一種用於微衛星標記多態性檢測的聚丙烯醯胺凝膠溶液及銀染方法
2023-12-09 08:33:51 1
一種用於微衛星標記多態性檢測的聚丙烯醯胺凝膠溶液及銀染方法
【專利摘要】本發明公開了一種用於微衛星標記多態性檢測的聚丙烯醯胺凝膠(PAG)溶液，包括聚丙烯醯胺凝膠母液、5×TBE、10％APS、TEMED，用蒸餾水稀釋至聚丙烯醯胺凝膠母液體積佔總體積的21-22％，其中5×TBE用量與聚丙烯醯胺凝膠母液相同。本發明的聚丙烯醯胺凝膠溶液使用時，PAG在振蕩顯色過程中，破損較少，避免了PAG拼接，減少了實驗誤差，保證了結果的準確性。
【專利說明】—種用於微衛星標記多態性檢測的聚丙烯醯胺凝膠溶液及銀染方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種SSR檢測過程中所用的凝膠試劑及其使用方法，屬於生物【技術領域】。
【背景技術】
[0002]微衛星(SSR),又稱簡單序列重複(Simple Sequence Repeats, SSR),由I?6個核苷酸組成的基本單位重複多次構成的一段DNA，廣泛分布於基因組的不同位置，長度一般在200bp以下。由於重複單位的重複次數在個體間呈高度變異性並且數量豐富，因此微衛星標記的應用非常廣泛。微衛星位點通常通過PCR擴增，擴增產物通過電泳分析並根據大小分離等位基因進行檢測。
[0003]在SSR多態性檢測方法中，PAGE聚丙烯醯胺凝膠電泳(polyacrylamide gelelectrophoresis)是一種廣泛應用的方法,採用銀染方法對聚丙烯醯胺凝膠電泳進行染色。
[0004]銀染方法的基本原理是先用固定液將核酸固定到凝膠上，然後使銀染劑中的銀離子與之牢固結合，再通過還原劑將銀離子還原，從而發生了顯色反應，使得目標產物可見。銀染法對試劑的要求不高，並且固定液和染色液可以重複使用，降低了試驗成本，所用試劑安全穩定，對操作者的健康所造成的危害性甚微，銀染後的凝膠可以長期保存，更有利於對試驗結果的回顧性分析，因此基於PAGE的銀染方法在生物【技術領域】得到了廣泛應用。
[0005]聚丙烯醯胺凝膠(PolyacrylamideGel, PAG)是由丙烯醯胺單體(Acrylamide,簡稱Acr)和交聯劑NI, N1-甲叉雙丙烯酸胺(N, N-methylene bisacrylamide,簡稱Bis)在催化劑的作用下聚合而成的含醯胺基側鏈的脂肪族長鏈，相鄰的兩個鏈通過甲叉橋交鏈起來，鏈縱橫交錯，形成三維網狀結構的凝膠。PAG孔徑的大小主要由Acr和Bis這兩種單體的凝膠濃度決定。凝膠濃度能夠在3%?30%中變化。在微衛星標記開發和檢測過程中，一般選擇Acr/Bis:20-40的濃度。該濃度下，PAG完全透明且有彈性，但在顯色過程中，PAG膠易碎裂，在拍照時需要進行「拼圖」，在數據分析時，碎裂後拼接的PAG會增大結果的誤差；同時，已有的檢測方法用於SSR還存在PAG在顯色後顏色深，條帶不易區分等問題。
【發明內容】
[0006]針對現有技術的缺陷，本發明公開了一種用於微衛星標記多態性檢測的聚丙烯醯胺凝膠溶液以及相應的銀染方法，採用本發明的凝膠進行銀染顯色，PAG在振蕩顯色過程中，破損較少，避免了 PAG拼接，減少了實驗誤差，保證了結果的準確性。
[0007]為實現上述目的，本發明是通過下述技術方案實現的:
[0008]一種用於微衛星標記多態性檢測的聚丙烯醯胺凝膠溶液，包括聚丙烯醯胺凝膠母液、5XTBE、10% APS(過硫酸銨)、TEMED(四甲基乙二胺)，用蒸餾水稀釋至聚丙烯醯胺凝膠母液體積佔總體積的21-22%，其中5XTBE用量與聚丙烯醯胺凝膠母液相同。[0009]在上述中，各成分含量均以體積比計算。
[0010]在本發明中，所述聚丙烯醯胺凝膠母液濃度為20-40 %，優選聚丙烯醯胺凝膠母液濃度為30%。
[0011]上述所用的PAG母液與常見的PAG母液組成相同，將丙烯醯胺與甲叉雙丙烯醯胺按照一定比例(通常是20-30:1)用雙蒸水定容至所需濃度。例如30%聚丙烯醯胺凝膠母液的配製方法為580g丙烯醯胺，20g甲叉雙丙烯醯胺，雙蒸水定容至2L，37°C恆溫過夜保存即可。
[0012]在本發明中，10% APS (質量體積濃度)、TEMED採用現有技術中的常規用量，通常是10% APS用量(體積)佔凝膠溶液總體積的0.85-0.95%, TEMED用量是10% APS(體積)的1/10。
[0013]其中，5XTBE可採用市售的此類緩衝液，組成為本領域技術人員廣泛所知，典型的組成是採用Tris鹼54g，硼酸27.5g，Na2EDTA.2H204.65g，溶於750ml雙蒸水，再加雙蒸水定容至1000ml，目前市售製劑大多採用該組成。
[0014]在上述基礎上，本發明還公開了用於微衛星標記多態性檢測的聚丙烯醯胺凝膠中DNA的銀染方法，在電泳結束後，用PAG染色液浸泡權利要求1所述的聚丙烯醯胺凝膠10-30min，然後用PAG顯色液顯色5_10min，最後用終止液終止2_3min ;其中PAG顯色液中甲醛的含量為0.2%。
[0015]在上述方法中，通過特定用量的甲醛作為還原劑，有效加速與蛋白質結合的Ag+的還原，基於本發明的聚丙烯醯胺凝膠溶液，甲醛用量顯著低於傳統方法，用於PAG顯色時，顏色淺，條帶清晰，檢測準確度更高。
[0016]其中，所用PAG染色液組成為:10%乙醇(體積濃度)、0.5%冰醋酸(體積濃度)、
0.1%?0.2%硝酸銀(質量體積濃度)。
[0017]優選的，硝酸銀用量為0.2%。
[0018]其中，PAG顯色液組成:0.04%碳酸鈉(質量體積濃度)、2%氫氧化鈉(質量體積濃度)、0.2%甲醛(體積濃度)。
[0019]通過本發明的凝膠溶液及其銀染方法，具有優越的檢測靈敏度，有效地控制凝膠的染色背景使其更加清晰，步驟簡單，容易操作，實驗的成功率高。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0020]圖1為寬口裂腹魚K-9SSR引物多態性檢測採用本發明聚丙烯醯胺凝膠電泳及銀染法的檢測結果圖；
[0021]圖2為採用傳統技術中的聚丙烯醯胺凝膠溶液及銀染法對寬口裂腹魚K-9SSR引物多態性的檢測結果圖。
【具體實施方式】
[0022]在下述實施例中，本發明所用的原料:
[0023]30% PAG母液:580g丙烯醯胺，20g甲叉雙丙烯醯胺，雙蒸水定容至2L，37°C恆溫過夜；
[0024]PAG染色液:AgN031g，無水乙醇50ml，冰醋酸2.5ml，加雙蒸水定容至500ml，避光保存；
[0025]PAG顯色液:碳酸鈉0.2g，氫氧化鈉10g，加雙蒸水定容至500ml，4°C下保存，使用前加入與PAG顯色液配套的Iml甲醛,待用；
[0026]5XTBE:Tris54g，硼酸 27.5g, Na2EDTA.2H204.65g，溶於 750ml 雙蒸水，再加雙蒸水定容至1000ml。
[0027]基於上述原料，配製了下述樣品:
[0028]
【權利要求】
1.一種用於微衛星標記多態性檢測的聚丙烯醯胺凝膠溶液，其特徵在於包括聚丙烯醯胺凝膠母液、5XTBE、10% APS、TEMED，用蒸餾水稀釋至聚丙烯醯胺凝膠母液體積佔總體積的21-22%，其中5XTBE用量與聚丙烯醯胺凝膠母液相同。
2.根據權利要求1所述的聚丙烯醯胺凝膠溶液，其特徵在於所述聚丙烯醯胺凝膠母液濃度為20-40%。
3.根據權利要求1所述的聚丙烯醯胺凝膠溶液，其特徵在於所述聚丙烯醯胺凝膠母液濃度為30%。
4.一種用於微衛星標記多態性檢測的聚丙烯醯胺凝膠中DNA的銀染方法，其特徵在於在電泳結束後，用PAG染色液浸泡權利要求1所述的聚丙烯醯胺凝膠10-30min，然後用PAG顯色液顯色5-10min，最後用終止液終止2_3min ;其中PAG顯色液中甲醛的含量為0.2%。
5.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於PAG染色液組成為「。^乙醇^^^冰醋酸、0.1%~0.2%硝酸銀。
6.根據權利要求4所述的方法，其特徵在於PAG顯色液組成為:0.04%碳酸鈉、2%氫氧化鈉、0.2% 甲醒。
【文檔編號】G01N1/30GK104007161SQ201410199761
【公開日】2014年8月27日 申請日期:2014年5月12日 優先權日:2014年5月12日
【發明者】聶竹蘭, 魏傑, 王帥, 馬振華, 程勇, 張大龍, 張玲, 任道泉, 宋勇, 羅偉, 王衛民, 王智超, 陳生熬, 雷曼紅 申請人:塔裡木大學