一種從棕色脂肪分離心臟幹細胞及其成心肌分化的方法

2023-12-01 20:39:46 5

專利名稱：一種從棕色脂肪分離心臟幹細胞及其成心肌分化的方法
技術領域：
本發明屬於幹細胞的分離及其分化成組織細胞的方法，其體涉及一種從棕色脂肪
分離心臟幹細胞及其成心肌分化的方法。
背景技術：
心臟內在的再生機制非常有限，不足以補償病理狀態下的心肌細胞丟失，如心肌梗死。這使得科學家投入大量的研究去鑑定新的心肌細胞來源，以用於損傷心肌的修復與心臟功會g的改善(Wolfram-Hubertus Zimmerma皿等，Engineeredheart tissuegrafts improve systolic and diastolic function in infarcted rat hearts, NATUREMEDICINE, 2006， 12(4) :452-458 ;V. Planat-B6nard等，Sponta固usCardiomyocyteDifferentiation From Adipose Tissue Stroma Cells, Circ. Res. 2004,94 :223-229)。
由於幹細胞具有多能性，能夠分化為其他類型的細胞，包括功能性的心肌細胞，因此受到廣泛的研究。至今，已有多種幹細胞來源被用於心肌再生研究，包括胚胎幹細胞，骨骼肌成肌細胞，骨髓間充質幹細胞等。然而，這些細胞在應用中都具有一定的局限性，如胚胎幹細胞具有形成畸胎瘤的風險，骨骼成肌細胞存在誘發心律失常的隱患，骨髓來源幹細胞
向心肌的轉分化問題還存在爭論(Zongjin Li等，Imaging Survival and Function ofTransplantedCardiac Resident Stem Cells, JACC， 2009， 53 (14) :1229-1240)。這些問題使得尋找新的能夠產生心肌細胞的成體幹細胞源非常迫切。 近來，人們從心肌組織中分離到心臟幹細胞(Antonio P. Beltrami等，AdultCardiac Stem Cells Are Multipotent and Support Myocardial Regeneration,Cell,2003，114，763-776 ;Alessandro Giacomello Latronico等，Isolation andExpansionof Adult Cardiac Stem Cells From Human and Murine Heart, Circ. Res.，2004,95 :911-921)。與其他成體幹細胞不同，心臟幹細胞是用於心肌再生的一種很適合的種子細胞，因為他們很可能按照自身的內在程序在體外產生心肌組織並在體內增加心肌組織的活力。因此，心臟幹細胞在治療心臟疾病方面為人們開闢了新的前景(Barile L等，Cardiac stem cells -isolation, expansion and experimental usefor myocardialregeneration, Nat Clin Pract Cardiovasc Med. ， 2007， S9—S14)。然而，目前對這禾中來源的細胞存在細胞收集上的技術困難，而且收集的細胞數量很小，這使得心肌部位的內源性的心臟幹細胞並不適合用於移植(YoshihiroYamada等，Cardiac progenitor cells inbrown adipose tissue repaired d咖agedmyocardium， Biochemical and BiophysicalResearch Communications, 2006， (342) :662-670 ;Anke M Smits等，Human cardiomyocyteprogenitor cells differentiate intofunctional mature cardiomyocytes :an invitro model for studying human cardiacphysiology and pathophysiology, NATUREPROTOCOLS, 2009， 4 (2) :232-243)。因此，尋找一種在細胞治療中可能利用的心臟幹細胞來源就顯得十分必要。 脂肪組織來至胚胎中胚層，包含一種異質的、易於分離的基質細胞群。這一組織在臨床應用中豐富易的，一旦被成功開發利用，將可能在再生醫學領域產生深遠影響。因此，脂肪組織來源的細胞也被作為心肌再生的候選細胞被大量研究。Planat-Benard等 (V. Planat-B6nard等，Spontaneous CardiomyocyteDifferentiation From AdiposeTissue Stroma Cells, Circ. Res. 2004， 94 :223-229)首次報導了小鼠來源的脂肪細胞能夠自發分化為心肌細胞，儘管分化效率很低(0. 02-0. 07% )，但是卻表明了脂肪組織可能是心臟幹/祖細胞的一種新來源。隨後，Yamada等(Yoshihiro Yamada等，Cardiacprogenitor cells in brown adiposetissue repaired damaged myocardium,Biochemicaland Biophysical ResearchCommunications， 2006， (342) :662-670)進一步發現棕色脂肪組織來源的細胞成心肌分化潛能遠高於這一水平(超過20% )，這明確表明了棕色脂肪組織是心臟幹細胞的豐富來源。 棕色脂肪組織中心臟幹細胞的發現為研究心肌的體外分化提供了新的模型，並為心肌再生提供了新的心肌細胞來源。然而，現有的從棕色脂肪分離心臟幹細胞的方法是米用Dispase II消化(Yoshihiro Yamada等，Cardiac progenitorcells in brownadipose tissue repaired damaged myocardium,Biochemical andBiophysical ResearchCommunications,2006， (342) :662-670 ;Y0SHIHIR0YAMADA等，"Cardiac Stem Cells inBrown Adipose Tissue Express CD133 andlnduce Bone Marrow NonhematopoieticCells to Differentiate into Cardiomyocytes"， STEMCELLS，2007，25(5) :1326-1333 ;Pilgaard L等，"Comparative analysis ofhighlydefined proteases for the isolationof adipose tissue-derived stem cells", Regen Med. ， 2008， 3 (5) :705-15)，效率較低，而經典的採用I型膠原酶從脂肪組織分離細胞的方法存在同樣問題(V. Planat-B6nard等，SpontaneousCardiomyocyte Differentiation From Adipose Tissue Stroma Cells,Circ. Res. 2004,94 :223-229)，使得這一新的心臟幹細胞源在基礎與應用中的研究同樣陷入困境。 研究已證明，對於脂肪組織的有效消化，多種酶的共同作用是必要的。但是難題在於找到一種合適的消化酶組合以及適當的消化條件，且能夠獲得期望的細胞類型與活細胞產量(Pilgaard L等，"Comparative analysis of highlydef inedproteases for theisolation of adipose tissue-derived stem cells，，， Regen Med. ， 2008， 3 (5) :705-15)。然而這種理想的分離方法至今尚沒有報導。

發明內容
本發明的目的在於提供一種從棕色脂肪分離心臟幹細胞及其成心肌分化的方法。採用該方法能夠獲得期望的心臟幹細胞數量並用於成心肌細胞分化，分化的心肌細胞具有功能性心肌的節律性搏動、表達心肌細胞特異性標誌並能對心肌藥物作出反應。
—種從棕色脂肪分離心臟幹細胞及其成心肌分化的方法，具體方法如下[OOO9] (1)消化液的製備 將膠原酶、dispasell與胰酶以質量比1 : 1 : 0.5-1的比例溶於無血清的培養基中，其中，膠原酶、dispasell和胰酶在無血清的培養基中的濃度均為0. 5-2mg/mL，完全溶解後，調解pH至7. 2-7. 4，獲得消化液；
(2)來源於棕色脂肪的原代心臟幹細胞的分離
將清洗並剪碎的棕色脂肪組織加入到含有上述消化液的消化瓶中，每10毫升消化液加入0. 5-1. 0克棕色脂肪組織，加蓋後放在磁力攪拌器上進行攪動，轉速為80-120rpm，在37°C ， 5% C02的孵箱中消化45_60min (消化時間根據消化酶濃度不同適當調節)，然後以血清終止消化反應，其中，血清與消化液的體積比為l-2 : IO，將消化液過濾後離心收集細胞，獲得原代心臟幹細胞；其中，所述消化瓶中裝有玻璃珠和磁力攪拌轉子；
(3)原代心臟幹細胞的培養與成心肌細胞分化 使用含血清的a-MEM培養基重懸上述原代心臟幹細胞，其中，血清的體積百分比濃度為10%，然後以5X 103-5X 104/cm2的密度將上述原代心臟幹細胞接種於組織培養基中進行培養分化，隔天換培養基，培養2-4周，心臟幹細胞可分化為節律搏動的心肌細胞。
步驟(1)中所述無血清的培養基為a -MEM或DMEM培養基。 步驟(3)中所述組織培養基為含體積百分比濃度為10%血清的a -MEM培養基。其中，a -MEM培養基的配製為a -MEM培養基幹粉一包，NaHC032. 4g， HEPEs 2. 383g，溶解於1L超純水，PH7. 2-7. 4。 所述棕色脂肪組織的優選來源為從出生1-2周的幼年大鼠或出生1-7天的幼年小鼠的肩胛骨部位脂肪組織分離獲得。 所述棕色脂肪組織使用無血清a -MEM培養基或PBS清洗。
所述血清為胎牛血清(FBS)。 所述消化瓶為有蓋玻璃小瓶也可為其他類似容器，每瓶中加入的玻璃珠的數量優選為5-7粒。 本發明的有益效果本發明採用組合的消化酶液進行細胞分離，與現有的分離方法相比，該分離方法顯著地提高了細胞的產率，同時心臟幹細胞的含量也明顯提高，可通過CD133陽性細胞比率與成心肌分化能力得到驗證，因此心臟幹細胞的產率也顯著提高。本方法獲得的心臟幹細胞產率高、操作簡單、可實施性強，減少了人為操作。


圖1為不同分離方法的細胞產率比較結果柱型圖； 其中，I為從棕色脂肪組織分離細胞常用的I型膠原酶消化法；D指已報導的分離棕色脂肪來源心臟幹細胞的Dispase II消化法；IV/D/T指本發明建立的採用IV型膠原酶、Dispase II與胰酶的聯合消化液分離棕色脂肪心臟幹細胞的方法 圖2為棕色脂肪來源心臟幹細胞在向心肌分化過程中的形態學變化顯微圖譜； 其中，圖(a) ， (b) ， (c)為分化1周時顯微鏡下細胞形態；圖(d) ， (e) ， (f)為分化
2周時顯微鏡下細胞形態；圖(g)， (h)， (i)為分化4周時顯微鏡下細胞形態；圖(a)， (d)，
(g):放大100倍；圖(b) ， (C) ， (h):放大200倍；圖(C) ， (f) ， (i):放大400倍。 圖3為免疫螢光染色顯示的棕色脂肪心臟幹細胞分化的心肌細胞表達心肌特異
性標誌圖譜； 其中，圖(a)為a-sarcomeric actinin的表達(綠色，藍色為細胞核，400 X);圖(b)為a圖的周部放大，肌節清晰可見；圖(c):心肌標誌cTnT的表達(綠色，藍色為細胞核，400X);圖(d)為c圖的局部放大，肌節清晰可見。 圖4為棕色脂肪心臟幹細胞分化的心肌細胞能夠對心肌藥物異丙腎上腺素、地爾硫卓做出反應表現出的搏動頻率變化柱型圖。注圖中基值為不加任何藥物時心肌細胞的 平均搏動頻率，作為標準，化作100 % ，其他組為在相應藥物濃度下，搏動頻率相對標準值的 百分率，圖中"異"指異丙腎上腺素，"地"指地爾硫卓；
具體實施例方式
通過以下實施例對本發明做詳細描述，但是以下實施例僅僅是作為例證，並不對 本發明構成任何限制。
以下實施例中使用的細胞分離、培養、分化與鑑定所需試劑的配製 1) a -MEM細胞培養基a -MEM乾粉培養基一袋，2. 4g NaHC03， 2. 383g HEPES， 10萬
單位青黴素，10萬單位鏈黴素，溶解於1000ml超純水中，調節pH值為7. 2-7. 4，經0. 22 y m
微孔濾膜過濾除菌，4t:保存。用於分離後原代心臟幹細胞的培養時需向a-MEM細胞培養 基中添加10wt^胎牛血清(FBS)。 2)消化液的配製將IV型膠原酶、Dispase II各0. 1克、胰酶0. 05克，溶解於 100mL無血清的a -MEM細胞培養基，調節pH值為7. 2_7. 4，經0. 22 y m微孔濾膜過濾除菌。 使用前現配製，用於組織消化。 3)消化瓶100ml有蓋柱形玻璃瓶，內置5_7粒玻璃珠， 一個的磁力攪拌器用轉子 (直徑X長6 X 20mm)，常規高壓蒸汽滅菌備用。4)PBS :稱取8g NaCl，O. 2g KC1，3. 491g Na2HP04 12H20，0. 2g KH2P04，溶解於 1000ml超純水中，調節pH值為7. 2-7. 4， 12rC高壓蒸汽滅菌20min，4t:保存。
5)4%多聚甲醛固定液加熱O. 1M的PB溶液500mL至沸騰，加入20g多聚甲醛，攪 拌溶解，調節pH值為7. 2-7. 4，過濾除雜質，fC保存。6)心肌細胞鑑定所需抗體a-sarcomeric actinin， cardiac troponin T以及相 應的螢光標記的二抗購自Sigma公司，按照廠家說明書進行使用，用於心肌細胞的鑑定。
7)心肌藥物異丙腎上腺素溶於無血清a -MEM培養基，製備成5 X 10—4mol/L的溶 液；地爾硫卓溶於無血清a -MEM培養基配製成1 X 10—3mol/L溶液，使用前配製。
實施例1以大鼠棕色脂肪組織為組織樣品分離心臟幹細胞的方法
(1)大鼠棕色脂肪組織的取材與處理 出生後l-2周的幼年SD大鼠，頸椎脫臼處死。去除肩胛骨附近毛髮，於75%酒精 中浸泡約l分鐘消毒。無菌超淨臺中取出肩胛骨處脂肪組織置於培養皿中，使用大量PBS 衝洗去除血汙。然後將脂肪組織充分剪碎，以備消化。
(2)消化脂肪組織和分離心臟幹細胞 將上述剪碎的脂肪組織樣品1. 0g轉移到消化瓶中，加入約10ml消化液，蓋上瓶蓋 後置於磁力攪拌器上以100rpm的轉速不斷攪動，磁力攪拌器和消化瓶一同置於37t:孵箱 中，連續消化45分鐘至1小時後，加入lmL胎牛血清終止消化反應，200目的篩網過濾後，將 消化液轉移到離心管中，600g離心5分鐘，收集細胞。每克脂肪組織樣品中可分離得到細胞 達107，消化不同時間分離得到的細胞產量見圖1。 對照實驗I為從棕色脂肪組織分離細胞常用的I型膠原酶消化法(參見 V.Planat-B6nard等，Spontaneous Cardiomyocyte Differentiation From Adipose TissueStroma Cells, Circ. Res. 2004，94 :223-229) ;D指已報導的分離棕色脂肪來源幹細胞的Dispase II消化法(參見Yoshihiro Yamada等，Cardiac progenitor cells inbrown
adipose tissue repaired damaged myocardium,Biochemical and BiophysicalResearch
Communications,2006， (342) :662-670 ;Y0SHIHIR0 YAMADA等，"Cardiac Stem Cells
in Brown Adipose Tissue Express CD133 and Induce BoneMarrow Nonhematopoietic
Cells to Differentiate into Cardiomyocytes"， STEMCELLS，2007，25(5) : 1326-1333 ;
Pilgaard L等，"Comparative analysis ofhighlydefined proteases for the isolation
of adipose tissue-derived stem cells，，， Regen Med. ， 2008， 3 (5) :705-15)。 分離的細胞富含心臟幹細胞，這由CD133陽性細胞的高含量(見表1)與高效的成
心肌分化得以證明，心肌分化效率見表2。 表1棕色脂肪來源原代細胞表面標誌表達
表面標誌 陽性表達率(％)
—SD巧— 31:函:5.83 ——
CD90 57.90:11.89
CD133 60.56H.44
CD45 1.05±0.79
CD34 0.52±0.18 流式細胞術分析分離獲得的棕色脂肪來源原代細胞的表面標誌表達，CD133陽性 細胞可達60. 56%，這一細胞群被報導具有較高的成心肌分化潛能。由表1可見，CD133陽 性細胞的比率達60. 56%，明顯高於以前的報導(僅3.5%)，這說明使用本方法分離獲得的 細胞含有較多的心臟幹細胞。 表2以不同細胞濃度接種本發明方法獲得的細胞分化出的cTnT陽性細胞比率結 果
接種密度 5*104/cm2 2.5*104/cm2l*104/cm2 5*103/cm22.5*103/cm2 l*103/cm2
cTnT+細胞(％) 24 .78±2.4 29.9 3±3.2#25.41±2.2321.43±1.62 16.7±1.41 5.3±0.6 細胞的接種密度是影響棕色脂肪心臟幹細胞分化為心肌細胞(cTnT+細胞)的重 要因素，本方法分離的細胞在適當的接種密度下心肌分化率可達30%，表明了較高的心臟 幹細胞含量。 實施例2以小鼠棕色脂肪組織為組織樣品分離心臟幹細胞的方法 棕色脂肪組織的取材選用出生後l-7天的幼年昆明白小鼠，分離心臟幹細胞的方
法同實施例l，獲得的細胞中CD133陽性細胞的比率約達60%，心肌分化率可達30%左右。 實施例3分離細胞的培養、成心肌分化與心肌細胞的鑑定實驗 (1)分離細胞的培養與成心肌分化 用含10%胎牛血清的a -MEM細胞培養基重懸實施例1或2收集的細胞，製備成細 胞懸液，以5X 103/cm2至5X 10Vcm2的細胞密度接種於組織培養皿(培養液為含10%胎牛 血清的a -MEM培養基)，直徑 的組織培養皿中含有10_15ml培養液，然後置於37°C，5% (A孵箱培養分化，隔天更換培養液，培養2-4周，觀察細胞的分化，見圖2。以這種密度 接種，心肌細胞的分化率可高達30%左右，見實施例1中的表2。 [oose] (2)分化心肌的鑑定實驗 免疫組織化學細胞在培養板中分化4周後，PBS洗滌細胞，4X多聚甲醛固定。 0.1% Triton X-100透化處理30分鐘，然後分別使用cTnT抗體(使用時稀釋比例為 1 : 200， Sigma)禾P a-sarcomeric actinin(使用時稀釋比例為1 : 200 ;Sigma)作為一 抗，陰性對照組使用PBS代替一抗，置於4°C ，過夜孵育。PBS漂洗3minX 3次，加入二抗，即 FITC標記的山羊抗小鼠IgG， 37°C孵育20min， PBS漂洗3minX 3次；Hoechst33258染核後中 性樹膠封片，螢光顯微鏡下觀察分化的細胞表達心肌標誌cTnT， a-sarcomeric actinin， 並在高倍鏡下清晰可見肌節纖維，見圖3。 對心肌藥物的反應能力倒置相差顯微鏡下記錄上述生長在培養基中的搏動細胞 的波動頻率，計數10個細胞。然後以計量依賴性的方式加入5X 10—4mol/L的心肌藥物異丙 腎上腺素，使培養基中異丙腎上腺素的濃度依次為0. 25uM，0. 5uM， luM， 2. 5uM，5uM，分別紀 錄每一濃度下的細胞搏動頻率；隨後加入1X10—3mol/L地爾硫卓溶液，使培養基中的濃度 依次為5uM，10uM，紀錄每一濃度下的細胞搏動頻率。記錄的數據顯示分化的心肌細胞具有 功能性心肌細胞的節律性搏動，並且能對心肌藥物作出反應，表現出搏動頻率的加快或減 慢，見圖4。
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權利要求
一種從棕色脂肪分離心臟幹細胞及其成心肌分化的方法，其特徵在於，按照如下操作步驟進行(1)消化液的製備將膠原酶、dispaseII與胰酶以質量比1∶1∶0.5-1的比例溶於無血清的培養基中，其中，膠原酶、dispaseII和胰酶在無血清的培養其中的濃度均為0.5-2mg/mL，完全溶解後，調解pH至7.2-7.4，獲得消化液；(2)來源於棕色脂肪的原代心臟幹細胞的分離將清洗並剪碎的棕色脂肪組織加入到含有上述消化液的消化瓶中，每10毫升消化液加入0.5-1.0克棕色脂肪組織，加蓋後放在磁力攪拌器上進行攪動，轉速為80-120rpm，在37℃，5％CO2的孵箱中消化45-60min，然後以血清終止消化反應，其中，血清與消化液的體積比為1-2∶10，將消化液過濾後離心收集細胞，即獲得原代心臟幹細胞；其中，所述消化瓶中裝有玻璃珠和磁力攪拌轉子；(3)原代心臟幹細胞的培養與成心肌細胞分化使用含血清的α-MEM培養基重懸上述原代心臟幹細胞，其中，血清的體積百分比濃度為10％，然後以5×103-5×104/cm2的密度將原代心臟幹細胞接種於組織培養基中進行培養分化，隔天換組織培養基，培養2-4周，心臟幹細胞可分化為節律搏動的心肌細胞。
2. 根據權利要求1所述的從棕色脂肪分離心臟幹細胞及其成心肌分化的方法，其特徵 在於，步驟(1)中所述無血清的培養基為a-MEM或DMEM培養基。
3. 根據權利要求1所述的從棕色脂肪分離心臟幹細胞及其成心肌分化的方法，其特徵 在於，步驟(3)中所述組織培養基為含體積百分比濃度為10%血清的a-MEM培養基。
全文摘要
本發明公開了一種屬於從棕色脂肪分離心臟幹細胞及其成心肌分化的方法。該方法包括(1)消化液的製備將膠原酶、dispaseII 與胰酶以質量比1∶1∶0.5-1的比例溶於無血清的培養基中；(2)使用加有玻璃珠和轉子的消化瓶消化棕色脂肪組織，然後離心收集細胞；(3)原代心臟幹細胞的培養與成心肌細胞分化。本發明採用組合的消化酶液及其特殊的消化方法進行細胞分離，與現有的分離方法相比，該分離方法顯著的提高了細胞的產率，同時心臟幹細胞的含量也明顯提高，可通過CD133的表達率與成心肌的能力得以驗證，因此心臟幹細胞的產率也顯著提高。本方法獲得的心臟幹細胞產率高、操作簡單、可實施性強，減少了人為操作。
文檔編號C12N5/077GK101705209SQ200910241630
公開日2010年5月12日 申請日期2009年11月27日 優先權日2009年11月27日
發明者劉志強, 周瑾, 段翠密, 王常勇, 王海濱 申請人:中國人民解放軍軍事醫學科學院基礎醫學研究所