η)由序列表中序列15所不的氣基酸殘基組成的蛋白質；(ο)由序列表中序列17自N末端第I至438位胺基酸殘基組成的蛋白質；(P)由序列表中序列17所不的氣基酸殘基組成的蛋白質。
[0007]編碼所述酮胺氧化酶的基因也屬於本發明的保護範圍。所述基因為如下I)至26)中任一所述的DNA分子:1)編碼區如序列表中序列4自5』末端第I至1314位核苷酸所示的DNA分子；2)編碼區如序列表中序列4自5』末端第I至1344位核苷酸所示的DNA分子；
3)編碼區如序列表中序列4所示的DNA分子；4)編碼區如序列表中序列6自5』末端第I至1314位核苷酸所示的DNA分子；5)編碼區如序列表中序列6自5』末端第I至1344位核苷酸所不的DNA分子；6)編碼區如序列表中序列6所不的DNA分子；7)編碼區如序列表中序列8自5』末端第I至1314位核苷酸所示的DNA分子；8)編碼區如序列表中序列8自5』末端第I至1344位核苷酸所示的DNA分子；9)編碼區如序列表中序列8所示的DNA分子；10)編碼區如序列表中序列10自5』末端第I至1314位核苷酸所示的DNA分子；11)編碼區如序列表中序列10自5』末端第I至1344位核苷酸所示的DNA分子；12)編碼區如序列表中序列10所示的DNA分子；13)編碼區如序列表中序列12自5』末端第I至1314位核苷酸所示的DNA分子；14)編碼區如序列表中序列12自5』末端第I至1344位核苷酸所示的DNA分子；15)編碼區如序列表中序列12所示的DNA分子；16)編碼區如序列表中序列14自5』末端第I至1314位核苷酸所示的DNA分子；17)編碼區如序列表中序列14自5』末端第I至1344位核苷酸所示的DNA分子；18)編碼區如序列表中序列14所示的DNA分子；19)編碼區如序列表中序列16自5』末端第I至1314位核苷酸所示的DNA分子；20)編碼區如序列表中序列16自5』末端第I至1344位核苷酸所示的DNA分子；21)編碼區如序列表中序列16所示的DNA分子；22)編碼區如序列表中序列18自5』末端第I至1314位核苷酸所示的DNA分子；23)編碼區如序列表中序列18自5』末端第I至1344位核苷酸所不的DNA分子；24)編碼區如序列表中序列18所不的DNA分子；25)在嚴格條件下與I)至24)中任一限定的DNA序 列雜交且編碼所述蛋白質的DNA分子；26)與I)至24)中任一限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼所述蛋白質的DNA分子。上述嚴格條件可為在6 X SSC, 0.5%SDS 的溶液中，在 65。C 下雜交，然後用 2XSSC、0.1%SDS 和 I X SSC,0.1%SDS各洗膜一次。
[0008]含有所述基因的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌均屬於本發明的保護範圍。可用現有的表達載體構建含有所述基因的重組表達載體。所述表達載體還可包含外源基因的3』端非翻譯區域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導聚腺苷酸加入到mRNA前體的3』端。使用所述基因構建重組表達載體時，在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型啟動子或組成型啟動子，它們可單獨使用或與其它啟動子結合使用；此外，使用本發明的基因構建重組表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉錄增強子，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區域可以來自轉錄起始區域或結構基因。所述的重組載體具體可為將所述基因插入pEAS-la質粒的多克隆位點得到的重組質粒。所述重組菌具體可為將所述重組載體導入大腸桿菌BL21得到的重組菌。
[0009]本發明還保護所述蛋白質在製備酮胺氧化酶中的應用。本發明還保護所述蛋白質在降解糖基化底物中的應用。所述糖基化底物具體可為糖基化多聚賴氨酸或糖基化金剛烷胺。本發明還保護所述重組菌在生產所述蛋白質中的應用。[0010]應用所述重組菌製備所述蛋白質時，可採用如下方法:將所述重組菌進行發酵，收集發酵產物，發酵產物中即含有所述蛋白質。所述方法具體包括如下步驟:(I)將所述重組菌培養至OD6tltlnm為0.5時加入IPTG並使其濃度為0.5mM,繼續30°C、250rpm培養6小時，收集菌體；(2)將步驟(1)得到的菌體進行超聲破碎，收集上清液；(3)將步驟(2)得到的上清液上樣於結合Ni2+的HiTrapTM Chelating HP柱，先用洗脫液甲(含500mM氯化鈉和30mM咪唑的20mM磷酸鈉緩衝液，pH7.4)去除雜蛋白，然後用洗脫液乙(含500mM氯化鈉和400mM咪唑的20mM磷酸鈉緩衝液，pH7.4)洗脫目的蛋白，收集洗脫液乙的過柱後溶液，即為含有所述蛋白質的溶液。
[0011] 本發明還保護所述蛋白質作為酮胺氧化酶的應用。
[0012]與現有的酮胺氧化酶相比，本發明提供的各個酮胺氧化酶的酶活性大大提高，具有重大的應用價值。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0013]圖1為重組質粒pEAS-la-CT-AMAII的結構示意圖。
【具體實施方式】
[0014]以下的實施例便於更好地理解本發明，但並不限定本發明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設置三次重複實驗，結果取平均值。
[0015]pUC18-cI857/pR-SRRz_rrnB質粒，簡稱pEAS-la質粒，是一種熱誘導自裂解質粒。提及 pUC18-cI857/pR-SRRz-rrnB 質粒的參考文獻:Xu, L., et al., Heat-1nducibleautolyticvector for high-throughput screening.BioTechniques, 2006.41(3):p.319-322.。
[0016]大腸桿菌BL21:購自 Novagen。
[0017]野生型酮胺氧化酶AmadoriaseII由序列表的序列I自N末端第I至438位胺基酸殘基組成。野生型酮胺氧化酶AmadoriaseII基因的編碼區如序列表的序列2自5』末端第I至1314位核苷酸所示。
[0018]實施例1、重組質粒的構建
[0019]一、重組質粒 pEAS-la-CT-AMAII 的構建
[0020]1、合成序列表的序列2自5』末端第I至1314位核苷酸所示的雙鏈DNA分子。
[0021]2、將步驟I合成的雙鏈DNA分子作為模板，用AMA-for和CT_AMA-rev組成的引物對，採用高保真的De印Vent' DNA聚合酶進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。
[0022]AMA-for:5』 -AGAGGGATCCGATGGCGGTAACCAAGTCA-3，(其中下劃線部分為 BamHI 內切酶識別位點)；
[0023]CT-AMA-rev:
[0024]5，-ATTCCTGCAGTTA |；Τ(；(；Τ(；(；?(；(；Τ(；(；Τ(；(?Τ(| GGAAGCAGCTCCTAACTTGGAAATATCTC-3，
(其中下劃線部分為PstI內切酶識別位點，方框內是HiS6S籤的編碼序列，粗體表示連接肽)。[0025]3、用限制性內切酶BamHI和Pst I雙酶切步驟2的PCR擴增產物，回收酶切產物。
[0026]4、用限制性內切酶BamHI和PstI雙酶切pEAS_la質粒，回收約5400bp的載體骨架。
[0027]5、將步驟3的酶切產物和步驟4的載體骨架連接，得到重組質粒pEAS-la-CTAMAII(野生型酮胺氧化酶AmadoriaseII基因的表達載體)。根據測序結果，對重組質粒pEAS-la-CT-AMAII進行結構描述如下:在pEAS-la質粒的BamHI和PstI酶切位點之間插入了序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子。重組質粒pEAS-la-CTAMAII的結構示意圖見圖1o
[0028]二、重組質粒 pEAS-la-CT-AMAII (V113F)的構建
[0029]1、以重組質粒pEAS-la-CT-AMAII為模板，用ΕΡ-for和V113F_rev組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。
[0030]EP-for:5』-TTACGAATTCGAGCTCGGTACCCG-3』 ；
[0031 ] V113F-rev:5』 -CCGGGCCTAAAACGGACTCCAAGGCGGTCCA-3，。
[0032]2、以重組質粒pEAS-la-CT-AMAII為模板，用V113F_for和ΕΡ-rev組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。
[0033]V113F-for: 5』 -GGAGTCCGTTTTAGGCCCGGTGAGGACCCCAACCTT-3』 ；
[0034]EP-rev:5』-ACGGCCAGTGCCAAGCTTGCATGCCT-3』。
[0035]3、同時將步驟I的PCR擴增產物和步驟2的PCR擴增產物作為模板，用EP-for和EP-rev組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。
[0036]EP-for和EP-rev分別對應於重組質粒pEAS-la-CT-AMAII中序列2所示雙鏈DNA分子的上遊和下遊。
[0037]4、用限制性內切酶BamHI和PstI雙酶切步驟3的PCR擴增產物，回收酶切產物。
[0038]5、用限制性內切酶BmHI和PstI雙酶切pEAS_la質粒，回收約5400bp的載體骨架。
[0039]6、將步驟4的酶切產物和步驟5的載體骨架連接，得到重組質粒pEAS-la-CT-AMAII (V113F)。根據測序結果，對重組質粒 pEAS-la-CT-AMAII (V113F)進行結構描述如下:在pEAS-la質粒的BamHI和PstI酶切位點之間插入了序列表的序列4所示的雙鏈DNA分子。與序列表的序列2相比，序列表的序列4的差異僅在於將序列表的序列2所示雙鏈DNA分子自5』末端第337-339位核苷酸由「gtc」突變為了「TTT」。序列表的序列4所示的DNA分子編碼序列表的序列3所示的蛋白質。與序列表的序列I相比，序列表的序列3的差異僅在於將序列表的序列I自N末端第113位胺基酸殘基由「V」突變為了「F」。將序列表的序列3自N末端第I至438位胺基酸殘基組成的蛋白質命名為V113F型酮胺氧化酶AmadoriaseII。
[0040]三、重組質粒pEAS-la-CT-AMAII (R112F-V113F)的構建
[0041]1、以重組質粒 pEAS-la-CT-AMAII 為模板，用 EP-for 和 R112F_V113F_rev 組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。
[0042]EP-for: 5』-TTACGAATTCGAGCTCGGTACCCG-3』 ；
[0043]R112F-V113F-rev:5』 -GGTCCTCACCGGGCCTAAAAAAGACTCCAAGGCGGTCCA-3』。
[0044]2、以重組質粒 pEAS-la-CT-AMAII 為模板，用 R112F_V113F-for 和 EP-rev 組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。[0045]R112F-V113F-for: 5』 -TTGGACCGCCTTGGAGTCTTTTTTAGGCCCGGTGAGGA-3』 ；
[0046]EP-rev:5』-ACGGCCAGTGCCAAGCTTGCATGCCT-3』。
[0047]3、同時將步驟I的PCR擴增產物和步驟2的PCR擴增產物作為模板，用EP-for和EP-rev組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。
[0048]4、用限制性內切酶BamHI和PstI雙酶切步驟3的PCR擴增產物，回收酶切產物。
[0049]5、用限制性內切酶BamHI和PstI雙酶切pEAS-la質粒，回收約5400bp的載體骨架。
[0050]6、將步驟4的酶切產物和步驟5的載體骨架連接，得到重組質粒pEAS-la-CT-AMAII (R112F-V113F)。根據測序結果，對重組質粒 pEAS-la-CT-AMAII(R112F-V113F)進行結構描述如下:在pEAS-la質粒的BamHI和PstI酶切位點之間插入了序列表的序列6所示的雙鏈DNA分子。與序列表的序列2相比，序列表的序列6的差異僅在於將序列表的序列2所示雙鏈DNA分子自5』末端第334-339位核苷酸由「cgt gtc」突變為了 「TTT T TT」。序列表的序列6所示的DNA分子編碼序列表的序列5所示的蛋白質。與序列表的序列I相比，序列表的序列5的差異僅在於將序列表的序列I自N末端第112位胺基酸殘基由「R」突變為了 「F」，第113位胺基酸殘基由「V」突變為了 「F」。將序列表的序列5自N末端第I至438位胺基酸殘基組成的蛋白質命名為R112F-V113F型酮胺氧化酶AmadoriaseII ο
[0051]四、重組質粒pEAS-la-CT-AMAII (R112V-V113F)的構建
[0052]1、以重組質粒 pEAS-la-CT-AMAII 為模板，用 EP-for 和 R112V_V113F_rev 組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。
[0053]EP-for: 5』-TTACGAATTCGAGCTCGGTACCCG-3』 ；
[0054]R112V-V113F-rev:5』 -GGTCCTCACCGGGCCTAAACACGACTCCAAGGCGGTCCA-3』。
[0055]2、以重組質粒 pEAS-la-CT-AMAII 為模板，用 R112V_V113F-for 和 EP-rev 組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。
[0056]R112V-V113F-for: 5』 -TTGGACCGCCTTGGAGTCGTGTTTAGGCCCGGTGAGGA-3』 ；
[0057]EP-rev:5』-ACGGCCAGTGCCAAGCTTGCATGCCT-3』。
[0058]3、同時將步驟I的PCR擴增產物和步驟2的PCR擴增產物作為模板，用EP-for和EP-rev組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。
[0059]4、用限制性內切酶BamHI和PstI雙酶切步驟3的PCR擴增產物，回收酶切產物。
[0060]5、用限制性內切酶BamHI和Pst I雙酶切pEAS_la質粒，回收約5400bp的載體骨架。
[0061]6、將步驟4的酶切產物和步驟5的載體骨架連接，得到重組質粒pEAS-la-CT-AMAII (R112V-V113F)。根據測序結果，對重組質粒 pEAS-la-CT-AMAII(R112V-V113F)進行結構描述如下:在pEAS-la質粒的BamH I和PstI酶切位點之間插入了序列表的序列8所示的雙鏈DNA分子。與序列表的序列2相比，序列表的序列8的差異僅在於將序列表的序列2所示雙鏈DNA分子自5』末端第334-339位核苷酸由「cgt gtc」突變為了「GTG TTT」。序列表的序列8所不的DNA分子編碼序列表的序列7所不的蛋白質。與序列表的序列I相比，序列表的序列7的差異僅在於將序列表的序列I自N末端第112位胺基酸殘基由「R」突變為了 「V」，第113位胺基酸殘基由「V」突變為了 「F」。將序列表的序列7自N末端第I至438位胺基酸殘基組成的蛋白質命名為R112V-V113F型酮胺氧化酶AmadoriaseII ο
[0062] 五、重組質粒pEAS-la-CT-AMAII (R112W-V113F)的構建
[0063]1、以重組質粒 pEAS-la-CT-AMAII 為模板，用 EP-for 和 R112W-V113F - rev 組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。
[0064]EP-for: 5』-TTACGAATTCGAGCTCGGTACCCG-3』 ；
[0065]R112W-V113F - rev:5』-GGTCCTCACCGGGCCTAAACCAGACTCCAAGGCGGTCCA-3』。
[0066]2、以重組質粒 pEAS-la-CT-AMAII 為模板，用 R112W_V113F-for 和 EP-rev 組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。
[0067]R112ff-V113F-for: 5』 -TTGGACCGCCTTGGAGTCTGGTTTAGGCCCGGTGAGGA-3』 ；
[0068]EP-rev:5』-ACGGCCAGTGCCAAGCTTGCATGCCT-3』。
[0069]3、同時將步驟I的PCR擴增產物和步驟2的PCR擴增產物作為模板，用EP-for和EP-rev組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。
[0070]4、用限制性內切酶BamHI和PstI雙酶切步驟3的PCR擴增產物，回收酶切產物。
[0071]5、用限制性內切酶BamHI和PstI雙酶切pEAS_la質粒，回收約5400bp的載體骨架。
[0072]6、將步驟4的酶切產物和步驟5的載體骨架連接，得到重組質粒pEAS-la-CTAMAII(R112W-V113F)。根據測序結果，對重組質粒pEAS-la-CT-AMAII (R112W-V113F)進行結構描述如下:在pEAS-la質粒的BamHI和PstI酶切位點之間插入了序列表的序列10所示的雙鏈DNA分子。與序列表的序列2相比，序列表的序列10的差異僅在於將序列表的序列2所示雙鏈DNA分子自5』末端第334-339位核苷酸由「cgt gtc」突變為了 「TGG TTT」。序列表的序列10所不的DNA分子編碼序列表的序列9所不的蛋白質。與序列表的序列I相t匕，序列表的序列9的差異僅在於將序列表的序列I自N末端第112位胺基酸殘基由「R」突變為了 「W」，第113位胺基酸殘基由「V」突變為了 「F」。將序列表的序列9自N末端第I至438位胺基酸殘基組成的蛋白質命名為R112W-V113F型酮胺氧化酶AmadoriaseII。
[0073]六、重組質粒pEAS-la-CT-AMAII (R112F-V113F-R114S)的構建
[0074]1、以重組質粒 pEAS-la-CT-AMAII 為模板，用 EP-for 和 R112F_V113F-R114S_rev組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。
[0075]EP-for: 5』-TTACGAATTCGAGCTCGGTACCCG-3』 ；
[0076]R112F-V113F-R114S-rev:5』-TTGGGGTCCTCACCGGGAGAAAAAAAGACTCCAAGGCGGTCCAA-3，。
[0077]2、以重組質粒 pEAS-la-CT-AMAII 為模板，用 R112F_V113F-R114S-for 和 EP-rev組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。
[0078]R112F-V113F-R114S-for: 5』 -CTTGGAGTCTTTTTTTCTCCCGGTGAGGACCCCAACCTT-3』 ；
[0079]EP-rev:5』-ACGGCCAGTGCCAAGCTTGCATGCCT-3』。
[0080]3、同時將步驟I的PCR擴增產物和步驟2的PCR擴增產物作為模板，用EP-for和EP-rev組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。
[0081]4、用限制性內切酶BamHI和PstI雙酶切步驟3的PCR擴增產物，回收酶切產物。
[0082]5、用限制性內切酶BamHI和PstI雙酶切pEAS-la質粒，回收約5400bp的載體骨架。
[0083]6、將步驟4的酶切產物和步驟5的載體骨架連接，得到重組質粒pEAS-la-CT-AMAII (R112F-V113F-R114S)。根據測序結果，對重組質粒 pEAS-la-CT-AMAII(R112F-V113F-R114S)進行結構描述如下:在pEAS-la質粒的BamHI和PstI酶切位點之間插入了序列表的序列12所示的雙鏈DNA分子。與序列表的序列2相比，序列表的序列12的差異僅在於將序列表的序列2所不雙鏈DNA分子自5』末端第334-342位核苷酸由「cgtgtc agg」突變為了「TTTTTT TCT」。序列表的序列12所示的DNA分子編碼序列表的序列11所示的蛋白質。與序列表的序列I相比，序列表的序列11的差異僅在於將序列表的序列I自N末端第112位胺基酸殘基由「R」突變為了 「F」，第113位胺基酸殘基由「V」突變為了「F」，第114位胺基酸殘基由「R」突變為了「S」。將序列表的序列11自N末端第I至438位胺基酸殘基組成的蛋白質命名為R112F-V113F-R114S型酮胺氧化酶AmadoriaseII。
[0084]七、重組質粒pEAS-la-CT-AMAI I (R112W-V113F-R114S)的構建
[0085]1、以重組質粒 pEAS-la-CT-AMAII 為模板，用 EP-for 和 R112W-V113F-R114S_rev組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。
[0086]EP-for: 5』-TTACGAATTCGAGCTCGGTACCCG-3』 ；
[0087]R112ff-V113F-R114S-rev:5』-TTGGGGTCCTCACCGGGAGAAAACCAGACTCCAAGGCGGTCCAA-3，。
[0088]2、以重組質粒 pEAS-la-CT-AMAII 為模板，用 R112W_V113F-R114S-for 和 EP-rev組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。
[0089]R112ff-V113F-R114S-for: 5』 -CTTGGAGTCTGGTTTTCTCCCGGTGAGGACCCCAACCTT-3』 ；
[0090]EP-rev:5』-ACGGCCAGTGCCAAGCTTGCATGCCT-3』。
[0091 ] 3、同時將步驟I的PCR擴增產物和步驟2的PCR擴增產物作為模板，用EP-for和EP-rev組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。
[0092]4、用限制性內切酶BamHI和Pst I雙酶切步驟3的PCR擴增產物，回收酶切產物。
[0093]5、用限制性內切酶BamHI和Pst I雙酶切pEAS_la質粒，回收約5400bp的載體骨架。
[0094]6、將步驟4的酶切產物和步驟5的載體骨架連接，得到重組質粒pEAS-la-CT-AMAII (R112W-V113F-R114S)。根據測序結果，對重組質粒 pEAS-la-CT-AMAII(R112W-V113F-R114S)進行結構描述如下:在pEAS-la質粒的BamHI和Pst I酶切位點之間插入了序列表的序列14所示的雙鏈DNA分子。與序列表的序列2相比，序列表的序列14的差異僅在於將序列表的序列2所不雙鏈DNA分子自5』末端第334-342位核苷酸由「cgtgtc agg」突變為了「TGGTTT TCT」。序列表的序列14所示的DNA分子編碼序列表的序列13所示的蛋白質。與序列表的序列I相比，序列表的序列13的差異僅在於將序列表的序列I自N末端第112位胺基酸殘基由「R」突變為了 「W」，第113位胺基酸殘基由「V」突變為了「F」，第114位胺基酸殘基由「R」突變為了「S」。將序列表的序列13自N末端第I至438位胺基酸殘基組成的蛋白質命名為R112W-V113F-R114S型酮胺氧化酶AmadoriaseII。 [0095]八、重組質粒pEAS-la-CT-AMAII (R112Y-V113F-R114S)的構建
[0096]1、以重組質粒 pEAS-la-CT-AMAII 為模板，用 EP-for 和 R112Y_V113F-R114S_rev組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。[0097]EP-for: 5』-TTACGAATTCGAGCTCGGTACCCG-3』 ；
[0098]Rl 12Y-V113F-R114S-rev:5』 -GGGTCCTCACCGGGAGAAAAATAGACTCCAAGGCGGTCCA-3』。
[0099]2、以重組質粒 pEAS-la-CT-AMAII 為模板，用 R112Y_V113F-R114S-for 和 EP-rev組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。
[0100]R112Y-V113F-R114S-for:5』-CGCCTTGGAGTCTATTTTTCTCCCGGTGAGGACCCCAACCTT-3，；
[0101]EP-rev: 5』-ACGGCCAGTGCCAAGCTTGCATGCCT-3』。
[0102]3、同時將步驟I的PCR擴增產物和步驟2的PCR擴增產物作為模板，用EP-for和EP-rev組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。
[0103]4、用限制性內切酶BamHI和PstI雙酶切步驟3的PCR擴增產物，回收酶切產物。
[0104]5、用限制性內切酶BamHI和Pst I雙酶切pEAS_la質粒，回收約5400bp的載體骨架。 [0105]6、將步驟4的酶切產物和步驟5的載體骨架連接，得到重組質粒pEAS-la-CT-AMAII (R112Y-V113F-R114S)。根據測序結果，對重組質粒 pEAS-la-CT-AMAII(R112Y-V113F-R114S)進行結構描述如下:在pEAS-la質粒的BamHI和PstI酶切位點之間插入了序列表的序列16所示的雙鏈DNA分子。與序列表的序列2相比，序列表的序列16的差異僅在於將序列表的序列2所不雙鏈DNA分子自5』末端第334-342位核苷酸由「cgtgtc agg」突變為了「TATTTT TCT」。序列表的序列16所示的DNA分子編碼序列表的序列15所示的蛋白質。與序列表的序列I相比，序列表的序列15的差異僅在於將序列表的序列I自N末端第112位胺基酸殘基由「R」突變為了 「Y」，第113位胺基酸殘基由「V」突變為了「F」，第114位胺基酸殘基由「R」突變為了「S」。將序列表的序列15自N末端第I至438位胺基酸殘基組成的蛋白質命名為R112Y-V113F-R114S型酮胺氧化酶AmadoriaseII。
[0106]九、重組質粒pEAS-la-CTAMAII (N63D-K64Q-R112W-V113F-R114S)的構建
[0107]1、以重組質粒 pEAS-la-CT-AMAII 為模板，用 EP-for 和 N63D_K64Q-rev 組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。
[0108]EP-for: 5』-TTACGAATTCGAGCTCGGTACCCG-3』 ；
[0109]N63D-K64Q-rev:5』 -CTCAATTTCGTCCTGATCGTTGCTATATTGGCCGGAGGAGAT-3』。
[0110]2、以重組質粒 pEAS-la-CT-AMAII 為模板，用 N63D_K64Q-for 和 EP-rev 組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。
[0111]N63D-K64Q-for: 5』 -GGCCAATATAGCAACGATCAGGACGAAATTGAGGTCAACGAGATTCT-3』 ；
[0112]EP-rev: 5』-ACGGCCAGTGCCAAGCTTGCATGCCT-3』。
[0113]3、同時將步驟I的PCR擴增產物和步驟2的PCR擴增產物作為模板，用EP-for和EP-rev組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。
[0114]4、用限制性內切酶BamHI和PstI雙酶切步驟3的PCR擴增產物，回收酶切產物。
[0115]5、用限制性內切酶BamHI和PstI雙酶切pEAS_la質粒，回收約5400bp的載體骨架。
[0116]6、將步驟4的酶切產物和步驟5的載體骨架連接，得到重組質粒pEAS-la-CT-AMAII (N63D-K64Q)。
[0117]7、以重組質粒 pEAS-la-CT-AMAII (N63D-K64Q)為模板，用 EP-for 和R112ff-V113F-R114S-rev組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。
[0118]EP-for: 5』-TTACGAATTCGAGCTCGGTACCCG-3』 ；
[0119]R112ff-V113F-R114S-rev:5』-TTGGGGTCCTCACCGGGAGAAAACCAGACTCCAAGGCGGTCCAA-3，。
[0120]8、以重組質粒pEAS-la-CT-AMAII(N63D-K64Q)為模板，用 Rl 12W-V113F-R114S-for和EP-rev組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。
[0121 ] R112W-V113F-R114S-for:5』 -CTTGGAGTCTGGTTTTCTCCCGGTGAGGACCCCAACCTT-3』 ；
[0122]EP-rev:5』-ACGGCCAGTGCCAAGCTTGCATGCCT-3』。
[0123]9、同時將步驟7的PCR擴增產物和步驟8的PCR擴增產物作為模板，用EP-for和EP-rev組成的引物對進行PCR擴增，得到PCR擴增產物。
[0124]10、用限制性內切酶BamHI和PstI雙酶切步驟9的PCR擴增產物，回收酶切產物。
[0125]11、用限制性內切酶BamHI和PstI雙酶切pEAS_la質粒，回收約5400bp的載體骨架。
[0126]12、將步驟10的酶切產物和步驟11的載體骨架連接，得到重組質粒pEAS-la-CT-AMAII (N6 3D-K64Q-R112W-V113F-R114S)? 根據測序結果，對重組質粒pEAS-la-CT-AMAII ((N63D-K64Q-R112W-V113F-R114S))進行結構描述如下:在 pEAS-la 質粒的BamHI和PstI酶切位點之間插入了序列表的序列18所示的雙鏈DNA分子。與序列表的序列2相比，序列表的序列18的差異僅在於將序列表的序列2所示雙鏈DNA分子自5』末端第187-192位核苷酸由「aac aag」突變為了 「GAT CAG」，第334-342位核苷酸由「cgtgtc agg」突變為了「TGGTTT TCT」。序列表的序列18所示的DNA分子編碼序列表的序列17所示的蛋白質。與序列表的序列I相比，序列表的序列17的差異僅在於將序列表的序列I自N末端第63位胺基酸殘基由「N」突變為了「D」，第64位胺基酸殘基由「K」突變為了「Q」，第112位胺基酸殘基由「R」突變為了「W」，第113位胺基酸殘基由「V」突變為了「F」，第114位胺基酸殘基由「R」突變為了「S」。將序列表的序列17自N末端第I至438位胺基酸殘基組成的蛋白質命名為N63D-K64Q-R112W-V113F-R114S型酮胺氧化酶AmadoriaseII。
[0127]實施例2、酮胺氧化酶AmadoriaseII的製備
[0128]一、野生型酮胺氧化酶AmadoriaseII的製備
[0129]1、將重組質粒pEAS-la-CT-AMAI I導入大腸桿菌BL21，得到重組菌。
[0130]2、將步驟I得到的重組菌的單菌落接種於15ml含50 μ g/ml氨苄西林的LB液體培養基，30°C、250rpm過夜培養。
[0131]3、將步驟2得到的培養體系以1:40的體積比接種於400ml含有50 μ g/ml氨苄西林的LB液體培養基；30°C、250rpm培養至OD6tltlnm為0.5時加入IPTG並使其濃度為0.5mM,繼續30°C、250rpm培養；從加入IPTG開始計時，6小時後收集菌體。
[0132]4、將步驟3得到的菌體進行超聲破碎(超聲破碎功率200W，超聲4秒停3秒，共99次)，然後15000rpm離心25min,收集上清液。
[0133]5、用0.22 μ m低蛋白質結合的濾膜過濾步驟4得到的上清液，收集濾液。
[0134]6、取步驟5得到的濾液,利用蛋白純化設備(:ΑΚΤΑ explorerTM station),上樣至已結合 Ni2+的 HiTrapTM Chelating HP 柱(購自安瑪西亞(Amersham Biosciences,體積lmL)，先用15ml洗脫液甲(含500mM氯化鈉和30mM咪唑的20mM磷酸鈉緩衝液，pH7.4)去除雜蛋白，然後用3ml洗脫液乙(含500mM氯化鈉和400mM咪唑的20mM磷酸鈉緩衝液，pH7.4)洗脫目的蛋白，收集洗脫液乙的過柱後溶液，即為野生型酮胺氧化酶AmadoriaseII蛋白液(含有野生型酮胺氧化酶AmadoriaseII和His標籤的融合蛋白)。
[0135]二、V113F型酮胺氧化酶AmadoriaseII的製備
[0136]用重組質粒pEAS-la-CT-AMAII (V113F)代替重組質粒 pEAS-la-CT-AMAII，其它同步驟一，收集洗脫液乙的過柱後溶液，即為Vl 13F型酮胺氧化酶AmadoriaseII蛋白液(含有V113F型酮胺氧化酶AmadoriaseII和His標籤的融合蛋白)。
[0137]三、Rl 12F-V113F型酮胺氧化酶AmadoriaseII的製備
[0138]用重組質粒pEAS-la-CT-AMAII (R112F-V113F)代替重組質粒 pEAS-la-CT-AMAII，其它同步驟一，收集洗脫液乙的過柱後溶液，即為R112F-V113F型酮胺氧化酶AmadoriaseII蛋白液(含有R112F-V113F型酮胺氧化酶AmadoriaseII和His標籤的融合蛋白)。
[0139]四、Rl 12V-V113F型麗胺氧化酶AmadoriaseII的製備
[0140]用重組質粒pEAS-la-CT-AMAII (R112V-V113F)代替重組質粒 pEAS-la-CT-AMAII，其它同步驟一，收集洗脫液乙的過柱後溶液，即為R112V-V113F型酮胺氧化酶AmadoriaseII蛋白液(含有R112V-V113F型酮胺氧化酶AmadoriaseII和His標籤的融合蛋白)。
[0141]五、R112W-V113F型酮胺氧化酶AmadoriaseII的製備 [0142]用重組質粒pEAS-la-CT-AMAII (R112W-V113F)代替重組質粒 pEAS-la-CT-AMAII，其它同步驟一，收集洗脫液乙的過柱後溶液，即為R112W-V113F型酮胺氧化酶AmadoriaseII蛋白液(含有R112W-V113F型酮胺氧化酶AmadoriaseII和His標籤的融合蛋白)。
[0143]六、Rl12F-V113F-R114S 型酮胺氧化酶 AmadoriaseII 的製備
[0144]用重組質粒pEAS-la-CT-AMAII (R112F-V113F-R114S)代替重組質粒pEAS-la-CT-AMAI I，其它同步驟一，收集洗脫液乙的過柱後溶液，即為Rl 12F-V113F-R114S型酮胺氧化酶Amadoriasell蛋白液(含有Rl 12F-V113F-R114S型酮胺氧化酶Amadoriasell和His標籤的融合蛋白)。
[0145]七、Rl12W-V113F-R114S 型酮胺氧化酶 AmadoriaseII 的製備
[0146]用重組質粒pEAS-la-CTAMAII (R112W-V113F-R114S)代替重組質粒pEAS-la-CTAMAII，其它同步驟一，收集洗脫液乙的過柱後溶液，即為R112W-V113F-R114S型麗胺氧化酶AmadoriaseI I蛋白液(含有Rl 12W-V113F-R114S型麗胺氧化酶AmadoriaseI I和His標籤的融合蛋白)。
[0147]八、Rl12Y-V113F-R114S 型酮胺氧化酶 AmadoriaseII 的製備
[0148]用重組質粒pEAS-la-CTAMAII (R112Y-V113F-R114S)代替重組質粒pEAS-la-CTAMAII，其它同步驟一，收集洗脫液乙的過柱後溶液，即為R112Y-V113F-R114S型酮胺氧化酶AmadoriaseII蛋白液(含有Rl 12Y-V113F-R114S型酮胺氧化酶AmadoriaseII和His標籤的融合蛋白)。
[0149]九、N63D-K64Q-R112W-V113F-R114S型酮胺氧化酶 Amadoriase II 的製備
[0150]用重組質粒pEAS-la-CT-AMAII (N63D-K64Q-R112W-V113F-R114S)代替重組質粒pEAS-la-CT-AMAII，其它同步驟一，收集洗脫液乙的過柱後溶液，即為 N63D-K64Q-R112W-V113F-R114S 型酮胺氧化酶 Amadoriase II 蛋白液(含有N63D-K64Q-R112W-V113F-R114S 型酮胺氧化酶 AmadoriaseII 和 His 標籤的融合蛋白)。
[0151]實施例3、酮胺氧化酶Amadoriase II的酶活
[0152]—、糖基化模式底物的製備
[0153]1、糖基化多聚賴氨酸的製備
[0154]按照摩爾比5:6稱取多聚賴氨酸混合物(購自Sigma-Aldrich,產品目錄號為P8954-500MG ;每個聚賴氨酸分子含有3_13個賴氨酸)和葡萄糖，加入200mM磷酸鈉緩衝液(pH7.5)中，葡萄糖的終濃度為0.75M，混合均勻後60°C水浴6小時，得到糖基化產物(含有糖基化多聚賴氨酸)。
[0155]2、糖基化金剛烷胺的製備
[0156]按照摩爾比5:6稱取金剛烷胺(購自Sigma-Aldrich，產品目錄號為A1260-5G)和葡萄糖，加入水中，葡萄糖的終濃度為0.75M，通過滴加IM的氫氧化鈉溶液促使金剛烷胺溶解，混合均勻後121°C反 應15分鐘，得到糖基化金剛烷胺。
[0157]二、酮胺氧化酶的酶活測定
[0158]1、製備反應液
[0159]取2.7個紅掊酹單位(purpurogallin unit)的辣根過氧化物酶,0.45mM的4-氨基安替比林,0.5mM的N-乙基-N-(2-羥基_3_磺丙基)-m_甲苯胺(N_ethy 1_N_(2-hydroxy-3-sulfopropyl)-m-toluidine)和100 μ I糖基化底物(即步驟一的I得到的體系或步驟一的2的得到的體系)，溶於3mlIOOmM的磷酸鉀緩衝液(pH8.0)。
[0160]2、製備蛋白稀釋液
[0161]用IOOmM的磷酸鉀緩衝液(pH8.0)將實施例2製備的野生型酮胺氧化酶Amadoriase II蛋白液稀釋至50倍體積,得到野生型酮胺氧化酶Amadoriase II蛋白液的蛋白稀釋液。
[0162]用IOOmM的磷酸鉀緩衝液(pH8.0)將實施例2製備的V113F型酮胺氧化酶AmadoriaseII蛋白液稀釋至50倍體積,得到V113F型酮胺氧化酶Amadoriase II蛋白液的蛋白稀釋液。
[0163]用IOOmM的磷酸鉀緩衝液(pH8.0)將實施例2製備的R112F-V113F型酮胺氧化酶Amadoriase II蛋白液稀釋至50倍體積，得到R112F-V113F型酮胺氧化酶Amadoriase II蛋白液的蛋白稀釋液。
[0164]用IOOmM的磷酸鉀緩衝液(pH8.0)將實施例2製備的R112V-V113F型酮胺氧化酶Amadoriase I I蛋白液稀釋至50倍體積,得到R112V-V113F型酮胺氧化酶Amadoriase II蛋白液的蛋白稀釋液。
[0165]用IOOmM的磷酸鉀緩衝液(pH8.0)將實施例2製備的R112W-V113F型酮胺氧化酶Amadoriase II蛋白液稀釋至50倍體積，得到R112W-V113F型酮胺氧化酶Amadoriase II蛋白液的蛋白稀釋液。
[0166]用IOOmM的磷酸鉀緩衝液(pH8.0)將實施例2製備的R112F-V113F-R114S型酮胺氧化酶AmadoriaseII蛋白液稀釋至50倍體積，得到R112F-V113F-R114S型酮胺氧化酶AmadoriaseII蛋白液的蛋白稀釋液。[0167]用IOOmM的磷酸鉀緩衝液(pH8.0)將實施例2製備的R112W-V113F-R114S型酮胺氧化酶AmadoriaseII蛋白液稀釋至50倍體積，得到R112W-V113F-R114S型酮胺氧化酶AmadoriaseII蛋白液的蛋白稀釋液。
[0168]用IOOmM的磷酸鉀緩衝液(pH8.0)將實施例2製備的R112Y-V113F-R114S型酮胺氧化酶AmadoriaseII蛋白液稀釋至50倍體積，得到R112Y-V113F-R114S型酮胺氧化酶AmadoriaseII蛋白液的蛋白稀釋液。
[0169]用IOOmM的磷酸鉀緩衝液(pH8.0)將實施例2製備的N63D-K64Q-R112W-V113F-R114S型酮胺氧化酶AmadoriaseII蛋白液稀釋至50倍體積，得到N63D-K64Q-R112W-V113F-R114S型酮胺氧化酶AmadoriaseII蛋白液的蛋白稀釋液。
[0170]3、蛋白濃度測定
[0171]分別檢測步驟2得到的各個蛋白稀釋液中的蛋白濃度，具體方法如下:
[0172]檢測280nm處的光吸收值，然後按照下式計算:
[0173]蛋白濃度(mg/ml)=A280/( ε Xb)；
[0174]A28tl—蛋白稀釋液在280nm處的光吸收值山一光程，cm ； ε 一消光係數。
[0175]消光係數，可按照下式計算:
【權利要求】
1.一種蛋白質，是如下(a)至(P)中的任意一種: Ca)由序列表中序列3自N末端第I至438位胺基酸殘基組成的蛋白質； (b)由序列表中序列3所不的氣基酸殘基組成的蛋白質； (c)由序列表中序列5自N末端第I至438位胺基酸殘基組成的蛋白質； (d)由序列表中序列5所不的氣基酸殘基組成的蛋白質； Ce)由序列表中序列7自N末端第I至438位胺基酸殘基組成的蛋白質； (f)由序列表中序列7所不的氣基酸殘基組成的蛋白質； (g)由序列表中序列9自N末端第I至438位氣基酸殘基組成的蛋白質； (h)由序列表中序列9所不的氣基酸殘基組成的蛋白質； (i)由序列表中序列11自N末端第I至438位胺基酸殘基組成的蛋白質； (j)由序列表中序列11所不的氣基酸殘基組成的蛋白質； (k)由序列表中序列13自N末端第I至438位胺基酸殘基組成的蛋白質； (I)由序列表中序列13所不的氣基酸殘基組成的蛋白質； Cm)由序列表中序列15自N末端第I至438位胺基酸殘基組成的蛋白質； (η)由序列表中序列15所不的氣基酸殘基組成的蛋白質； (ο)由序列表中序列17自N末端第I至438位胺基酸殘基組成的蛋白質； (P)由序列表中序列17所不的氣基酸殘基組成的蛋白質。
2.編碼權利要求1所述蛋白質的基因。
3.如權利要求2所述的基因，其特徵在於:所述基因為如下I)至26)中任一所述的DNA分子: 1)編碼區如序列表中序列4自5』末端第I至1314位核苷酸所示的DNA分子； 2)編碼區如序列表中序列4自5』末端第I至1344位核苷酸所示的DNA分子； 3)編碼區如序列表中序列4所示的DNA分子； 4)編碼區如序列表中序列6自5』末端第I至1314位核苷酸所示的DNA分子； 5)編碼區如序列表中序列6自5』末端第I至1344位核苷酸所示的DNA分子； 6)編碼區如序列表中序列6所示的DNA分子； 7)編碼區如序列表中序列8自5』末端第I至1314位核苷酸所示的DNA分子； 8)編碼區如序列表中序列8自5』末端第I至1344位核苷酸所示的DNA分子； 9)編碼區如序列表中序列8所示的DNA分子； 10)編碼區如序列表中序列10自5』末端第I至1314位核苷酸所示的DNA分子； 11)編碼區如序列表中序列10自5』末端第I至1344位核苷酸所示的DNA分子； 12)編碼區如序列表中序列10所示的DNA分子； 13)編碼區如序列表中序列12自5』末端第I至1314位核苷酸所示的DNA分子； 14)編碼區如序列表中序列12自5』末端第I至1344位核苷酸所示的DNA分子； 15)編碼區如序列表中序列12所示的DNA分子； 16)編碼區如序列表中序列14自5』末端第I至1314位核苷酸所示的DNA分子； 17)編碼區如序列表中序列14自5』末端第I至1344位核苷酸所示的DNA分子； 18)編碼區如序列表中序列14所示的DNA分子； 19)編碼區如序列表中序列16自5』末端第I至1314位核苷酸所不的DNA分子；20)編碼區如序列表中序列16自5』末端第I至1344位核苷酸所不的DNA分子； 21)編碼區如序列表中序列16所示的DNA分子； 22)編碼區如序列表中序列18自5』末端第I至1314位核苷酸所示的DNA分子； 23)編碼區如序列表中序列18自5』末端第I至1344位核苷酸所示的DNA分子； 24)編碼區如序列表中序列18所示的DNA分子； 25)在嚴格條件下與1)至24)中任一限定的DNA序列雜交且編碼所述蛋白質的DNA分子; 26)與1)至24)中任一限定的DNA序列具有90%以上同源性且編碼所述蛋白質的DNA分子。
4.含有權利要求2或3所述基因的重組載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌。
5.如權利要求4所述的重組載體，其特徵在於:所述重組載體為將權利要求2或3所述基因插入pEAS-la質粒的多克隆位點得到的重組質粒。
6.如權利要求4所述的重組菌，其特徵在於:所述重組菌為將權利要求5所述的重組質粒導入大腸桿菌BL21得到的重組菌。
7.權利要求1所述蛋白質在製備酮胺氧化酶中的應用。
8.權利要求1所述蛋白質在降解糖基化底物中的應用。
9.權利要求6所述重組菌在生產權利要求1所述蛋白質中的應用。
10.權利要求1所述蛋白質作為酮胺氧化酶的應用。
【文檔編號】C12N15/63GK103937762SQ201310022610
【公開日】2014年7月23日 申請日期:2013年1月22日 優先權日:2013年1月22日
【發明者】林章凜, 錢昱, 鄭靜 申請人:清華大學