一種延長大麥白粉病菌株保存期的方法

2023-12-03 13:05:36 1

專利名稱：一種延長大麥白粉病菌株保存期的方法
技術領域：
本發明涉及作物病原菌保存方法的技術領域，尤其涉及一種大麥白粉病菌 單孢菌株的保存方法。
背景技術：
大麥是世界主要的糧食作物之一，其播種面積僅次於小麥、水稻和玉米，居
第四位。我國大麥麵積和總產次於水稻、小麥、玉米和粟，居第5位。大麥可作 飼用、食用、啤用和保健食品。大麥白粉病是大麥的主要病害之一，多發生在 世界潮溼、半潮溼的大麥產區，在中國大部分大麥產區都有發生，主要發生在 冬大麥區，尤其在西南地區和東南沿海地區發病較重。近年來，由於氮肥使用 量增大，種植密度增高，種植品種單一及暖冬氣候的影響，大麥白粉病害曰益 嚴重，可造成20 30%的產量損失。
大麥白粉病是由布氏白粉病菌大麥專化型(&"頂eria ^ra加'73" 印.#07Y/ei L.,簡稱i^W引起的真菌病害，其病原菌是專化性的活體寄生菌， 屬子囊菌綱白粉菌目。該病菌主要危害葉片，嚴重時也可危害葉鞘、莖禾於和穗 部，從幼苗到成株，均可被病菌侵染。病原菌絲以吸器進入寄主細胞內吸收養 分和水分生長擴展，寄主表面被菌絲體覆蓋後， 一方面影響了光合作用，另一 方面其角質層被破損，氣孔的作用喪失，呼吸作用和蒸騰作用失控，因而導致 全株營養不良，麥苗早衰，易倒伏，麥粒秕瘦，產量降低。大麥白粉病菌與寄 主之間存在著"基因對基因"的關係，因而可利用含有不同抗性基因的大麥鑑 別寄主將大麥白粉菌單孢菌株區分為不同的致病型。但大麥白粉病菌的毒性變異較快，隨著專化性抗病品種的大面積推廣，其品種抗性幾年內就會喪失。因 此通過分析大麥白粉菌群體的毒性結構、分布和動態，可對抗病基因發揮作用 的有效區域進行評價和預測，為前瞻性育種提供依據。用分離保存的不同大麥 白粉病菌致病型菌株接種大麥品種，可全面、準確評價品種的抗病性，鑑定大 麥品種的抗白粉病基因，尋找新抗源，通過合理利用和布局抗病基因可有效控制 大麥白粉病。
分離和保存不同的大麥白粉病菌致病型菌株，是開展大麥白粉病菌毒性基 因遺傳學研究及病原和寄主互作關係研究的先決條件。但大麥白粉病菌是一種 專性寄生菌，只能在活的寄主組織上生長發育。該菌生活史可分為有性生長階 段和無性生長階段。其中，無性生長階段的大麥白粉病菌營養體為菌絲體，主 要在大麥葉表面寄生，通過產生分生孢子進行無性繁殖，並從無性生長發育後 期的菌叢中產生有性繁殖器官閉囊殼，從而進入有性生長階段。其中的雄器和 產囊體配合後，通過質配、核配和減數分裂產生子囊孢子，子囊孢子生長發育 後產生菌絲體後又進入到無性生長階段。在適宜的溫度、溼度和光照條件下， 大麥白粉病菌無性生長階段產生的分生孢子可寄生在有生活力的特定大麥品種 的葉片上，並可重複產生；而大麥有性繁殖器官閉囊殼在菌絲無性生長發育後 期產生，子囊孢子的生成則需要通過質配、核配和減數分裂，故其繁殖後代會 發生變異， 一般不宜通過有性繁殖保存菌株。因此，大麥白粉病菌株主要是利 用其分生孢子侵染感病的活體大麥葉片，並每隔一段時間在活體大麥葉片上轉 接分生孢子的方式進行保存。因為大麥白粉菌在麥葉上進行無性生長的過程中 會不斷吸收營養，導致組織壞死，腐生菌孳生繁衍，營養體短時間內會汙染失 活，難以長時間保存，常規條件下只能保存8-10天；同時分生孢子在頻繁轉接 過程中， 一方面需耗費大量人力、物力，另一方面往往會產生交互感染，致使特定的致病型菌株會在無意中丟失。此外，目前文獻報導中有關保存小麥白粉 病菌株方法的還有(1)將菌株接種到離體葉段上，置於盛有保鮮劑的水瓊脂 培養皿中，加蓋，在低溫下可保存40天；(2)將菌株接種到試管苗上，低溫 下可保存40天，但具體的操作方法未見詳細說明；(3)盆缽中生長的麥苗套管
隔離，將菌株接種到生長的麥苗上，低溫下可保存60天，但該法佔用的空間較
大、耗能多，轉接時需取出帶菌葉片，費時且容易產生交互感染。
因此，人們迫切希望在實驗室條件下，尋求一種操作簡便、省時省力、節 能、並能減少交互感染，大幅延長大麥白粉病菌株保存時間的方法，以便於開 展大麥白粉菌毒性變異及寄主和病原菌互作關係的研究。

發明內容
本發明目的是，針對現行大麥白粉病原菌在大麥活體保存上所存在的保存 期短、費時、費工及在頻繁轉接過程中易產生交互感染等的缺陷，提出一種操 作簡便、省時省力、並能減少不同菌株間的交互感染，能較長時間保存大麥白 粉病菌株的方法，以確保大麥白粉病病原菌相關研究工作的正常開展。..
本發明目的通過以下技術方案來實現。
一種延長大麥白粉病菌保存期的方法，該方法按以下步驟進行 (1)單孢菌株的採集與擴繁於菌株採集前8-10天先播種廣譜高感大麥白 粉病菌品種至二葉一心期，備用；從田間採集帶有單個或多個清晰菌絲體而尚 無孢子產生的葉片，將該葉片剪成單段或多段各帶有單個單孢菌落長2-3 cm的 葉段，並按帶菌面朝上各放入一隻盛有保鮮劑的培養皿中、加蓋，在18-22 。C、 自然光照下，培養1-2 d至單孢菌落產生分生孢子；另取上述廣譜高感大麥白 粉病菌品種植株的第一葉剪成長2-3 cm的新鮮葉段，按一段/每皿放入盛有同上保鮮劑的培養皿中；在超淨工作檯隔離條件下，將上述已產生分生孢子的葉 段按一皿/一段，置於新鮮葉段的上方、敲打幾下後，加蓋；將接種後培養皿 放入光照培養箱內，於16-18 。C,相對溼度90%-95% ,每天16h， 2500-3000 lx 光照條件下進行擴繁培養8-10 d，至有大量分生孢子產生，備用；
(2) 感病大麥試管苗的培育將廣譜高感大麥白粉病菌品種種子，用蒸餾
水浸種後，濾幹，18'C培養24小時至發芽，備用；另準備一批長28釐米、直 徑5釐米，底部設有0.5釐米小孔，管口分別製作成可匹配對接的直口與翻口 的試管，備用；將滅菌後營養土盛入管口形狀相同的試管中，至每支試管管長 的1/4，營養液澆透，放入8-10粒發芽大麥種子/支試管後，再蓋上薄層營養 土，用無菌膜封口；經18-22。C培育8-10天至麥苗2葉l心期，備用；
(3) 大麥試管苗的接種與培養取步驟(2)試管苗垂直置於超淨工作檯 上，先用營養液噴溼葉片，再用鑷子夾住步驟(1)擴繁後帶有大量大麥白粉菌 分生孢子的葉段，伸入試管口內，通過振動將孢子接種到試管苗上後，管口用 無菌膜封住；放入光照培養箱內，於16-18 'C,每天16 h， 2500-3000 lx光照 培養24 h;每結束一支大麥試管苗的接種後用75%酒精對超淨工作檯進行滅菌， 以防下一菌株接種時產生交互感染；
(4) 大麥白粉病菌株的保存與轉接將步驟(3)經接種、培養後的試管 苗置於培養箱中，在5'C，每天16 h， 2500-3000 lx光照下該菌種可生長、保存 60-70天； 一般保存至60天後，即將該感菌的試管苗拆封口並倒置，另取一支 步驟(2)的管口形狀與該感菌試管苗管口相匹配的大麥試管苗，置於其下方並將上下兩試管管口相對接，通過振動將大麥白粉菌孢子轉接到下方的試管苗上， 管口用75%酒精滅菌後，用無菌膜封住；對超淨工作檯消毒後，在同上方式、條 件下進行其它菌株的轉接、培養與保存；如此循環，以實現實驗室長久保存大 麥白粉病菌株。
所述保鮮劑由1%水瓊脂與苯並咪唑按1000g : 40mg比例配製而成。—
所述營養液由lg/LNaN03、 0.25g/LKN03、 0. 25g/L MgS04、 0. 25g/L KH2P04、 O.Olg/L FeCl3、餘量為蒸餾水配製而成。
所述營養土為全元素有機培養基，偏酸性，由東北長白山清河草炭基地生 產，經滅菌鍋，12rC加熱30分鐘後使用。
本發明的有益效果是
(1) 本發明所設計提出的試管管口匹配結構和以試管苗活體進行接種的方 法，這既簡單實用，操作方便，大大提高了接種效率，又有效防止了不同菌株 間的交互感染；如試管內播種一定數量的種子，利用適量的營養土和營養液培 育麥苗，麥苗生長健旺，根系發達，牢固保土，接種時試管苗雖需倒置操作， 但土和苗仍不會脫落；試管底部設有0. 5釐米的小孔，既能排除多餘的營養液 或水分，當試管苗缺水時僅需將管底浸入水中即可由該小孔吸水補充，操作便 利，省時省力，並減少交互感染；同時本發明將保存菌株試管苗存放在光照培 養箱中，具有佔用空間小，耗能少，明顯降低了菌種的保存成本。
(2) 本發明利用的主要原理， 一方面是採用試管苗活體進行接種，能不斷 補充水分與營養而大大延遲了接種載體的壞死時間；另一方面是先在常溫下接種、培養24小時內，當白粉病菌孢子芽管生成產生侵入絲，侵入麥葉表皮細胞 形成初生吸器後，及時降低了感菌試管苗的保存溫度(5°C)，這既使麥苗和菌 株在低溫下緩慢生長，也更推遲了麥苗組織的衰敗時間，從而取得了明顯延長 大麥白粉病菌株保存期的有益效果，由常規方法的8-10天，延長至本發明的 60-70天。
具體實施例方式
通過以下實施例對本發明作進一步的詳細說明，但本發明的內容並不局限 於此。
營養土全元素有機培養基，偏酸性，東北長白山清河草炭基地生產； 苯並咪唑化學純，國藥集團化學試劑有限公司； 瓊脂化學純，北京鼎國生物技術有限公司；
NaM)s:分析純，杭州精細化工有限公司； KN03:分析純，汕頭西隴化工有限公司； MgS04:分析純，溫州市化學用料廠； KH2P04:分析純，湖州湖試化學試劑有限公司； FeCl3:分析純，國藥集團化學試劑有限公司；無菌膜上海稼豐園藝用品有限公司生產；
大麥廣譜高感白粉病品種浙秀12，浙江省農業科學院作物與核技術利用 研究所大麥分中心育種、鑑定。 -
實施例l:(一種延長大麥白粉病菌保存期的方法l) 該方法按以下步驟進行
(1) 單孢菌株的採集與擴繁菌株採集前8-IO天先播種廣譜高感大麥白粉 病菌品種"浙秀12"至二葉一心期後，備用；從田間採集僅帶有單個清晰菌絲 體,而尚無孢子產生的葉片；從葉片中剪下帶有該單個單孢菌落長2-3 cm的葉 段，並按帶菌面朝上放入盛有由W。水瓊脂與苯並咪唑按1000g : 40mg比例配製而 成保鮮劑的培養皿中、加蓋，置室溫18-22°C、自然光照條件下培養1-2 d , 即該葉段尚未發生黴菌感染敗壞，而單孢菌落已產生分生孢子時；另取上述二 葉一心期廣譜高感品種植株的第一葉，將葉片剪成長2-3 cm的新鮮葉段3-5段，在 隔離條件下，按一段/每皿分別放入盛有同上保鮮劑的培養皿中；在超淨工作 臺上，將上述田間採集的已產生分生孢子的葉段按一皿/一段，置於新鮮葉段的 上方、敲動幾下進行接種後，加蓋；將接種後培養皿放入光照培養箱內，於16-18 °C，相對溼度90%-95% ，每天16 h ， 2500-3000 lx光照條件下進行擴繁培養8-10 d，至有大量分生孢子產生，而葉片仍持綠，未被黴菌感染，備用；
(2) 感病大麥試管苗的培育將廣譜高感大麥白粉病菌品種種子，用蒸餾 水浸種24 h後(種子量根據轉接保存的菌株數量確定)，濾幹水分後種子再放入 燒杯中，種子上面蓋兩層濾紙放入生化培養箱中，18t培養24小時發芽，備用； 另準備一批長28釐米、直徑5釐米，底部設有0.5釐米小孔，管口分別製作成可 匹配對接的直口與翻口，備用；將東北長白山清河草炭基地生產的營養土經滅菌鍋12rC加熱30分鐘滅菌後，盛入直口或翻口試管中至管長的1/4,營養液澆透至部分從小孔流出，按每支放入8-IO粒發芽大麥種子後，蓋上薄層營養土，管口用無菌膜封住；經18-22。C培育8-IO天，至麥苗2葉1心期，備用； —
所述營養液由lg/L NaN03、 0. 25g/l跳、0. 25g/l MgS04、 0. 25g/l KH2P04、0.01g/l FeCl3、餘量為蒸餾水配製而成；
(3)大麥試管苗的接種與培養取步驟(2)試管苗垂直置於超淨工作檯上，
先用同上營養液噴溼葉片，再用鑷子(經過75%的酒精消毒)夾住步驟(1)擴
繁後帶有大量大麥白粉菌分生孢子的葉段，伸入試管口內5釐米處，通過振動
將孢子接種到試管苗上，管口經75%酒精擦過滅菌後，用無菌膜封口；放入光照
培養箱內，於16-18 °C， 2500-3000 lx光照16 h條件下培養24 h，至孢子發芽
並侵入麥葉表皮細胞；每結束一支大麥試管苗的接種後用75%酒精對超淨工作檯
上空間噴霧，落下孢子滅菌，以備下一個菌株接種，防止交互感染；
(4)大麥白粉菌株的保存與轉接將步驟(3)經接種、培養後的帶菌試
管苗放入光照培養箱中，於5t、每天16 h、 2500-3000 lx光照下培養，可以
生長、保存60-70天； 一般當保存至60天後，即將感菌的試管苗拆封口並倒置，
另取一支步驟(2)的管口形狀(如直口)與該感菌試管苗管口 (如翻口)相匹
配的大麥試管苗，置於其下方並將上下兩試管的管口相對接，通過振動將大麥
白粉菌分生孢子轉接到下方的試管苗上，管口用75%酒精滅菌後，無菌封口膜封
口；並用75%酒精對超淨工作檯上空間噴霧，落下孢子滅菌，以備下一菌株接種
保存，防止交互感染；同上方法培養後再保存約60-70天後，再用同法轉接、保存，如此循環，可在實驗室長久保存大麥白粉病菌株。
實施例2:(—種延長大麥白粉病菌保存期的方法2)
本實施例方法，除在步驟(1)從田間採集帶有多個清晰菌絲體而尚無孢子
產生的葉片，並將該葉片剪成多段各帶有單個單孢菌落長2-3cm的葉段外，其餘的步驟、方法、工藝同於實施例l。
權利要求
1、一種延長大麥白粉病菌保存期的方法，其特徵在於按以下步驟進行(1)單孢菌株的採集與擴繁於菌株採集前8-10天先播種廣譜高感大麥白粉病菌品種至二葉一心期，備用；從田間採集帶有單個或多個清晰菌絲體而尚無孢子產生的葉片，將該葉片剪成單段或多段各帶有單個單孢菌落長2-3cm的葉段，並按帶菌面朝上各放入一隻盛有保鮮劑的培養皿中、加蓋，在18-22℃、自然光照下，培養1-2d至單孢菌落產生分生孢子；另取上述廣譜高感大麥白粉病菌品種植株的第一葉剪成長2-3cm的新鮮葉段，按一段/每皿放入盛有同上保鮮劑的培養皿中；在超淨工作檯隔離條件下，將上述已產生分生孢子的葉段按一皿/一段，置於新鮮葉段的上方、敲打幾下後，加蓋；將接種後培養皿放入光照培養箱內，於16-18℃，相對溼度90％-95％，每天16h，2500-3000lx光照條件下進行擴繁培養8-10d，至有大量分生孢子產生，備用；(2)感病大麥試管苗的培育將廣譜高感大麥白粉病菌品種種子，用蒸餾水浸種後，濾幹，18℃培養24小時至發芽，備用；另準備一批長28釐米、直徑5釐米，底部設有0.5釐米小孔，管口分別製作成可匹配對接的直口與翻口的試管，備用；將滅菌後營養土盛入管口形狀相同的試管中，至每支試管管長的1/4，營養液澆透，放入8-10粒發芽大麥種子/支試管後，再蓋上薄層營養土，用無菌膜封口；經18-22℃培育8-10天至麥苗2葉1心期，備用；(3)大麥試管苗的接種與培養取步驟(2)試管苗垂直置於超淨工作檯上，先用營養液噴溼葉片，再用鑷子夾住步驟(1)擴繁後帶有大量大麥白粉菌分生孢子的葉段，伸入試管口內，通過振動將孢子接種到試管苗上後，管口用無菌膜封住；放入光照培養箱內，於16-18℃，每天16h，2500-3000lx光照培養24h；每結束一支大麥試管苗的接種後用75％酒精對超淨工作檯進行滅菌，以防下一菌株接種時產生交互感染；(4)大麥白粉病菌株的保存與轉接將步驟(3)經接種、培養後的試管苗置於培養箱中，在5℃，每天16h，2500-3000lx光照下該菌種可生長、保存60-70天；一般保存至60天後，即將該感菌的試管苗拆封口並倒置，另取一支步驟(2)的管口形狀與該感菌試管苗管口相匹配的大麥試管苗，置於其下方並將上下兩試管管口相對接，通過振動將大麥白粉菌孢子轉接到下方的試管苗上，管口用75％酒精滅菌後，用無菌膜封住；對超淨工作檯消毒後，在同上方式、條件下進行其它菌株的轉接、培養與保存；如此循環，以實現實驗室長久保存大麥白粉病菌株。
2、 按權利要求1所述的方法，其特徵在於所述保鮮劑由1%水瓊脂與苯並咪 唑按1000g : 40mg比例配製而成。
3、 按權利要求1所述的方法，其特徵在於所述營養液由lg/LNaN03、0. 25g/L 跳、0.25g/L MgS04、 0.25g/L KH2P04、 0. Olg/L FeCl3、餘量為蒸餾水配製而 成。
4、 按權利要求1所述的方法，其特徵在於所述營養土為全元素有機培養基， 偏酸性，由東北長白山清河草炭基地生產，經滅菌鍋，12rC加熱30分鐘後使 用。全文摘要
本發明公開了一種延長大麥白粉病菌株保存期的方法，屬於作物病原菌保存方法的技術領域。該方法包括(1)單孢菌株的採集與擴繁；(2)感病大麥品種試管苗的培育；(3)大麥試管苗的接種與培養；(4)大麥白粉病菌株的保存與轉接等步驟。本方法能顯著延長大麥白粉病菌株的保存期，由常規方法的8-10天延長至60-70天；並能克服容易產生交互感染，導致一些特定致病型菌株的丟失及操作煩瑣、耗費人力、物力較大等的缺陷，以確保大麥白粉病病原菌相關研究工作的正常開展。本發明可以在大麥病害研究與育種機構中推廣應用。
文檔編號C12N1/14GK101654659SQ200910152419
公開日2010年2月24日 申請日期2009年9月8日 優先權日2009年9月8日
發明者為 華, 毅 尚, 朱靖環, 楊建明, 峰 林, 汪軍妹, 賈巧君 申請人:浙江省農業科學院