一種含神經營養因子的殼聚糖人工神經移植物及製備方法
2023-12-01 15:06:46 1
專利名稱：一種含神經營養因子的殼聚糖人工神經移植物及製備方法
技術領域：
本發明涉及醫療器械領域，特別涉及一種含神經營養因子人工神經移植物及其製備方法。
背景技術：
現實社會中交通事故、工傷事故、運動意外及臨床手術等事件均會造成周圍神經損傷，臨床上但當中長距離的神經缺損不能依靠端對端的縫合來彌補神經缺失時，就不得不依靠移植物來橋接修復。近年來，基於生命科學與工程學的原理和技術發展起來的組織工程學為構建神經移植替代品提供了一條新的出路。採用組織工程技術修復神經損傷的研究主要集中在設計和構建新的組織工程神經橋接裝置，目前這類橋接物通常是單獨採用生物材料，通過將其加工成管狀結構的神經引導通道，為神經的再生提供適當的空間和引導作用。但對於長距離、粗大神經缺損，這類單純由生物材料組成的導管由於缺乏神經營養因子等微環境物質的支持，取得的修復效果非常有限。這可能是因為長距離神經缺損修復早期，神經斷端內細胞分泌的神經營養因子有限，難以在長距離或較粗的神經導管中發揮作用。神經營養因子(NTF)是一組超出普通維持生存所必須的基本營養物質以外的、對神經細胞起特殊營養作用的多肽分子。研究表明神經營養因子在胚胎發育、細胞分化、創傷癒合、免疫調節及腫瘤發生等方面都發揮著重要的生物學調節作用。各種NTF因子在單獨發揮作用的同時，還通過相互促進和協同作用產生放大效應，使它們在體內發揮出更大的生物學活性。這些神經營養因子包括神經生長因子(NGF)、鹼性成纖維生長因子(bFGF)、神經營養素_3 (NT-3)、腦源性神經營養因子(BDNF)、神經營養素-4 (NT-4)、膠質細胞源性神經營養因子(⑶NF)等。現有研究表明，在神經缺損修復中需要生物微環境如神經營養因子等物質的作用，這提示人工神經移植物上含有一定濃度的神經營養因子，將能夠提高缺損神經的修復效果，尤其是對長距離、粗大神經缺損。因此，理想的組織工程人工神經移植物應該包含支架材料、神經營養因子和種子細胞三部分，其中要求具有良好的生物相容性和生物降解吸收功能，並具備適宜的機械性能、三維結構和一定的通透性；神經營養因子應具有合適濃度、良好釋放率和儘量長的釋放時間。目前用於人工神經移植物材料一類是自體非神經組織，如靜脈導管，但其機械強度不夠，易於塌陷。另一類包括(1)不可降解吸收材料，如矽膠管、聚四氟乙烯等，這些材料不能夠被人體吸收，長時間存在可引起慢性的異物反應，對再生的神經造成損傷；(2)可降解吸收材料，如聚乳酸、聚乙烯酸、殼聚糖等。殼聚糖為一種天然高分子聚合物，具有穩定的化學性質，有著良好的生物相容性，安全無毒，還具有抗凝血等多種生物活性和優良的抗菌性，且容易獲得。有文獻公開了應用殼聚糖神經導引管作為神經再生室橋接大鼠坐骨神經缺損，結果表明殼聚糖神經導引管為大鼠坐骨神經再生提供一個良好的再生微環境，再生坐骨神經功能恢復良好(於炎冰等，殼聚糖導管橋接周圍神經缺損的實驗研究，中華神經外科雜誌，2000，Vol. 16，No. 6, P375-378)。中國專利99123745. 5公開了一種用於神經修復的導管，主要由殼聚糖、明膠、戊二醛、醋酸、氫氧化鈉、多聚賴氨酸組成。但是作為交聯劑的戊二醛具有一定的毒性。隨著人工神經移植物材料研究的逐漸成熟和完善，在材料上固定神經生長因子這方面的研究逐步成為神經再生領域的一個研究熱點。中國專利01136314. 2，公開了一種引導和促進神經有效再生的脫乙醯度為15-45%的甲殼質生物套管，該套管管壁上還可以進一步包括0. 3%-3%的海藻鹽和5-10% 的促神經生長因子藥物。但是該法製得的套管缺乏豐富的能提供神經軸突攀附生長的管道。中國專利20041009259. 9公開了一種由殼聚糖外管壁和具有軸向多通道的生物來源填充基質組成的神經組織工程管狀支架，該支架具有7 50的軸向通道，通道內徑為200 500 μ m，各通道間具有相互連通的微孔。但該法需要將多根一定直徑的不鏽鋼針平行貫穿固定在殼聚糖管內，步驟繁瑣且產品孔徑較大，神經導管抗拉強度有限。
發明內容
本發明的目的在於提供一種含神經營養因子的殼聚糖人工神經移植物及其製備方法。本發明的技術解決方案是
一種含神經營養因子的殼聚糖人工神經移植物，包括殼聚糖人工神經移植物支架和神經營養因子，其特徵在於所述殼聚糖人工神經移植物支架管腔內分布有豐富的孔隙，促進神經再生的神經營養因子均勻吸附固定在支架管腔內外表面以及管腔內的孔隙表面。上述殼聚糖人工神經移植物支架為孔隙率為50%_90%且孔徑為IOMm-IOOMm的具有多孔結構抗拉強度高的神經導管。支架內徑為0. 5-8mm，壁厚0. l_3mm。上述殼聚糖人工神經移植物支架不含有發泡劑和/或交聯劑。本發明所述殼聚糖人工神經移植物支架吸附固定的神經營養因子是鹼性成纖維生長因子(bFGF)、腦源神經營養因子(BDNF)、神經營養因子3( NT-3 )、鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)、膠質細胞源神經營養因子(⑶NF )中的一種或幾種。本發明還提供了一種所述殼聚糖人工神經移植物支架的製備方法，步驟包括
(1)將弱酸溶解殼聚糖得到濃度為3%-6%的溶液，將溶液倒入模具，置於-60°c-90°C， 冷凍2-4小時；
(2)將冷凍後殼聚糖冰體置於鹼性溶液中和固定，用水清洗；
(3)對步驟(2)得到的定型的殼聚糖冷凍乾燥，得到具有多孔結構、抗拉強度高的殼聚糖神經移植物支架；
(4)將殼聚糖神經移植物支架浸泡在神經營養因子溶液中，利用材料表面豐富的孔隙吸附固定神經營養因子。上述步驟得到的吸附有神經營養因子的神經移植物支架可直接進行使用，或者還可以將其進一步進行凍幹，便於長期保存和運輸使用。上述殼聚糖人工神經導管通過將殼聚糖用弱酸溶解、注模、冷凍成型、中和固定、 清洗、冷凍乾燥工藝，將殼聚糖加工成具有多孔結構、抗拉強度高的神經導管。在製造過程中，可以通過改變殼聚糖溶液的濃度來調節導管管壁的孔隙率，殼聚糖溶液濃度越高，所得到的產品越緻密，孔隙率越低；通過改變冷凍成型溫度調節所生成的冰晶大小以控制殼聚糖導管管壁的孔徑，冷凍溫度越低，生成冰晶越小，所得產品孔徑就越小。此外可通過改變殼聚糖的脫乙醯化程度以控制導管的降解速度，脫乙醯化程度越高，導管降解速度越快。上述殼聚糖人工神經導管的製備方法使用的弱酸是醋酸、磷酸、檸檬酸、乳酸中的任意一種或幾種。將本發明所述殼聚糖人工神經導管預先稱重後浸泡於已知濃度和體積的市售神經營養因子產品溶液(例如30yg/2ml的NGF溶液)中，用常規神經營養因子ELISA方法檢測並計算浸泡液中殘留的神經營養因子的量，可計算得到吸附固定在神經導管上的神經營養因子的量。通過浸泡時間控制本發明產品每克神經導管上吸附神經營養因子的量為 1 μ g-10mgo使用掃描電鏡檢測本發明所述人工神經移植物支架孔徑為lOMffl-lOOMffl。採用常規乙醇浸泡法測定本發明所述人工神經移植物支架孔隙率為50%_90%。本發明產品具有穩定的結構，合適的孔徑、孔隙率及通透性，能夠模擬正常神經結構，能夠提供軸突攀附生長的管道及神經營養因子，並且可以承載利於神經修復和再生的細胞，本發明的產品含神經營養因子，所用殼聚糖材料為天然可降解性材料，與人體有著良好的生物相容性，製得的產品不含有由製備工藝帶入的外源性毒、副作用的發泡劑和交聯劑。由於本發明導管管壁具有相對於現有技術公開的神經導管更小的孔徑和更高的孔隙率和比表面積，使得本發明所述導管具有更好的抗拉強度且能夠更好的吸附神經營養因子， 更有利於輸送神經細胞生長過程所需的營養物質，給神經細胞提供良好的生長環境。使用效果好。本發明利用控制殼聚糖溶液濃度和冷凍溫度來控制神經導管孔隙率和孔徑，方法簡便易行，此外，可將製備好的神經導管浸泡吸附固定神經營養因子直接用於手術，或者將製備好的神經導管浸泡在神經營養因子溶液中吸附固定，再進行凍幹，便於長期保存和運輸，使用方便。由於神經營養因子為活性蛋白或肽類，很容易受到環境影響而失去活性，本發明將現有技術中將神經營養因子溶液加入到製備神經導管的材料中進行制模成型改為先製備好神經導管，再浸泡吸附固定，這能夠更好的保證神經營養因子的活性。通過將本發明產品在體外與神經組織細胞聯合培養，經形態觀察、酶代謝活力測定、神經生長因子的測定，顯示該產品具有良好的生物相容性。在大鼠動物體內使用該產品修復坐骨神經1釐米距離缺損，結果表明該產品能有利於神經再生，導致恢復損傷神經功能的恢復，同時該產品具有很好的組織相容性。下面結合實施例對本發明作進一步說明。
具體實施方式
。實施例1
用濃度為0. 5%的乳酸溶解殼聚糖得到殼聚糖的濃度為3%溶液。然後將溶液注入模具，經-60°C冷凍預成型後，將材料退出模具，放入5%氫氧化鈉溶液，中和材料中的酸，固定成型後，用蒸餾水將過量的鹼及生成的鹽清洗乾淨後，放置到15yg/ml的神經生長因子 (NGF)溶液中，利用材料表面豐富的孔隙固定30分鐘。然後經冷凍乾燥得到含神經營養因子的殼聚糖人工神經移植物，孔隙率89%，平均孔徑為87-98 μ m。實施例2
用濃度為8%的醋酸溶解殼聚糖得到殼聚糖的濃度為5%溶液。然後將溶液注入模具，經-80°C冷凍預成型後，將材料退出模具，放入到10%碳酸鈉溶液中，中和材料中的酸固定成型後，用蒸餾水將過量的鹼及生成的鹽清洗乾淨後，然後經冷凍乾燥得到殼聚糖人工神經移植物。在使用前，將殼聚糖人工神經移植物放置到20μ g/ml鹼性成纖維生長因子 (bFGF)溶液中，利用材料表面豐富的孔隙固定1小時。然後經冷凍乾燥得到含神經營養因子的殼聚糖人工神經移植物，孔隙率77%，平均孔徑為55-67 μ m。
實施例3
用濃度為2%的磷酸溶解殼聚糖得到殼聚糖的濃度為6%溶液，然後將溶液注入模具， 經-90°C冷凍預成型後，將材料退出模具，放入到5%氫氧化鈉溶液中，中和材料中的酸固定成型後，用蒸餾水將過量的鹼及生成的鹽清洗乾淨後，然後經冷凍乾燥得到殼聚糖人工神經移植物。在使用前，將殼聚糖人工神經移植物放置到20 μ g/ml腦源神經營養因子(BDNF) 溶液中，利用材料表面豐富的孔隙固定2小時。然後經冷凍乾燥得到含神經營養因子的殼聚糖人工神經移植物，孔隙率53%，平均孔徑為11-23 μ m。
權利要求
1.一種含神經營養因子的殼聚糖人工神經移植物，包括殼聚糖人工神經移植物支架和神經營養因子，其特徵在於所述殼聚糖人工神經移植物支架管腔內分布有豐富的孔隙，促進神經再生的神經營養因子均勻吸附固定在支架管腔內外表面以及管腔內的孔隙表面。
2.如權利要求1所述殼聚糖人工神經移植物，其特徵在於所述殼聚糖人工神經移植物支架為孔隙率為50%_90%且孔徑為IOMffl-IOOMffl的具有多孔結構抗拉強度高的神經導管。
3.如權利要求2所述殼聚糖人工神經移植物，其特徵在於所述殼聚糖人工神經移植物支架內徑為0. 5-8mm，壁厚0. l_3mm。
4.如權利要求1所述殼聚糖人工神經移植物，其特徵在於所述殼聚糖人工神經移植物支架不含有發泡劑和/或交聯劑。
5.如權利要求1-4任一項所述殼聚糖人工神經移植物，其特徵在於所述神經營養因子是鹼性成纖維生長因子(bFGF)、腦源神經營養因子(BDNF)、神經營養因子3( NT-3 )、鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)、膠質細胞源神經營養因子(⑶NF )中的一種或幾種。
6.如權利要求5所述殼聚糖人工神經移植物，其特徵在於所述神經營養因子在神經移植物支架材料上的量為1 μ g/g-10mg/g。
7.—種如權利要求1所述殼聚糖人工神經移植物支架的製備方法，步驟包括(1)將弱酸溶解殼聚糖得到濃度為3%-6%的溶液，將溶液倒入模具，置於_60°C-90°C， 冷凍2-4小時；(2)將冷凍後殼聚糖冰體置於鹼性溶液中和固定，用水清洗；(3)對步驟(2)得到的定型的殼聚糖冷凍乾燥，得到具有多孔結構、抗拉強度高的殼聚糖神經移植物支架；(4)將殼聚糖神經移植物支架浸泡在神經營養因子溶液中，利用材料表面豐富的孔隙吸附固定神經營養因子。
8.如權利要求7所述殼聚糖人工神經移植物支架的製備方法，其特徵在於將吸附固定有神經營養因子的殼聚糖人工神經移植物進一步進行凍幹。
9.如權利要求7所述殼聚糖人工神經移植物的製備方法，其特徵在於所述弱酸是醋酸、磷酸、檸檬酸、乳酸中的一種或幾種。
全文摘要
本發明公開了一種含神經營養因子的殼聚糖人工神經移植物及製備方法，殼聚糖人工神經移植物是在不添加任何發泡劑、交聯劑的情況下，通過弱酸溶解、注模、冷凍成型、中和固定、清洗、冷凍乾燥等工藝，將殼聚糖加工成具有多孔結構、抗拉強度高的神經導管。在神經導管中含有治療作用的細胞因子是鹼性成纖維生長因子(bFGF)、腦源神經營養因子(BDNF)、神經營養因子3(NT-3)、鹼性成纖維細胞生長因子(bFGF)、膠質細胞源神經營養因子(GDNF)等中的一種或多種。本發明的產品含神經營養因子，所用材料均為可降解性材料，與人體有著良好的生物相容性。製得的產品不含有由於製備工藝帶入的外源性毒、副作用物質。
文檔編號A61L27/20GK102343112SQ20111030266
公開日2012年2月8日 申請日期2011年10月9日 優先權日2011年10月9日
發明者丁斐, 張添, 楊宇民, 顧曉松 申請人:江蘇益通生物科技有限公司