一種哺乳動物細胞的灌流培養方法
2023-12-09 04:26:41 1
專利名稱：一種哺乳動物細胞的灌流培養方法
技術領域：
本發明涉及一種哺乳動物細胞的灌流培養方法。
背景技術：
動物細胞培養開始於本世紀初期，1962年其規模開始擴大，發展至今已成為生物及醫學研究和應用領域廣泛採用的技術方法。利用動物細胞培養生產具有重要醫用價值的酶、生長因子、疫苗和單抗等生物製品已佔世界生物高技術產品市場份額的50%，成為生物醫藥高技術產業的重要組成部分。動物細胞大規模培養技術是生物技術製藥中非常重要的環節，根據細胞的生長特性可分為貼壁細胞和懸浮細胞；就其培養方法而言可概括為懸浮培養和固定化培養；就操作方式而言，可分為分批式、補料-分批或流加式、半連續式、連續式或灌流式四種操作方式。流加培養和灌流培養是細胞培養模式中最常用的兩種操作方式目前用哺乳動物細胞大規模培養生產蛋白的工業化過程，可以看作是以攪拌式生物反應器懸浮培養作為通用技術平臺，使用常用的3種細胞(CH0、SP2/0、NS0)依託該平臺工藝並使其生產能力提高。平臺工藝的特點是採用無血清培養和成熟的流加和灌流工藝。連續灌流培養是近年用於動物細胞培養生產分泌型重組治療性藥物和嵌合抗體及人源化抗體等基因工程抗體較為推崇的一種方式。應用連續灌流工藝的公司有Genzyme，Genetic Institute，Bayer公司等。國內第四軍醫大學、華東理工大學、中國科學院上海細胞生物學研究所等單位從事了這方面的研究。就攪拌式生物反應器懸浮培養動物細胞的工藝而言，目前國際上流加或灌注培養生物工程細胞(如中國倉鼠卵巢細胞CH0、雜交瘤細胞hybridoma)的活細胞密度已經可以達到IO7水平。國內的第四軍醫大學馮強等人2002年報導採用5L CelliGen反應器連續灌注培養雜交瘤細胞，研究雜交瘤細胞在無血清培養基中的生長、代謝情況和氧消耗的關係，培養第9天細胞密度達到8X IO6ceIlsAiL以上。灌流式培養的優點包括細胞截流系統可使細胞或酶保留在反應器內，維持較高的細胞密度，一般可達107-109cellS/mL，從而較大的提高了產品的產量；2連續灌流系統，使細胞穩定的處在較好的的營養環境中，有害代謝廢物濃度積累較低；3反應速率容易控制，培養周期較長，可提高生產率，目標產品回收率高；4產品在罐內停留時間短，可及時回收到低溫下保存，有利於保持產品的活性。這種方法最大困難是汙染機率較高，長期培養中細胞分泌產品的穩定性問題，規模放大過程中工程問題。目前動物細胞大規模灌流培養技術水平的提高主要集中在培養規模的進一步擴大、細胞培養環境的優化、細胞特性的改變、產率和產品質量的提高等方面。其中最根本的是優化細胞的培養條件，儘可能消除或減輕環境對細胞的影響，維持細胞高存活力和高效表達，同時也要充分考慮細胞表達產物的後續純化。理論上講，哺乳動物細胞表達系統產生的目的蛋白一般為糖蛋白，此類重組融合蛋白由於結構複雜，其在細胞內組裝，轉運及分泌至胞外的過程中，有可能會因為培養環境的影響產生二硫鍵的錯配而形成錯誤摺疊的蛋白，或者形成兩種異構體，繼而影響蛋白結構域的活性。因此，通過對發酵條件的控制可以減少蛋白錯誤摺疊或者降低無活性異構體的表達量。很多的文獻或者專利介紹了動物細胞培養條件的優化，包括pH、溶氧、溫度和攪拌
轉速等。陳志南在CN1557948A中將溫度36-37、pH6. 5-7. 4、攪拌速度控制為40_80rpm，並
在此基礎上調整了營養物質的流速，在使用雜交瘤細胞培養生產單克隆抗體中取得了較好的效果。B. M.施林在CN101044239A《用於蛋白質生產的哺乳動物細胞培養方法》中在培養期間採用了兩次溫度轉換，其中在培養期結束時溫度低於最初細胞培養時溫度。這種調整維持了高細胞生存力，可以產生蛋白質產物的更大的終末滴定度，和高質量蛋白質產物。Helmut在US7，157，557B2中的研究表明培養液的pH的改變可以導致目的蛋白中組分的含量發生變化，溫度的改變可以降低蛋白的錯誤摺疊率。TEIJIN LTD在日本專利申請JP5146^0公開了在細胞濃度和葡萄糖濃度下灌注培養哺乳動物細胞的技術方案，灌注培養哺乳動物細胞人B細胞雜交瘤，穩定期保持培養基(ITES-Erdf，包含轉鐵蛋白、胰島素、乙醇胺、亞硒酸鈉)中葡萄糖濃度在3. 5-30mmol/l,細胞密度超過8X 106cells/mL。陳志南在專利文獻ZL01131736中公開了連續灌注式培養雜交瘤細胞製備抗體的工藝方法，接種細胞採用固定床填充巨載體，細胞代謝、生長速率、產物合成平衡調控是對葡萄糖、乳糖以及PH等指標進行分析，在細胞由對數生長期進入衰退期之前，添加相應的胺基酸，並降低葡萄糖和血清濃度，細胞由以生長代謝為主轉為以產物合成為主，實現多個穩態培養，雜交瘤細胞在低/無血清培養基連續培養20-40天，最大細胞密度可達(3-9) X 107cells/mL，抗體產量 200_800mL/L/d。
發明內容
目前，哺乳動物細胞大規模培養生產目的蛋白的方法普遍存在表達量低、發酵周期短、細胞密度和活力不足的缺陷，一些灌流培養方面新技術則存在操作過程複雜、不利於擴大培養規模等問題。因此，本發明提供了一種哺乳動物細胞大規模培養生產目的蛋白的新方法，具體步驟為(1)目標細胞株在初始無血清培養基中進行逐級放大培養，每7 傳代轉瓶培養，經過30mL、90mL、300mL、900mL、1500mL轉瓶的細胞擴增後，當細胞總數達到IX IO8個時，轉移到5. OL發酵罐中。轉瓶培養時轉速75轉/分鐘。(2)在發酵罐中進行高密度培養階段，在高密度培養階段培養初期至細胞對數生長期的溫度為36-37°C、pH為7. 1-7. 2、攪拌轉速為150rpm ；當細胞密度達到8X IO6ceIls/mL時，調整溫度為31-33°C、調整pH為6. 9-7. 0、調整攪拌轉速為80-100rpm ；在發酵培養全過程控制葡萄糖濃度0. 5-3g/L、溶氧50%。所述步驟發酵過程前期溫度控制在36_37°C ；在細胞密度達到8X IO6ceIlsAiL時降低溫度到31-33°C，優選地降低溫度為33°C，可以使細胞代謝減慢，產物大量合成，同時可長時間維持高的細胞密度和活力，減少目的產物中錯配二硫鍵的形成，增加目的產物的
表達量。pH7. 1-7.2為工程細胞株最適生長酸鹼度，故在發酵培養初期將pH控制在7. 1-7. 2 ；當細胞密度達到8X 106cells/mL時細胞增長趨勢減緩，達到對數生長末期，此時期為細胞目的蛋白表達平穩期，這時降低PH，更有利於蛋白的表達。故在細胞密度達到8X106cells/mLjfpHfi 7. 1-7.2 降為 6. 9-7.0，優選地降低 pH 為 6. 9。由於動物細胞無細胞壁，對剪切力敏感，故過高轉速容易對細胞產生剪切力，過低的轉速又會造成培養液混合不均勻，因此合適的轉速對於細胞培養尤為重要。發酵過程前期轉速控制在150rpm ；在細胞密度達到8X 106cells/mL時將攪拌轉速降低為80-100rpm，優選地降低攪拌轉速為82rpm，利於目的蛋白的表達，同時還可以增加細胞活力，延長細胞培養的時間。葡萄糖是細胞的供能物質和主要的碳源物質，然而當其濃度較高會產生大量的代謝產物乳酸，因而需要進行其濃度控制，以足夠維持細胞生長而不至於產生大量的副產物的濃度為佳，因此在發酵培養全過程控制葡萄糖濃度0. 5-3g/L。本發明通過這些培養條件的綜合調控取得了很好的培養效果與常規方式相比，改變發酵控制條件後細胞周期延長了 8天，由14天延長為22天；改變發酵控制條件後細胞密度在22天時為6. 12 X 106cells/mL,細胞活力在22天時為68%，原有的發酵條件在14天時細胞密度僅為6. 02X 106cells/mL，細胞活力在14天時已降為61% ；改變發酵控制條件後目的蛋白表達量提高了 M0mg/L，由210mg/L提高到了 450mg/L ；而且本發明還具有更好的可操作性和實用性。因此，本發明更有利於擴大培養規模。
圖1兩種發酵條件控制下的細胞密度比較，縱坐標表示細胞密度，橫坐標表示培養天數。發酵控制1改變發酵控制條件後發酵周期為22天，在22天時細胞密度為6. 12X106cells/mL ；發酵控制2原有的發酵條件發酵周期為14天，在14天時細胞密度為僅 6. 02X 106cells/mL。圖2兩種發酵條件控制下的細胞活力比較，縱坐標表示細胞活力，橫坐標表示培養天數。發酵控制1細胞改變發酵控制條件後發酵周期為22天，在22天時細胞活力為68 %，發酵控制2原有的發酵條件發酵周期為14天，在14天時細胞活力已降為61 %。
具體實施例以下通過具體實施方式
進一步描述本發明，但本發明不限於以下實施例。實施例1細胞的逐級擴增種子細胞的復甦與擴增以及高密度發酵階段均選用無血清培養基。從細胞庫液氮中取一支凍存的種子細胞，其為高表達TNFR=Fc融合蛋白的重組CHO細胞，迅速投入到37°C溫水中復甦，加入37°C預熱的培養液輕輕吹打，SOOrpm離心5min,棄上清，在沉澱中加入37°C預熱的培養基40mL，置5% CO2恆溫培養箱培養。72hr後傳代，SOOrpm離心5min，棄上清，沉澱中加入新鮮37°C預熱的培養基，使細胞密度達到2. 0X105cells/mL 以上。
在細胞傳代擴增過程中，逐級放大培養容器，經過30mL、90mL、300mL、900mL、1500mL轉瓶的細胞擴增，當細胞總數達到IX IO8個時，轉移到5. OL發酵罐中進行培養擴增。實施例25L罐內發酵培養發酵生產的高密度培養階段仍然使用無血清培養基，維持發酵各階段參數的穩定。在整個過程中採用開放式灌注培養發酵，監控細胞密度和葡萄糖耗，根據葡萄糖的消耗，通過連續補加一定濃度的葡萄糖來控制葡萄糖濃度為0. 5-3g/L ；溶氧控制為空氣中氧溶解量的50%。在5L發酵罐培養初期，工程細胞株的培養溫度維持在36-37 °C ；pH控制為PH7. 1-7. 2，通過發酵過程中添加(X)2和NaHCO3來維持其穩定；攪拌轉速控制在150rpm ；當細胞密度達到8 X IO6ceIlsAiL時，細胞增長趨勢減緩，達到平臺期，這時降低溫度、PH和轉速。溫度由36-37°C降低到31-33°C，優選地降低溫度為33°C ；pH由7. 1-7. 2降為6. 9-7. 0，優選地降低pH為6. 9 ；攪拌轉速由150rpm降為80_100rpm，優選地降低攪拌轉速為82rpm。在5L發酵罐培養全過程中，每天取樣測定細胞密度、活力和葡萄糖的濃度，根據測的葡萄糖的濃度來調節葡萄糖的添加速率，使葡萄糖濃度為0. 5-3g/L，同時根據細胞密度的情況調節灌注和收液速率，使細胞長時間維持較高的活力。細胞活力降為70%以下時，停止灌注和收液，結束髮酵。實施例3兩種發酵過程控制的對比試驗一、發酵控制1發酵過程控制為發酵前期pH7. 1-7. 2，攪拌轉速150rpm，溶氧50%，溫度36_37°C，在細胞密度達到8 X 106cells/mL時，即達到穩定期時開始降低pH到6. 9，降低溫度到33°C，降低攪拌轉速為82rpm，溶氧為50%，控制葡萄糖的濃度為0. 5_3g/L。二、發酵控制2整個發酵過程中控制pH7. 1-7. 2攪拌轉速150rpm，溶氧50%，溫度36_37°C，控制葡萄糖的濃度為0. 5-3g/L。試驗結果見表1、圖1和圖2。結果表明，本發明通過這些培養條件的綜合調控取得了很好的培養效果與常規方式相比，改變發酵控制條件後細胞周期延長了 8天，由14天延長為22天；改變發酵控制條件後細胞密度在22天時為6. 12X106cells/mL,細胞活力在22天時為68%，原有的發酵條件在14天時細胞密度僅為6. 02X 106cells/mL,細胞活力在14天時已降為61% ；改變發酵控制條件後目的蛋白表達量提高了 M0mg/L，由210mg/L提高到了 450mg/L，而且本發明具有更好的可操作性和實用性。因此，本發明更有利於擴大培養規模。表1兩種發酵條件控制下的發酵周期與表達量比較
權利要求
1.一種哺乳動物細胞培養的灌流操作方法，包括如下步驟(1)將目標細胞株在初始培養基中進行逐級放大培養階段，和(2)在發酵罐中進行細胞培養階段，其特徵在於細胞培養階段培養初期至細胞對數生長期的溫度為36-37°C、pH為7. 1-7. 2、攪拌轉速為150rpm ；當細胞密度達到8X IO6ceIls/mL時，調整溫度為31-33°C、調整pH為6. 9-7. 0、調整攪拌轉速為80_100rpm。
2.如權利要求1所述的灌流操作方法，其特徵在於當細胞密度達到8X106cellS/mL時，所述的溫度調整為33°C，所述的pH調整為6. 9，所述的攪拌轉速調整為82rpm。
3.如權利要求1所述的灌流操作方法，其特徵在於所述的目標細胞株選自CHO細胞、NSO細胞、VERO細胞或BHK細胞等常用哺乳動物宿主細胞。
4.如權利要求1所述的灌流操作方法，其特徵在於所述的初始培養基為無血清培養基。
5.如權利要求1所述的灌流操作方法，其特徵在於所述的逐級放大培養階段中每7 傳代轉瓶培養，經過30ml、90ml、300ml、900ml、1500ml轉瓶的細胞擴增後，當細胞總數達到1 X IO8個時，轉移到5. OL發酵罐中。
6.如權利要求5所述的灌流操作方法，其特徵在於所述的轉瓶培養時搖床轉速75轉/分鐘。
7.如權利要求1所述的灌流操作方法，其特徵在於細胞培養階段全過程控制葡萄糖濃度 0.5-3g/L。
8.如權利要求1所述的灌流操作方法，其特徵在於細胞培養階段全過程控制溶氧50%。
全文摘要
本發明涉及到一種哺乳動物細胞大規模培養的灌流操作方法，適合生產重組蛋白的哺乳動物細胞培養，更適合生產TNFR-Fc融合蛋白的哺乳動物細胞的培養。該方法具有以下特點(1)工程細胞傳代擴增過程中的逐級放大；(2)工程細胞在5L發酵罐中的培養；(3)大規模培養後期通過降低培養溫度、降低pH值、降低轉速及調節灌注速率提高蛋白表達量。本發明工藝延長了生產周期，提高了細胞密度、提高了細胞活力，極大的提高了目的蛋白的表達量。
文檔編號C12N5/071GK102382794SQ201010268418
公開日2012年3月21日 申請日期2010年9月1日 優先權日2010年9月1日
發明者夏燕, 趙麗麗, 趙志全 申請人:山東新時代藥業有限公司