基於金黃色葡萄球菌的生物探針、製備方法及其應用的製作方法

2024-01-28 00:15:15 2

基於金黃色葡萄球菌的生物探針、製備方法及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及微生物病原檢測【技術領域】，具體而言，涉及一種基於金黃色葡萄球菌的生物探針、製備方法及其應用。該基於金黃色葡萄球菌的生物探針，包括：金葡菌載體以及標記在所述金葡菌載體的表面A蛋白上，且能夠與被檢測抗原特異性結合的抗體；其中，所述金葡菌載體被四唑氯化物染料染至紅色。本發明提供的這種基於金黃色葡萄球菌的生物探針，兼具乳膠微球和紅細胞優點，顆粒均一、穩定，與抗原結合能力以及凝集性能強，顏色鮮明，使得凝集結果非常易於判定。與現有技術相比，該體系的凝集反應的解析度、靈敏度和特異性都得到了很大的提高，因此，可有效地應用到免疫學檢測中。
【專利說明】基於金黃色葡萄球菌的生物探針、製備方法及其應用

【技術領域】
[0001]本發明涉及微生物病原檢測【技術領域】，具體而言，涉及一種基於金黃色葡萄球菌的生物探針、製備方法及其應用。

【背景技術】
[0002]典型的金葡菌(金黃色葡萄球菌)為球型，直徑0.8 μ m左右，顯微鏡下排列成葡萄串狀。金葡菌無芽胞、鞭毛，大多數無莢膜，革蘭氏染色陽性。金黃色葡萄球菌A蛋白(Staphylococal Protein A, SPA),或簡稱表面A蛋白，佔整個細胞壁蛋白成分的6.7%,通過胞壁肽聚糖以共價鍵與之結合。
[0003]多數表面A蛋白呈一側面稍凹的橢球形結構，結構穩定、均一，長約為40.88±1.58nm，寬約為 20.82±0.68nm，高約為 10.51 ±0.28nm。
[0004]表面A蛋白由亮、纈、脯、丙、蘇、甘、絲、谷丙、天門冬及賴氨酸等十種胺基酸組成。由於其不含有胱氨酸及半胱氨酸，所以無二硫鍵。紫外光譜和吸收係數為A275nm% =
1.65,等電點為pH5.1。表面A蛋白十分穩定,用4mol/L尿素、硫氰鹽酸、6mol/L的鹽酸胍和pH2.5的酸性條件，以及加熱煮沸均不影響其活性。
[0005]表面A蛋白能與人及多種哺乳動物血清IgG分子中的Fe片段結合，結合的親和性次序依次是豬、狗、兔、人、猴、鼠、小鼠及牛；對大白鼠、綿羊的親和力差；對馬、犢牛、山羊等無親和力；對所有的魚類、兩棲類、爬行類、鳥類(除少數例外)均不能與之結合。基於金黃色葡萄球菌A蛋白的免疫學性質，預示著其可以作為載體並與已知的標準血清進行修飾吸附，進而獲得吸附有抗體的載體，通過進行協同凝集反應並應用到檢測相應的未知抗原中。雖然，上述的方式其檢測未知抗原的特異性和敏感性均較好，但是，相關技術中，由於對金黃色葡萄球菌沒有進行特定的處理，因此，在鑑定其協同凝集後的凝集產物時，其解析度差(常需要藉助大型的儀器進行分析辨別)，因此，不易判定其凝集結果，進而嚴重影響了其在免疫學檢測中的應用。
[0006]綜上，提供一種便於觀測凝集結果的金黃色葡萄球菌的生物探針並應用到抗原檢測中是本領域亟待解決的一個技術問題。


【發明內容】

[0007]本發明的目的在於提供一種基於金黃色葡萄球菌的生物探針；以解決上述的問題。本發明的另外一個目的在於提供一種上述生物探針的製備方法，並實現其應用。
[0008]在本發明的實施例中提供了一種基於金黃色葡萄球菌的生物探針，包括:金葡菌載體以及標記在所述金葡菌載體的表面A蛋白上，且能夠與被檢測抗原特異性結合的抗體；其中，所述金葡菌載體被四唑氯化物染料染至紅色。
[0009]本發明提供的這種基於金黃色葡萄球菌的生物探針，金黃色葡萄球菌作為基本的結構組成，由於其細胞壁上含有一定量結構穩定的表面A蛋白，而該表面A蛋白則可以和多種動物血清中的IgG分子中的Fe片段結合，即其表面A蛋白可以和標記有被檢測抗原特異性結合的抗體，通過抗體與未知抗原的特異性結合以及發生的協同凝集反應進而實現抗原的檢測。更為重要的，由於金葡菌載體是被四唑氯化物染料染至紅色的，具體的，四唑氯化物染料可被金葡菌內部所含的各類氧化還原酶作用，生成紅色的不溶物(在細菌內部發生)，進而使得整個金葡菌顯現出紅色，即得到紅色的金葡菌載體。因此，該紅色的載體與相應的抗體標記之後(生物探針)，其與特定的抗原發生協同凝集反應時，生物探針兼具乳膠微球和紅細胞優點，顆粒均一、穩定，與抗原結合能力以及凝集性能強，顏色鮮明，使得凝集結果非常易於判定。與現有技術相比，該體系的凝集反應的解析度、靈敏度和特異性都得到了很大的提高，因此，可有效地應用到免疫學檢測中。
[0010]可選的，四唑氯化物染料具體為5-氰基-2，3- 二(4-甲基苯基)四唑氯化物。
[0011]一種上述的生物探針的製備方法，包括以下步驟:
[0012]I)、利用LB平板劃線分離出金葡菌，再利用LB液體培養基進行擴大培養，得到0D600為0.5-1.5的金葡菌懸液；
[0013]2)、在所述金葡菌懸液中加入四唑氯化物染料，並使得所述四唑氯化物染料的終濃度達到Ι-lOmM，染色10-30min，得到紅色菌懸液；
[0014]3)、將所述紅色菌懸液依次進行離心收集菌體、緩衝液清洗、重懸以及滅活，得到紅色的金葡菌載體懸液；
[0015]4)、將紅色的所述金葡菌載體懸液與能夠和被檢測的抗原特異性結合的抗體混合後依次進行孵育、離心收集沉澱、緩衝液清洗以及重懸，得到標記有抗體的菌懸液；
[0016]5)、將所述標記有抗體的菌懸液中加入封閉劑後顛倒混勻，進行封閉處理，得到紅色的生物探針。
[0017]可選的，在步驟4)中，所述抗體包括單克隆抗體或多克隆抗體；在步驟5)中，所述封閉劑包括脫脂奶粉或牛血清蛋白。
[0018]可選的，在步驟I)中:所述擴大培養的溫度為35-39°C，轉速為160_200rpm。
[0019]可選的，在步驟3)中:所述離心的轉速為3800-4200rpm,時間為3_7min ;所述清洗以及重懸均採用濃度為0.1Μ、ρΗ為8.0的Tris-HCl，且所述清洗的次數為2_3次。
[0020]可選的，在步驟3)中:所述滅活具體包括:在將所述重懸處理後的紅色菌懸液中加入終濃度為1%的甲醛處理10-30min ;或，將所述重懸處理後的紅色菌懸液在60_75°C溫育 15_50mino
[0021]可選的，在步驟4)中:能夠和被檢測的抗原特異性結合所述抗體的濃度為
0.l_5mg/ml，且所述金葡菌載體懸液與所述抗體的體積比為1:50-500 ;所述孵育的溫度為37°C，時間為30min，轉速為180rpm ;所述離心收集沉澱中，離心的溫度為4°C，轉速為4000rpm,時間為5min ;所述清洗以及重懸均採用濃度為0.1M，pH為8.0的Tris-HCl。
[0022]可選的，在步驟5)中--每100毫升的所述標記有抗體的菌懸液加入的封閉劑的質量為0.1-5克。
[0023]上述製備方法獲得的生物探針在腸出血性大腸桿菌0157:H7檢測中的應用。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0024]為了更清楚地說明本發明【具體實施方式】或現有技術中的技術方案，下面將對【具體實施方式】或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發明的一些實施方式，對於本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其它的附圖。
[0025]圖1為本發明實施例二提供的紅色生物探針的製備流程圖；
[0026]圖2為本發明實施例二中未染色的金葡菌懸液和染色後的紅色菌懸液對比圖；
[0027]圖3為本發明實施例二中紅色的金葡菌載體懸液未滅活/滅活後72小時培養結果對比圖；
[0028]圖4為本發明實施例二中滅活前的金葡菌載體懸液和滅活後的金葡菌載體懸液負染透射電鏡結果圖；
[0029]圖5為本發明實施例二中以金葡菌為基礎的生物探針凝集試驗靈敏度評價圖；
[0030]圖6為本發明實施例二中金葡菌為基礎的紅色生物探針與0157:H7凝集反應產物負染透射電鏡觀察圖；
[0031]圖7為現有技術中未染色探針凝集試驗靈敏度評價圖；
[0032]圖8為本發明實施例二中3次以金葡菌為基礎的紅色生物探針重複試驗結果圖；
[0033]圖9為本發明實施例二中以金葡為基礎的0157:H7生物探針特異性評價圖；
[0034]圖10為本發明實施例二中紅色生物探針檢測0157:H7穩定性試驗結果圖；
[0035]圖11示出了本發明實施例二製備的紅色生物探針凝集檢測大腸桿菌0157:H7的示意流程圖。

【具體實施方式】
[0036]為使本發明的目的、技術方案和優點更加清楚，下面將對本發明的技術方案進行清楚、完整的描述，基於本發明中的【具體實施方式】，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動的前提下所得到的所有其它實施方式，都屬於本發明所保護的範圍。
[0037]實施例一
[0038]本實施例提供了一種基於金黃色葡萄球菌的生物探針，包括:金葡菌載體以及標記在所述金葡菌載體的表面A蛋白上，且能夠與被檢測抗原特異性結合的抗體；其中，所述金葡菌載體被四唑氯化物染料染至紅色；具體的，四唑氯化物染料具體為5-氰基-2，3-二(4-甲基苯基)四唑氯化物；5-氰基-2，3-二(4-甲基苯基)四唑氯化物(5-cyano_2, 3-ditolyl tetrazolium chloride, CTC)是一種氧化還原型染料，一定濃度的該染料可以被細菌或者細胞內部的氧化還原酶還原成不溶物質，從而將細菌和細胞染色。由於反應在細胞內部進行，因此，該染色的過程不影響金葡菌表面A蛋白的活性，表面A蛋白與抗體(包括單克隆抗體或多克隆抗體)的結合不受影響；另外，該染色反應時間快，操作簡單。
[0039]本發明提供的這種基於金黃色葡萄球菌的生物探針，四唑氯化物染料可被金葡菌內部所含的各類氧化還原酶作用，生成紅色的不溶物(在細菌內部發生)，進而使得整個金葡菌顯現出紅色，即得到紅色的金葡菌載體。因此，該紅色的載體與相應的抗體標記之後(生物探針)，其與特定的抗原發生協同凝集反應時，生物探針兼具乳膠微球和紅細胞優點，顆粒均一、穩定，與抗原結合能力以及凝集性能強，顏色鮮明，使得凝集結果非常易於判定。與現有技術相比，該體系的凝集反應的解析度、靈敏度和特異性都得到了很大的提高，因此，可有效的應用到免疫學檢測中。
[0040]為了使得本發明實施例一的金葡菌生物探針得到更好的應用，更加有效應用到微生物學、生物材料和生化檢測【技術領域】中，本發明還在上述實施例一的基礎之上提供了實施例二，實施例二為根據實施例一所舉的生物探針給出了具體的製備方法，請參考圖1-圖11:
[0041]實施例二
[0042]請參考圖1，本實施例提供的這種生物探針的製備方法，具體包括以下步驟:
[0043]步驟101:利用LB平板劃線分離出金葡菌，再利用LB液體培養基進行擴大培養，得到0D600為0.5-1.5的金葡菌懸液；
[0044]具體的，在該步驟中，利用LB平板劃線分離出金葡菌(優選金葡菌N315)，然後再挑選單克隆至LB液體培養基進行擴大培養，優選的，擴大培養的條件為:溫度為35-39°C，轉速為160-200rpm(具體操作時，參數取中間值，即溫度為37°C，轉速為180rpm)，進而獲得0D600為0.5-1.5的金葡菌懸液(平板計數結果推算菌濃度為IX 18 CFU/ml_2X 19 CFU/ml) ο
[0045]步驟102:在所述金葡菌懸液中加入四唑氯化物染料，並使得所述四唑氯化物染料的終濃度達到Ι-lOmM，染色10-30min，得到紅色菌懸液；
[0046]通過在金葡菌懸液中加入既定終濃度的四唑氯化物染料，染料具體為5-氰基-2，
3-二(4-甲基苯基)四唑氯化物；其在染色的過程中需要將四唑氯化物染料的終濃度控制在Ι-lOmM，染色時間控制在10-30min，這樣即可保證該染料在金葡菌內的氧化還原酶的作用下生成紅色顆粒物，進而保證在較短的時間內實現較好的染色效果。
[0047]在本實施例中，對於染料的選取是非常關鍵的，能夠明顯地將金葡菌染色是首先需要考慮的因素，其次，還要保證該染料不能影響金葡菌的生物活性，尤其是不能影響其表面A蛋白與相應的抗體結合的性能，另外，還需要綜合考慮染色時間以及操作步驟是否繁瑣等因素。在染料選取的過程中，通過對比姬姆薩染色以及多種染料的染色效果，才獲得了能夠滿足上述染色需求的四唑氯化物染料，具體為5-氰基-2，3-二(4-甲基苯基)四唑氯化物，其染色鮮明，費時短，而且操作簡單，更為重要的，其不影響金葡菌表面A蛋白與不同來源IgG(豬、狗、兔、人、猴、鼠、小鼠及牛等)的Fe片段的結合，為實現該紅色生物探針的製備奠定了基礎。
[0048]如圖2所示，染色前(A)和染色後(B)的金葡菌懸液懸液。製備後的載體懸液呈紅色。進一步的，得到的紅色菌懸液需要進行離心、清洗、重懸等操作進而實現金葡菌載體的製備。
[0049]步驟103:將所述紅色菌懸液依次進行離心收集菌體、緩衝液清洗、重懸以及滅活，得到紅色的金葡菌載體懸液；
[0050]在該步驟103中，為了實現菌體的收集效果，優選的，所述離心的轉速為3800-4200rpm、時間為3_7min(更優選的，轉速為4000rpm，時間為5min);所述清洗以及重懸均採用濃度為0.1M、pH為8.0的Tris-HCl，且所述清洗的次數為2_3次。
[0051]另外，如圖3所示，為了分析此種載體(金葡菌載體)的生物安全性，對該載體在滅活前和滅活後的菌體進行平板劃線，監測顯示，此種載體的生物安全型是滿足要求的。在圖3中，A為未滅活紅色金葡平板劃線72h結果，B為滅活紅色金葡平板劃線72h結果。
[0052]如圖4所示，將此生物載體製備前和製備後在溶液裡的狀態進行了透射電鏡表徵，結果顯示製備後的新型載體分散性好，顆粒均勻。其中，在圖4中，A為金葡菌滅活前負染透射電鏡結果。B為所製備的以金葡為基礎的紅色生物探針滅活後負染透射電鏡結果。
[0053]通過圖3和圖4可知，滅活前，染色後的菌保持了很好的活性，在平板上長出許多菌落。而經過甲醛或溫育滅活後的金葡菌都沒有生長。進而提示所製備的紅色生物載體雖然是由金葡菌製備而來，但是滅活後不能生長，保證了紅色載體的生物安全性。電鏡圖片顯示(圖4)，滅活後的載體呈單顆粒，且大小均一，而未滅活的菌為葡萄球菌的典型葡萄串分布，聚集在一起。
[0054]另外，在滅活處理的過程中，為了實現便於操作的同時，儘可能的不減少操作對金葡菌載體特異結合抗體的能力，優選的，所述滅活過程具體包括:在將所述重懸處理後的紅色菌懸液中加入終濃度為0.1-5% (優選1% )的甲醛處理10-30min ;或，將所述重懸處理後的紅色菌懸液在60_75°C溫育15_50min。
[0055]步驟104:將紅色的所述金葡菌載體懸液與能夠和被檢測的抗原特異性結合的抗體混合後依次進行孵育、離心收集沉澱、緩衝液清洗以及重懸，得到標記有抗體的菌懸液；
[0056]在該步驟中，抗體的選擇是多樣的，只要滿足其能夠與被檢測抗原特異結合的條件即可。常用的，其可以是單/多克隆抗體，但是，優選的，在本實施例中，採用單克隆抗體。
[0057]金葡菌載體懸液製備完成後，以大腸桿菌0157:H7的檢測為例，利用金葡菌表面A蛋白的免疫學性質，將0157:H7的H抗原的鼠源IgG單克隆抗體標記在紅色滅活的金葡菌載體上。
[0058]具體步驟如下:
[0059]取紅色的金葡菌載體懸液，按體積比1:50-1:500加入H抗原的鼠源IgG單克隆抗體(lmg/ml)，37°C、180rpm孵育30min後,4°C, 4000rpm, 5min收集沉澱,上清可回收再利用。用相同體積0.1MTris-HCl (ρΗ8.0)緩衝液洗3遍後，相同體積0.1M Tris-HCl (ρΗ8.0)重懸，得到標記有單克隆抗體的菌懸液。
[0060]步驟105:將所述標記有抗體的菌懸液中加入封閉劑後顛倒混勻，進行封閉處理，得到紅色的生物探針。
[0061]得到標記有單克隆抗體的菌懸液後，為了保證該生物探針在檢測抗原時，生物探針上的抗體能夠特異性地與抗原的相應部位結合，以防止發生非特異性吸附，優選的，需要將獲得的標記有單克隆抗體的菌懸液加入封閉劑後進行封閉處理，具體的，每100毫升的所述標記有單克隆抗體的菌懸液加入的封閉劑的質量為0.1-5克，然後顛倒溶解，實現封閉處理的效果，即可得到能夠檢測0157:Η7紅色生物探針。優選的，為了得到較好的封閉效果，在本實施例中，選用脫脂奶粉或者牛血清蛋白(BSA)作為封閉劑。
[0062]0157:Η7 是腸出血性大腸桿菌(Enterohemorrhagic E.coli, EHEC)的一個主要菌型，其致病力強，對人類健康構成重大威脅。0157:H7是革蘭氏陰性兩端鈍圓的短桿菌，大小
0.5X1?3微米。周身鞭毛，能運動，無芽孢。目前對0157:H7的檢測方法包括生化反應、免疫學、分子生物學、血清學以及毒素等多個方面的檢測。其中免疫學方法中的乳膠凝集試驗是本發明的基礎之一，該方法比較成熟，市場上已有診斷試劑盒可供選擇，但特異性及靈敏度均有待提高。因此，在本發明的應用中，主要以0157:H7檢測為例，通過獲得易於判定凝集效果的紅色生物探針，進而提高該致病菌的檢測靈敏度。
[0063]另外，請參考圖11，在圖11中，示出了本發明實施例的這種紅色生物探針凝集檢測大腸桿菌0157:H7的示意流程圖。
[0064]需要指出的是，在本實施例中，獲得了紅色生物探針之後，為了檢測其是否滿足應用需求，還對其靈敏度進行了評價，具體的，包括以下步驟:
[0065]SI:LB平板劃線分離0157:H7後，挑取單克隆至LB液體培養基，在培養箱以37°C，180rpm條件將菌液擴大培養後，利用平板計數確定菌濃度。取IXlO8 CFU/ml500μ 1，於 10000rpm，2min 收集菌液，IXPBS 洗 3 遍後，用 500μ I 0.1M Tris-HCl (ρΗ8.0)緩衝液重懸菌液。
[0066]S2:用 0.1M Tris-HCl (ρΗ8.0)緩衝液 10 倍梯度稀釋 I X 108CFU/ml 菌 0157:H7。
[0067]S3:取 1X108、1X107、5X106、1X106、1X105、1X104、1X103、1X102 CFU/ml 的0157:H7以及空白對照0.1M Tris-HCl (pH8.0)各10 μ I滴在潔淨載玻片上後，取20 μ I2X107-2X101CI個/ml的新型生物探針懸液與其混合，5?15min後肉眼觀察結果。結果如圖5所示，其中每個反應的大腸桿菌0157:H7含量為(CFU)A.1O6、B.105、C.5XlO4, D.104、E.103、F.102、G.101、H.10°、1.空白對照。
[0068]為了方便判讀凝集結果，制定了陽性標準，即出現明顯紅色凝集塊和絮狀沉澱，溶液變透明為強陽性。結合這一標準，圖4的靈敏度可達到5X 14 CFU/反應。另外，將上述產生的明顯凝集溶液輕柔重懸後，利用透射電鏡進行了表徵。圖6示出了以金葡菌為基礎的紅色生物探針與0157:Η7凝集反應產物負染透射電鏡觀察圖，進一步證實了凝集反應的結果。
[0069]在本實施例中，還將這種新型生物探針與未染色的生物探針進行了比較。未染色的基於金葡菌的生物探針沒有用染料染色，其他製備方法和凝集試驗與該新型生物探針相同;2Χ108 個/ml 的無色生物探針 20 μ I 與 I X 107、I X 106、I X 105、I X 104、I X 103、I X 12CFU/ml的0157:H7以及空白對照0.1M Tris-HCl (ρΗ8.0)各10 μ I的凝集試驗結果如圖7所示。結果顯示傳統的基於金葡菌的協同凝集反應結果，肉眼判定非常不明確，各不同濃度的差異不明顯，所以，凝集反應的結果很難判斷。在圖6中，每個反應的0157:Η7含量為(CFU).A.106、B.105、C.104、D.ΙΟ3、Ε.102、F.1O1, G.10' H.Blank。
[0070]另外，如圖8所示，按照本實施例提供的方法重複製備3次基於金葡菌的紅色生物探針並和IX 105CFU/ml的0157:H7單克隆凝集試驗結果一致，說明該凝集試驗體系可重複性強，可以應用到0157:H7的檢測中。
[0071]為了檢測本發明實施例提供的這種紅色生物探針與被檢測抗原是否能夠特異性結合。在本發明中，還對這種新型生物探針檢測0157:H7的特異性進行了評價，具體的操作步驟如下:
[0072]I)、將大腸桿菌0157、091、097、0100、0149、BL21 (DE3)、腸炎沙門以及豬鏈球菌分別接種至LB液體培養基，將銅綠假單胞菌接種至BHI+5%小牛血清液體培養基後，37°C、180rpm過夜擴大培養。
[0073]2)、通過平板計數確定0157:H7濃度後，將上述菌各取500 μ 1，IXPBS洗3遍，500 μ I IXPBS重懸菌液。將0157:Η7兩倍梯度稀釋至5個梯度，各取100 μ I上述菌懸液測量0D600，通過0157:Η7，的5個梯度的方程大致測算其他菌液濃度。
[0074]3)、各取 10 μ I IXlO7 CFU/ml 大腸桿菌 0157、091、097、0100、0149、BL21 (DE3)、腸炎沙門、豬鏈球菌、銅綠假單胞菌以及10μ I IXlO7 CFU/ml 0157:h7與ΙΟμΙ IXlO7CFU/ml大腸桿菌0100、腸炎沙門、豬鏈球菌、銅綠假單胞菌的混懸液滴於潔淨載玻片上。再取20μ1 2Χ 101°個/ml的新型生物探針懸液與其混合，5 — 15min後肉眼觀察結果。結果如圖9，其中，六.091、8.097、(:.0100、0.01493.81^21、卩.腸炎沙門、G.豬鏈球菌、H.銅綠假單胞菌、1.0157、J.0 157+0100、K.0157+腸炎沙門、L.0157+豬鏈球菌、M.0157+銅綠假單胞菌、N.Blank。
[0075]結果顯示，這種新型生物探針在應用於0157:H7的凝集反應檢測時，特異性較好。
[0076]最後，基於本發明實施例所提供的這種紅色生物探針，公開其對檢測0157:H7的的穩定性檢測試驗的步驟:
[0077]I)、取2份所製備的紅色生物探針各200 μ I置於1.5ml EP管。
[0078]2)、一份放置於4°C，一份放置於室溫，一個月後，進行凝集試驗，挑取LB平板分離的0157: H7單克隆2個，並分別與20 μ I步驟I)中所給出的生物探針懸液混合，5?15min後，結果如圖10所示，其中，A為4°C放置一個月穩定性結果，B為室溫放置一個月穩定性結果。通過圖10顯示，兩者的凝集現象明顯，證明該生物探針穩定性較好。
[0079]綜上，本發明實施例所製備的金葡菌生物探針實現了在0157:H7協同凝集檢測上的應用。通過將所製備的金葡菌紅色載體與0157:H7鞭毛抗原(H Antigen)的鼠源IgG單抗共孵育，將抗體標記到紅色滅活金葡菌表面，經脫脂奶粉等封閉後，得到能檢測0157:H7的生物探針。而且，使用該生物探針的凝集試驗對0157:H7的檢測限達到5 X 14 CFU/反應，凝集結果肉眼易於觀察，整個過程不需要大型儀器且一般操作人員容易掌握。基於上述的啟示，該生物探針可以通過標記不同種類的單抗或者多克隆抗體，進而實現與其特異性結合的抗原的檢測，為免疫學檢測病原提供了有效的幫助。
[0080]以上所述僅為本發明的優選實施例而已，並不用於限制本發明，對於本領域的技術人員來說，本發明可以有各種更改和變化。凡在本發明的精神和原則之內，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發明的保護範圍之內。
【權利要求】
1.一種基於金黃色葡萄球菌的生物探針，其特徵在於，包括: 金葡菌載體以及標記在所述金葡菌載體的表面A蛋白上，且能夠與被檢測抗原特異性結合的抗體； 其中，所述金葡菌載體被四唑氯化物染料染至紅色。
2.根據權利要求1所述的生物探針，其特徵在於，所述四唑氯化物染料具體為5-氰基-2，3-二(4-甲基苯基)四唑氯化物。
3.一種根據權利要求2所述的生物探針的製備方法，其特徵在於，包括以下步驟: 1)、利用LB平板劃線分離出金葡菌，再利用LB液體培養基進行擴大培養，得到0D600為0.5-1.5的金葡菌懸液； 2)、在所述金葡菌懸液中加入四唑氯化物染料，並使得所述四唑氯化物染料的終濃度達到Ι-lOmM，染色10-30min，得到紅色菌懸液； 3)、將所述紅色菌懸液依次進行離心收集菌體、緩衝液清洗、重懸以及滅活，得到紅色的金葡菌載體懸液； 4)、將紅色的所述金葡菌載體懸液與能夠和被檢測的抗原特異性結合的抗體混合後依次進行孵育、離心收集沉澱、緩衝液清洗以及重懸，得到標記有抗體的菌懸液； 5)、將所述標記有抗體的菌懸液中加入封閉劑後顛倒混勻，進行封閉處理，得到紅色的生物探針。
4.根據權利要求3所述的生物探針的製備方法，其特徵在於，在步驟4)中，所述抗體包括單克隆抗體或多克隆抗體； 在步驟5)中，所述封閉劑包括脫脂奶粉或牛血清蛋白。
5.根據權利要求4所述的生物探針的製備方法，其特徵在於，在步驟I)中:所述擴大培養的溫度為35-39°C，轉速為160-200rpm。
6.根據權利要求5所述的生物探針的製備方法，其特徵在於，在步驟3)中: 所述離心的轉速為3800-4200rpm，時間為3_7min ； 所述清洗以及重懸均採用濃度為0.1M、pH為8.0的Tris-HCl，且所述清洗的次數為2-3 次。
7.根據權利要求6所述的生物探針的製備方法，其特徵在於，在步驟3)中: 所述滅活具體包括:在將所述重懸處理後的紅色菌懸液中加入終濃度為I %的甲醛處理 10-30min ； 或，將所述重懸處理後的紅色菌懸液在60-75°C溫育15-50min。
8.根據權利要求3-7任一項所述的生物探針的製備方法，其特徵在於，在步驟4)中: 能夠和被檢測的抗原特異性結合所述抗體的濃度為0.l_5mg/ml，且所述金葡菌載體懸液與所述抗體的體積比為1:50-500 ； 所述孵育的溫度為37°C，時間為30min，轉速為180rpm ； 所述離心收集沉澱中，離心的溫度為4°C，轉速為4000rpm，時間為5min ； 所述清洗以及重懸均採用濃度為0.1M，pH為8.0的Tris-HCl。
9.根據權利要求8所述的生物探針的製備方法，其特徵在於，在步驟5)中: 每100毫升的所述標記有抗體的菌懸液加入的封閉劑的質量為0.1-5克。
10.權利要求3-7任一項所述製備方法獲得的生物探針在腸出血性大腸桿菌0157:H7檢測中的應用。
【文檔編號】G01N33/68GK104198737SQ201410462482
【公開日】2014年12月10日 申請日期:2014年9月11日 優先權日:2014年9月11日
【發明者】危宏平, 胡偉, 楊航, 餘軍平 申請人:中國科學院武漢病毒研究所