微小分子RNA-508-5p作為抗腫瘤標誌物的用途

2023-12-08 20:09:16

微小分子RNA-508-5p作為抗腫瘤標誌物的用途
【專利摘要】本發明提供一種miRNA-508-5p對肝癌和胃癌細胞株新陳代謝的調控作用，很可能成為預防與治療腫瘤的標誌物。越來越多的證據表明，microRNA可作為一種癌基因或抑癌基因，參與調控多種癌症的發生和發展過程。本發明通過構建慢病毒侵染腫瘤細胞模型的實驗證明，miRNA-508-5p對腫瘤細胞株HepG2和SGC7901的增殖、遷移和侵襲等具有明顯抑制作用，並且促進其細胞的凋亡，具有調控細胞周期及新陳代謝的作用，因此miR-508-5p很可能成為腫瘤預防與治療的全新靶點；並且通過靶基因刪選軟體及雙螢光素酶報告系統證實miR-508-5p發揮細胞調控作用，是通過特異性靶向抑制癌基因S-期激酶相關蛋白2基因(Skp2)的表達。
【專利說明】微小分子RNA-508-5p作為抗腫瘤標誌物的用途
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種內源性的非編碼小RNAs的新用途，尤其涉及miR-508-5p在預防與治療胃癌和肝癌疾病中作為新的腫瘤標誌物以及抗腫瘤藥物研製中的用途。
【背景技術】
[0002]胃癌是常見的危害人類健康的惡性腫瘤，其病死率居我國惡性腫瘤之首，迄今病因不明，臨床治療效果不佳；原發性肝癌是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，全球發病率逐年增長。因此開展胃癌、肝癌發病機制及臨床治療的研究是減輕其危害的根本途徑。
[0003]MicroRNA (miRNA)是近年來發現的一類內源性非編碼單鏈RNA，其長約為18~25個核苷酸。miRNA通過Watson-Crick鹼基互補匹配原則,對革EmRNA進行降解或抑制翻譯來調節蛋白的表達。據預測，人類約含有1000個miRNA，參與調控超過30%的蛋白編碼基因，在生物體的生長、發育、分化等方面起著重要的作用。miRNA的異常表達，參與腫瘤的各種生物學過程，包括腫瘤細胞增殖、凋亡和遷徙、侵襲等。越來越多的證據表明，miCToRNA可作為一種癌基因或抑癌基因，參與調控多種癌症的發生和發展過程。依此推斷，miRNA可作為一種癌基因或抑癌基因。
[0004]成熟的miRNA通過和其靶基因3』 UTR結合，從而降解其靶mRNA或阻礙其靶mRNA的翻譯。通過miRBase檢索成熟miR-508_5p序列信息，TargetScan、miRanda等進行革巴基因預測，miR-508-5p靶向抑制預測靶基因SKP2的表達。Skp2基因在各種人類惡性癌症中都是過表達的，包括大腸癌、乳腺癌、肝癌、宮頸癌、以及胃癌等，並且預後較差。Skp2的大量表達可促進癌細胞的細胞周期進展，與多種惡性腫瘤的發生和發展密切相關。SKP2過表達與直腸癌放化療治療預後不良直接相關，成為高潛力的治療祀點。
[0005]在眾多的miRNA中，miR-508已經被研究證實在胃癌、肝癌、腎癌和卵巢漿液性癌中表達異常下調，並很可能參與腫瘤的進程，成為潛在的抑癌基因，而目前miR-508-5p在胃癌、肝癌等腫瘤細胞中的調控作用機制及對其增殖與凋亡進程影響的研究仍不清楚，因此，開發以miR-508-5p為策略的胃癌和肝癌疾病的預防、診斷和治療的基礎研究和抗腫瘤藥物研究具有重要的意義和應用前景。

【發明內容】

[0006]本發明的目的在於提供一種微小分子RNA-508-5p (miR-508_5p)在預防與治療胃癌和肝癌疾病及抗腫瘤藥物中的作用，所述miR-508-5p的核苷酸序列如下所示:5， -UACUCCAGAGGGCGUCACUCAUG-3，。
[0007]本發明的研究基礎:
[0008]1.免疫組化法顯示Skp2蛋白在中低分化胃腺癌中明顯高表達，而在正常胃黏膜中Skp2蛋白幾乎不表達，並且其表達水平與胃癌臨床病理特徵呈正相關，與腫瘤大小，淋巴結轉移，浸潤深度，分化程度等臨床病理特徵密切相關。相反，通過qRT-PCR檢測發現miR-508-5p在中低分化胃腺癌組織中表達水平相較於在正常胃黏膜中表達水平明顯下調，並且隨著病理分級越嚴重，表達量成逐級下調的正相關趨勢，qRT-PCR檢測結果和晶片數據
結果一致。
[0009]2.本發明通過TargetScarumiRanda等預測軟體對miR-508_5p進行祀基因預測，通過雙螢光素酶驗證了其對Skp2具有特異性靶向抑制作用。
[0010]3.本發明成功包裝了含有miR-508-5p小顆粒的慢病毒上清，病毒滴度達到lxl07TU/mlo將計算好的濃縮病毒上清液侵染腫瘤細胞，構建細胞模型，通過westernblot和相對定量qRT-PCR檢測方法，同時證實了 miR-508_5p過表達能夠特異性明顯抑制Skp2mRNA (P < 0.05)和蛋白表達水平。
[0011]4.本發明通過MTT、Hoechst染色和流式細胞術同時證明，miR-508_5p通過靶標Skp2的表達，下調其在腫瘤細胞高表達的水平，調控細胞周期，阻止細胞G1/S期轉換而有效抑制細胞的增值，促進腫瘤細胞的凋亡。
[0012]5.本發明同時從劃痕實驗和transwell細胞遷移和侵襲實驗，證實了 miR-508_5P能有效抑制腫瘤細胞侵襲、水平遷移、垂直遷移和細胞自愈能力。
[0013]6.本發明表明microRNA在臨床實踐中有非常重要的意義，將成為新一代的腫瘤生物診斷標誌物和用於腫瘤治療的分子靶標。尤其是開闢了以miR-508-5p為主的腫瘤疾病全新靶標的研究，也為研製抗腫瘤新藥開闢新的途徑。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1顯示了免疫組化對胃癌組織中Skp2蛋白進行定量與定位，證實Skp2在胃癌組組織中高表達。
`[0015]圖2顯示了提取福馬林固定後石蠟包埋組織中RNA，反轉錄為cDNA，運用q-RTPCR方法檢測miR-508-5p在胃腺正常組織和癌變組織中表達情況。
[0016]圖3顯示雙螢光素酶報告系統驗證miR-508_5p靶向抑制Skp2螢光素酶活性。
[0017]圖4顯示濃縮病毒上清液侵染腫瘤細胞，通過半定量RT-PCR，western blot和相對定量qRT-PCR檢測方法，同時證實了 miR-508-5p過表達能夠特異性明顯抑制Skp2mRNA(P< 0.05)和蛋白表達水平。
[0018]圖5顯示MTT實驗驗證了 miR-508-5p明顯抑制腫瘤細胞H印G2和SGC7901細胞的增殖。圖6顯示hoechst染色實驗驗證了 miR-508-5p明顯促進腫瘤細胞H印G2和SGC7901細胞的凋亡。
[0019]圖7顯示Transwell實驗驗證了 miR-508_5p明顯抑制腫瘤細胞H印G2和SGC7901細胞的遷移和侵襲。
【具體實施方式】
[0020]1.採用免疫組化的方法檢測癌基因SKP2基因表達情況。收集寧夏醫科大學總醫院病理科2013-2月到2013-8月期間中低分化胃腺癌病人福馬林固定後石蠟包埋的組織(FFPE) 12例，以及正常胃黏膜病人福馬林固定後石蠟包埋的組織(FFPE) 10例，連續切片，4um厚，經過脫蠟水化，ImM EDTA(PH9.0)抗原修復，H202消除內源性過氧化物酶，10%山羊血清封閉，鼠抗人SKP2 —抗孵育4°C過夜，羊抗鼠SKP2 二抗37°C孵育Ih.。採用DAB染色試劑盒對陽性區域染色，鏡下控制染色程度，最後蘇木素復染，HCL-酒精分化，氨水返藍，梯度酒精脫水，透明封片。
[0021]2.石蠟組織RNA抽提和qRT-PCR。收集組織同上，採用FFPE RNA IsolationKit (OMEGA)從石蠟組織中提取RNA，運用q-RT PCR方法檢測miR-508_5p在胃腺正常組織和癌變組織中表達情況。連續切片4-6片，IOum厚，二甲苯脫蠟，HiBind? RNAMicroElute柱子分離純化RNA,按照promege反轉錄試劑盒說明書將RNA反轉錄為cDNA。U6作為內參基因，結果採用相對定量法，公式為2_ΛΛσ。
[0022]3.pSicoR-miR-508-5p 重組慢病毒載體及 pMIR-R印ort-SKP2_3』 UTR 表達載體的構建與鑑定。將經過Hpa I和Xho I限制性內切酶雙酶切的pSicoR質粒，以及經過MIU I和Spe I限制性內切酶雙酶切的pMIR-R印ort質粒，用12g/L的瓊脂糖凝膠跑電泳並對目的條帶進行膠回收，分別將線性化的pSicoR質粒與雙鏈miR-508-5p DNA片段連接，將線性化的pMIR-R印ort質粒與SKP23』_UTR連接，反應條件為22°C，2h。將連接產物轉化到大腸桿菌TopiO感受態細胞，挑取單菌落，搖菌，提取質粒DNA，分別用Xba 1、Xho I及MIU 1、SpeI限制性內切酶雙酶切鑑定並測序。
[0023]4.雙螢光素酶報告系統。將HEK-293T細胞接種於96孔板，使轉染時細胞密度達到 I X lOVmL。將 pSicoR-miR-508-5p 過表達載體和 pMIR-R印ort-SKP2_3』 UTR 載體共轉染至 293T 細胞中，同時共轉染 pMIR-R印ort-SKP2-3』UTR mut 載體及 miR-508_5pinhibitor(5』 -CAUGAGUGACGCCCUCUGG AGUA-3』 )做對照。每組共轉染海蜃螢光素酶(PRL-TK)做為內參，轉染試劑為Tranglipid Transfection Regent2000。轉染48h後，突光倒置顯微鏡下觀察綠色螢光發光情況，並裂解細胞，按照promega雙螢光素酶試劑盒說明書進行操作，所用儀器為微孔板發光分析儀。
[0024]5.包裝慢病毒建立 腫瘤細胞模型。在6孔細胞培養板中接種約IXlO6個HEK-293T細胞，每孔加入2mL含10% FBS DMEM完全培養基，37°C,5% C02培養24h後，細胞密度達到80 %~90 %時，按照TransLipid Transfection Reagent說明書，將三質粒系統(pSicoR-miR-508-5p 過表達載體 1.5 μ g，pVSVG0.45 μ g, Δ 8.911.05 μ g)共轉染至ΗΕΚ-293Τ細胞中，收集轉染48h和72h後的上清液。4°C 3000g離心lOmin，去除細胞碎片，然後將上清用0.45 μ m的PVDF濾膜過濾，_80°C分裝保存。運用倍比稀釋原則對病毒進行滴度測定，侵染腫瘤細胞系HepG2和SGC7901。
[0025]6.Western blot analysis。慢病毒侵染細胞同上，48h後觀察GFP的表達情況，按照凱基提全蛋白試劑盒說明書提全蛋白，_80°C分裝保存。提取的蛋白進行BCA法定量。SDS-PAGE分離，半乾轉至PVDF膜，50g/L脫脂奶粉封閉，4°C過夜後，加入兔抗的SKP2抗體(1:100)室溫搖晃孵育2h後4°C過夜，TBST洗膜後，加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的山羊抗兔IgG(l:5000)孵育2h，充分洗膜後利用ECL化學發光法進行暗室曝光。
[0026]7.MTT檢測細胞增殖情況。慢病毒侵染細胞同上，24、48、72h後終止刺激。更換無血清培養液，每孔90 μ L，加入50 μ L MTT溶液(5mg/mL)，繼續培養4h，加入150 μ L DMSO溶解結晶。酶聯免疫檢測儀檢測490nm的吸光度(A490)值。同時設置調零孔和對照孔，每組設定3復孔實驗結果用柱狀圖或不同時間段折線圖表示。
[0027]8.Hoechst染色檢測細胞凋亡情況。6孔板放置無菌細胞爬片，接種合適密度的腫瘤細胞，
[0028]慢病毒侵染後48h，加入固定液，PBS清洗後，每孔加入0.5ml Hoechst33258染色液，避光染色5min。去染液，PBS洗兩遍，滴一滴抗螢光淬滅封片液於載玻片上，蓋上貼有細胞的爬片，讓細胞接觸封片液，儘量避免氣泡。螢光顯微鏡檢測，激發波長350nm左右，發射波長460nm左右。計數藍白色的細胞核(凋亡細胞)數量。
[0029]9.Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲情況。細胞侵襲實驗=Matrigel基質膠來源於BD公司，首先將分裝凍存在_20°C的新鮮Matrigel在冰上解凍並按照體積比1:8與無血清DMEM培養基配置成混懸液,包被TranswelI (孔徑8um)小室:用無菌鑷子將Transwell小室放入24孔細胞培養板，將製備好的Matrigel混懸液按70ul/室加入24孔板，放入細胞孵育箱中30min,取出後在超淨工作檯上風乾30min,在Transwell小室的下室內加入500ul含10% FBS的DMEM培養基，上室中加入製備好的細胞懸液IO4/孔，細胞常規培養48h，以鑷子小心將Transwell小室取出，棄去上室培養基，用無菌棉籤輕將上室內面殘餘的細胞及Matrigel膠刮去，滴加90%乙醇在小室的外側面，固定lOmin，0.1 %結晶紫染色5min，正置顯微鏡鏡下採集照片，隨機選取5個高倍鏡視野，計數穿膜的細胞數，並進行統計分析。細胞遷移實驗類似，除了不用鋪`Matrigel基質膠，上室接種2xl04/孔細胞，常規培養24h。
【權利要求】
1.MiRNA-508-5p通過抑制癌基因Skp2的表達，在預防與治療胃癌和肝癌等疾病中作為腫瘤標誌物的作用。
2.根據權利要求1所述的用途，miR-508-5p在腫瘤細胞過表達對相關腫瘤的調控作用和相關疾病藥物中的作 用。
【文檔編號】C12Q1/68GK103805693SQ201310548573
【公開日】2014年5月21日 申請日期:2013年10月29日 優先權日:2013年10月29日
【發明者】徐廣賢, 魏軍, 張愛君, 白靜 申請人:寧夏醫科大學