一種t+1斷裂蛋白質內含子的構建方法

2023-12-02 04:21:36 3

專利名稱：一種t+1斷裂蛋白質內含子的構建方法
技術領域：
本發明屬T+1斷裂蛋白質內含子的構建領域，特別是涉及一種T+1斷裂蛋白質內 含子的構建方法。
背景技術：
蛋白質含子(intein)是前體蛋白質(precursorprotein)中的一段插入序列。 蛋白質內含子兩側的胺基酸序列被稱為蛋白質外顯子(extein)。在前體蛋白質的翻譯 後成熟過程中蛋白質內含子從前體蛋白質中自我切除，兩側的蛋白質外顯子以天然肽鍵 連接，這一成熟過程被稱為蛋白質內含子介導的蛋白質剪接(intein-mediated protein splicing) 0常見蛋白質內含子按照其結構特徵分為三類標準蛋白質內含子(canonical intein)，微小蛋白質內含子(mini-intein)和斷裂蛋白質內含子(split intein) 0其中 標準蛋白質內含子(canonical intein)由N端剪接區域、中部歸巢核酸內切酶區域和C端 剪接區域組成。N端剪接區域和C端剪接區域形成蛋白質剪接結構域，參與蛋白質剪接過 程；中部歸巢核酸內切酶區域獨自形成歸巢核酸內切酶結構域，參與蛋白質內含子的歸巢 過程。某些intein在進化過程中丟失或運用人工手段移去核酸內切酶結構域，由長度不等 的linker連接兩端的剪接結構域，成為微小蛋白質內含子(mini-intein)。典型的蛋白質 內含子元件含有A，B，F和G四個保守的蛋白質剪接模塊歸巢核酸內切酶的序列位於模塊B 和F之間。而絕大部分天然或人工型斷裂蛋白質內含子在模塊B和F之間斷裂，編碼序列 位於兩個閱讀框架中，產生C端蛋白質內含子片段(I。)和N端蛋白質內含子片段(IN)。翻 譯後的兩部分序列能夠相互識別，進行反式剪接(trans-splicing)。split intein的這一 特性已被成功應用於蛋白質研究中，例如蛋白質的自身環化、作為標籤輔助蛋白質純化、蛋 白質特異位點的修飾、基因治療以及蛋白與蛋白之間的相互作用和細胞定位等研究。蛋白質內含子的分子機制包括剪接位點的N-S(N-O)醯基轉化，分支中間物的形 成，天冬醯胺殘基的環化和自發的S-N(O-N)的醯基重排四步反應。C端外顯子(C-extein) 的第一個胺基酸殘基較為保守，一般為Cys/Ser/Thr，普遍認為該胺基酸在蛋白內含子自我 剪接反應中意義重大，它所發動的親核進攻使N端內含子與外顯子間發生斷裂，由此推進 剪接反應的進程。因此按C-extein首位胺基酸種類將蛋白質內含子劃分為Cys+1 (C+1)、 Ser+1 (S+1)和Thr+1 (T+1)型三類。然而應用於研究中的蛋白質內含子均為C+1和S+1型， 它們僅在Cys和Ser前插入後行使功能，而在Thr前面插入時喪失原有剪接活性。這無疑 限制了 intein在蛋白質研究領域的應用範圍，獲得一類對C-extein首位胺基酸通用性高 的split intein對其得到廣泛應用具有重要意義。

發明內容
本發明所要解決的技術問題是提供一種T+1斷裂蛋白質內含子的構建方法，方法 簡單，轉換成c+1型或S+1型split intein後它仍具有剪接能力，具有較高通用性。本發明的一種T+1斷裂蛋白質內含子的構建方法，包括
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(1)利用兩條PCR引物對目的基因進行擴增；引物序列上遊引物為 5，-AAGTTAATCAACCATGGTGATGATGGTGATGACC-3，，下遊引物 為 5' -AAGGAGGAAAAACATATGGGCAGTGGATCCGGTCTGCAA-3'；或引物序列上遊引物為5，-AAGTTAATCAATTAACATAAATTTCTGTATCGTG-3，，下遊引 物為 5』 -AAGGAGGAAAAACATATGGGTATGGTAATGGAAGCAGAA-3'；(2)將上述PCR產物自連轉化感受態細胞後得到的質粒經限制性內切酶雙酶切， 回收600-700bp小片段；(3)利用限制性內切酶雙酶切PMBT-O質粒，並回收6000-7000片段，然後與上述小 片段進行連接轉化，得到pMSnf-S質粒。所述步驟⑴使用的模板為pUCSnf-m 在NCBI的intein資料庫中獲得 Ter Snf2的序列，通過基因合成方法去除124_424bp的長度為199bp的序列並替換為 Iinker(ASGHHHHHHHGGSGSG)即為 Snf-m(mini-intein)，將其裝在上下遊含有 XhoI 和 AgeI 兩酶切位點的PUC 57載體中。所述步驟(2)或(3)中的限制性內切酶為XhoI ^P AgeLXhoI和AgeI的摩爾比為 2 I0所述步驟(2)中所使用的PCR方法為Inverse PCR(反應程序:94°C,3min ；95°C, 30s, 54°C，30s, 72°C，80s, 30 個循環；72°C，5min)。所述步驟(3)中所使用的pMBT-Ο質粒在NCBI的intein資料庫中獲得Ter DnaB-I的序列，通過基因合成方法將其裝在上下遊含有XhoI和AgeI兩酶切位點的載體中， 屬pMAL載體。本發明利用XhoI和AgeI雙酶切鑑定pMSnf-S質粒，運用western blot檢測 pMSnf-S在Ε. coli體內的剪接活性。利用本發明的方法可以將蛋白質內含子在任意處斷 開，並對活動活性更高的應用型Τ+1蛋白質內含子提供方法。本發明對來源於真細菌藻青菌(Cyanobacterium)所編碼的SNF2/Rad54解旋酶基 因中的Ter Snf2 intein展開研究。將其人工斷裂改造並克隆於pMST表達載體中，獲得 首個具有剪接活性的兩類T+1型斷裂蛋白質內含子，其介導的蛋白反式剪接效率分別達到 53. 5%和33. 3%。採用特定鹼基取代法研究intein插入位點的適應性，以及對剪接效率的 影響，研究結果表明將其轉換成C+1型或S+1型split intein後它仍具有剪接能力，具有 較高通用性。其具體實驗流程如圖1所示。通過序列比對，人工構建的方法，實現從天然C端外顯子為蘇氨酸(Thr)的標準蛋 白質內含子(Ter Snf2)構建出一類T+1型斷裂蛋白質內含子，為蛋白質反式剪接技術在 蛋白質工程領域廣泛應用提供了契機。截止到2010年7月InBase Intein DateBase中 共收錄Intein數目約為600個，據統計T+1型、C+1型和S+1型intein的數目比例約為 2:5:5。含巰基胺基酸Cys在蛋白質中出現的頻率較低，這使得C+1型intein的應用 價值並不顯著，然而Thr的出現率較高，因此獲得在Thr前發生高效剪接的斷裂intein必 然會有較好的應用前景。有益效果本發明的方法簡單，轉換成C+1型或S+1型split intein後它仍具有剪接能力， 具有較高通用性。


圖1T+1斷裂蛋白質內含子的構建示意圖；M 麥芽糖結合蛋白，T 硫氧還蛋白， TGA 終止密碼子，ATG 起始密碼子，In Snf-SO或Snf-Sl的N端，Ic Snf-SO或Snf-Sl的 C端；圖2inVerSePCR瓊脂糖凝膠電泳圖；圖3pMSnf-S0和pMSnf-Sl利用XhoI和AgeI雙酶切後瓊脂糖凝膠電泳驗證圖；圖4western blot檢測pMSnf-SO和pMSnf-Sl在Ε. coli體內的剪接活性驗證圖。
具體實施例方式下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明 而不用於限制本發明的範圍。此外應理解，在閱讀了本發明講授的內容之後，本領域技術人 員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定 的範圍。實施例1以T+1斷裂蛋白質內含子Snf-SO的構建為例。(1)利用兩條PCR引物對目的基因進行擴增；所述使用的模板為pUCSnf-m 在NCBI的intein資料庫中獲得Ter Snf2 的序列，通過基因合成方法去除124-424bp的長度為199bp的序列並替換為 Iinker(ASGHHHHHHHGGSGSG)即為 Snf-m(mini-intein)，將其裝在上下遊含有 XhoI 和 AgeI 兩酶切位點的PUC 57載體中；SO 的上遊引物為 5，-AAGTTAATCAACCATGGTGATGATGGTGATGACC-3，，SO 的下遊引物 為 5，-AAGGAGGAAAAACATATGGGCAGTGGATCCGGTCTGCAA-3，；擴增的 PCR 產物(見圖 1)；擴增 後的產物大小為618bp ；(2)將上述PCR產物自連轉化感受態細胞後得到的質粒經XhoI和AgeI雙酶切(摩 爾比為2 1)，回收603bp小片段；雙酶切體系為10μ1質粒，3μ1 10 X 0 Buffer，1. 5 μ 1 XhoO. 75 μ IAge I用ddH20不足至30μ 1，37°C反應4小時，利用膠回收試劑盒回收酶切產 物；(3)利用XhoI和AgeI雙酶切pMBT-Ο質粒，並回收6964bp片段，然後與上述小片 段進行連接轉化，得到質PMSnf-SO質粒。(見圖3)(4)利用XhoI和AgeI雙酶切鑑定pMSnf-SO質粒；(5)運用western blot檢測pMSnf-SO在Ε. coli體內的剪接活性(見圖4)。實施例2以T+1斷裂蛋白質內含子Snf-Sl的構建為例。(1)利用兩條PCR引物對目的基因進行擴增；Sl的上遊引物為5』_AAGTTAATCAATT AACATAAATTTCTGTATCGTG-3，，Sl 的下遊引物為 5，_AAGGAGGAAAAACATATGGGTATGGTAATGGAAGC AGAA-3』 ；擴增的PCR產物(見圖1)；擴增後的產物大小為618bp ；(2)將上述的PCR產物自連轉化感受態細胞後得到的質粒經XhoI和AgeI雙酶切 (摩爾比為2 1)，回收603bp片段；雙酶切體系為10μ 1質粒，3μ 110X0 Buffer，1. 5μ 1
5XhoO. 75 μ IAge I用ddH20不足至30 μ 1，37°C反應4小時，利用膠回收試劑盒回收酶切產 物；(3)利用XhoI和AgeI雙酶切pMBT-Ο質粒，並回收6964bp片段，然後與步上述小 片段進行連接轉化，得到pMSnf-Sl質粒；(見圖3)(4)利用XhoI和AgeI雙酶切鑑定pMSnf-Sl質粒；(5)運用western blot檢測pMSnf-Sl在Ε. coll體內的剪接活性(見圖4)。
權利要求
一種T+1斷裂蛋白質內含子的構建方法，包括(1)利用兩條PCR引物對目的基因進行擴增；引物序列上遊引物為5』 AAGTTAATCAACCATGGTGATGATGGTGATGACC 3』，下遊引物為5』 AAGGAGGAAAAACATATGGGCAGTGGATCCGGTCTGCAA 3』；或引物序列上遊引物為5』 AAGTTAATCAATTAACATAAATTTCTGTATCGTG 3』，下遊引物為5』 AAGGAGGAAAAACATATGGGTATGGTAATGGAAGCAGAA 3』；(2)將上述PCR產物自連轉化感受態細胞後得到的質粒經限制性內切酶雙酶切，回收600 700bp小片段；(3)利用限制性內切酶雙酶切pMBT 0質粒，並回收6000 7000bp片段，然後與上述小片段進行連接轉化，得到pMSnf S質粒。
2.根據權利要求1所述的一種T+1斷裂蛋白質內含子的構建方法，其特徵在於所述 步驟(2)或(3)中的限制性內切酶為XhoI和AgeI, XhoI和AgeI的摩爾比為2:1。
3.根據權利要求1所述的一種T+1斷裂蛋白質內含子的構建方法，其特徵在於所述 步驟(2)中所使用的PCR方法為Inverse PCR0
4.根據權利要求1所述的一種T+1斷裂蛋白質內含子的構建方法，其特徵在於所述 步驟(3)中所使用的pMBT-Ο質粒，屬pMAL載體。全文摘要
本發明涉及一種T+1斷裂蛋白質內含子的構建方法，包括(1)利用兩條PCR引物對目的基因進行擴增；(2)將上述PCR產物自連轉化感受態細胞後得到的質粒經限制性內切酶雙酶切，回收小片段；(3)利用限制性內切酶雙酶切pMBT-0質粒，並回收大片段，然後與上述小片段進行連接轉化，得到pMSnf-S質粒。本發明簡單，轉換成C+1型或S+1型split intein後它仍具有剪接能力，具有較高通用性。
文檔編號C12N15/11GK101974515SQ20101051018
公開日2011年2月16日 申請日期2010年10月18日 優先權日2010年10月18日
發明者孟清, 王瑾 申請人:東華大學