治療和預防炎症性疾病的誘餌組合物的製作方法

2023-12-08 18:45:06

專利名稱：治療和預防炎症性疾病的誘餌組合物的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種組合物及其應用，所述組合物包含與轉錄調節因子結合的位點特異性結合的一種化合物(如核酸及其類似物)。更特異地，本發明涉及包含一種誘餌化合物(decoy compound)(如核因子κB(NF-κB)誘餌)的治療炎症性疾病(disease)或障礙(disorder)的一種組合物。
背景技術：
許多疾病，包括氣喘、癌症、心臟病、動脈瘤、自身免疫疾病及病毒感染出現可變症狀和跡象，已經提示一或幾種蛋白質的異常表達(過表達或低表達)在許多情況中是主要的病因。通常，那些蛋白質的表達是由許多轉錄調節因子，如轉錄激活因子和轉錄抑制基因控制的。
NF-κB是這種編碼對炎症和免疫應答而言重要的基因產物的基因的轉錄調節因子之一(Baeuerle PA.et al.，Annu Rev Immunol.1994；12141-79)。NF-κB應答多種胞外信號並從胞質遷移至細胞核，在一些細胞因子和粘著分子基因的協同反式激活中起關鍵作用。Cooper等論證了NF-κB的DNA結合活性的時間依賴性提高，其在異源心臟移植動物模型中在排斥之前3天出現峰值(Cooper M.等，Transplantation，1998 Oct.15；66(7)838-44)。然而，給予PDTC顯著延長受體動物的存活時間，PDTC是NF-κB的一種強力抑制劑，降低所述模型中NF-κB活性峰值。
人NF-κB的正常活性形式是兩個DNA結合亞單位的異源二聚體，所述亞單位是50kDa亞單位(p50)和65kDa亞單位(relA或p65)(Lenardo，Cell.1989 Jul 28，58(2)227-9；Libermann，Mol Cell Biol.1990 May；10(5)2327-34；Satriano J，J Clin Invest.1994 Oct；94(4)1629-36；Neish AS et al.，J Exp Med.1992 Dec 1，176(6)1583-93)。在未被刺激的細胞中，NF-κB結合稱作IκB的一種抑制分子並在胞質內隱藏。在細胞被刺激後，IκB被磷酸化，然後迅速降解。之後，NF-κB從IκB中釋放，從而使得轉錄因子易位至細胞核，在此所述轉錄因子結合多個DNA識別位點以調節基因表達(Baeurerle，1994，如前述)。已經提示轉錄因子NF-κB從所述複合物中的解離誘導基因，包括白細胞介素(IL)-1、-6和-8、胞內粘著分子、血管細胞粘著分子和內皮細胞粘著分子的經調節的反式激活，並在炎症改變的調節中起關鍵作用(Lenardo，1989如前述；Libermann，1990如前述；Satriano J，1994如前述；Neish，1992如前述)。因此，NF-κB的阻斷可以減弱基因介導的心肌缺血再灌注。
NF-κB可參與惡性腫瘤的發生進展(Rayet B et al.，Oncogene1999 Nov 22，18(49)6938-47)；NF-κB參與對缺氧應激的腫瘤細胞應答(Royds JA et al.，Mol Pathol 1998 Apr.，51(2)55-61)；NF-κB抑制細胞因子和粘著分子在衍生自慢性類風溼性關節炎患者的滑膜細胞中的表達(Tomita T et al.，Rheumatology(Oxford)2000 Jul，39(7)749-57)；眾多轉錄因子，包括NF-κB之間的協同抑制改變了多種腫瘤的惡性表型(Denhardt DT，Crit Rev Oncog 1996，7(3-4)261-91)；由於綠茶多酚所致的NF-κB激活的下調阻斷了一氧化氮合酶的誘導，並抑制A431人表皮樣癌細胞(Lin JK et al.，Biochem Pharmacol 1999Sep 15，58(6)911-5)；在阿爾茨海默病患者腦中觀測到的β澱粉樣肽結合成神經細胞瘤細胞中的75kD神經營養受體(p75NTR)，以時間依賴性方式和劑量依賴性方式激活NF-κB(Kuper P et al.，JNeurosci Res 1998 Dec 15，54(6)798-804)；TNF-α在腎小球性腎炎的發生中起重要作用(Ardaillou et al.，Bull Acad Natl Med 1995 Jan，179(1)103-15)。
一種NF-κB轉錄因子誘餌抑制細胞因子和粘著分子在體內在TNF-α誘導的小鼠腎炎中的表達(Tomita N et al.，Gene Ther 2000Aug，7(15)1326-32)等等。
這提示NF-κB在轉錄水平抑制MMP1和MMP9，所述MMP1和MMP9是基質金屬蛋白酶(MMP)的成員(Eberhardt W，HuwilerA，Beck KF，Walpen S，Pfeilschifter J.J Immunol 2000 Nov 15，165(10)，5788-97；M，Baker AH，Newby AC.Biochem Biophys ResCommun.Bond 1999 Oct 22，264(2)，561-7；Bond M，Fabunmi RP，Baker AH，Newby AC.FEBS Lett 1998 Sep.11，435(1)，29-34；及Kim H，Koh G.Biochem Biophys Res Commun.2000 Mar 16，269(2)，401-5)。MMP是參與胞外基質成分降解的鋅依賴性酶的多基因家族。
MMP通過介導胞外基質蛋白質的降解而在癌細胞的侵潤中起重要作用。許多研究提示MMP和MMP抑制劑(TIMP)參與癌症的進展血清中TIMP1水平可用作結腸和直腸癌的預後和診斷的標記，及用作轉移癌的一個選擇性標記(Pellegrinl P et al.，Cancer ImmunolImmunother 2000 Sep，49(7)388-94)；MMP2和MMP9在人膀胱癌細胞中的表達和活性受到腫瘤壞死因子α和γ幹擾素的影響(ShinKY et al.，Cancer Lett 2000 Oct 31，159(2)127-134)；MMP2、MMP9和MT1-MMP及其抑制劑TIMP1和TIMP2在卵巢上皮腫瘤中表達(Sakata K et al.，Int J Oncol 2000 Oct，17(4)673-681)；MMP1、MMP2、MMP3和MMP9的每一個的水平及MMP的整體活性在結腸和直腸腫瘤中是上調的，MMP1在結腸和直腸癌的進展中最重要(Baker EA et al.，Br J Surg 2000 Sep，87(9)1215-1221)；激活的MMP2尿道上皮癌的侵潤中起重要作用，而且激活的MMP2的表達水平可用作一種有效的預後指數(Kaneda K et al.，BJU Int 2000 Sep，86(4)553-557)；一種前列腺素合成抑制劑抑制人前列腺腫瘤細胞的侵潤，並降低MMP的釋放(Attiga FA et al，Cancer Res 2000 Aug 15，60(16)4629-37)；在乳腺癌和肺癌患者中血清優球蛋白部分的MMP活性提高，可用作這些癌症的腫瘤標記(Farias E et al.，Int J Cancer2000 Jul 20，89(4)389-94)；MMP抑制劑抑制腫瘤細胞中明膠降解活性(Ikeda M et al.，Clin Cancer Res 2000 Aug，6(8)3290-6)；由於膜蛋白LMP1所致的MMP9的誘導促進鼻咽癌(NPC)的轉移(Horikawa T et al.，Cancer 2000 Aug 15，89(4)715-23)；MMP在血管成形術的早期階段起重要作用，MMP抑制劑抑制人微血管內皮細胞的侵潤和形態發生(Jia MC et al.，Adv Exp Med Biol 2000，476181-94)；MMP9在侵潤性和復發的垂體腺瘤和垂體癌中表達(TurnerHE et al.，J Clin Endocrinol Metab 2000 Aug，85(8)2931-5)等等。
還已知MMP參與主動脈瘤的發生MMP參與腦動脈瘤的形成和破裂(Gaetani P et al.，Neurol Res 1999 Jun，21(4)385-90)；MMP-9啟動子是腦動脈瘤的一個危險因素(Peters DG et al.，Stroke 1999 Dec，30(12)2612-6)；MMP的抑制在動脈瘤模型中抑制了微動脈瘤的生長(Treharne GD et al.，Br J Surg 1999Aug，86(8)1053-8)等等。MMP從遷移的血管平滑肌細胞、巨噬細胞等中分泌，並破壞血管壁中存在的膠原、彈性蛋白等，從而血管的緊張性喪失而且血管不再抵抗血壓及其直徑擴展。事實上，在動脈瘤的血管中觀測到彈性蛋白的明顯破壞。
根據通過測定35-80歲成年男性的主動脈直徑獲得的數據，平均值為1.5-2.0cm。通常，直徑超過平均值1.5倍的主動脈被判斷為主動脈瘤。然而，根據上述數據，在每400人中就有一個人具有直徑為3cm或更大的動脈瘤，這被判斷為主動脈瘤。因此，儘管在此不考慮主動脈破裂的危險程度，但主動脈瘤的流行在35-80歲的成年男性中相對較高。在65或更高年齡的男性中認為該流行更顯著。
已經有報導MMP抑制劑在大鼠腹部中的主動脈瘤模型中抑制血管直徑的擴展。MMP抑制劑可用於治療腎小球性腎炎(Marti HP，Schweiz Med Wochenschr 2000 May 27，130(21)，784-8)。然而，系統性給予MMP抑制劑產生嚴重的副作用，並難以臨床應用處理(治療和預防)多種疾病。
合成的ODN作為一種「誘餌化合物」順式元件阻斷核因子結合其指定基因的啟動子區域，從而抑制體外和體內分析系統的基因反式激活(Sullenger，J Virol 1991 Dec，65(12)6811-6；Morishita R.etal.，Contrib Nephrol.1996，118254-64)。這種誘餌策略已經用於治療某些人體疾病。本發明人先前報導了E2F誘餌ODN的轉染作為在氣囊損傷後再狹窄的基因治療模型以抑制新生內膜(neointimal)增殖(Morishita，Proc Natl Acad Sci USA，1995 Jun 20，92(13)5855-9)。最近，本發明人在大鼠中使用NF-κB誘餌成功地在體內保護心肌免於缺血損傷。
(本發明要解決的問題)因此，這提示NF-κB通過在其轉錄控制下許多基因的表達而參與多種疾病。然而，目前還沒有有效治療與炎症性疾病相關的障礙或疾病的方法，尤其是非侵入性治療方法。特別是如上所述，炎症性疾病，如類風溼性關節炎和骨關節炎等不是很罕見的疾病。隨著社會的老齡化，動脈硬化疾病的增多不可避免地導致主動脈瘤疾病的增多。考慮到患者年齡的增加，理想的是使用藥物直接抑制炎症性疾病的生長，然而，迄今為止還未獲得這種手段。因此非常需要揭示炎症性疾病的一種低侵入性的治療和預防方法。
炎症性疾病是指與炎症相關的任何疾病或障礙。特別地，需要可以有效治療關節部位的炎症性疾病(例如，類風溼性關節炎、骨關節炎、肩關節周炎等)，而又無副作用或顯著降低副作用的方法。
發明概述本發明提供了治療或預防炎症性疾病或障礙以及由所述疾病或障礙所致的障礙的一種組合物，該組合物包含至少一種NF-κB誘餌或者相似的轉錄因子的誘餌，及一種藥物可接受的載體。本發明還提供了一種治療或預防炎症性疾病或障礙以及由所述疾病或障礙所致的障礙的方法，所述方法包括為治療對象給予一種組合物，所述組合物包含至少一種NF-κB誘餌或者相似的轉錄因子的誘餌，及一種藥物可接受的載體。
在一個實施方案中，炎症性疾病包括許多炎症，如腎炎、肝炎、關節炎(例如類風溼性關節炎、骨關節炎等)、急性腎衰竭、慢性腎衰竭、動脈硬化、腎小球性腎炎、腎盂腎炎、膀胱炎、前列腺炎、尿道炎、附睪炎、睪丸炎等。所述障礙是與上述炎症性疾病相關的那些障礙。所述藥物可接受的載體可以是脂質體。所述NF-κB誘餌可包含一個序列GGATTTCCC。在一個實施方案中，所述誘餌或組合物可以直接施用於關節處。
因此，本發明提供如下內容1.一種治療和預防炎症性疾病或障礙的藥物組合物，其包含至少一種NF-κB誘餌，及一種藥物可接受的載體。
2.根據第1項的組合物，其中所述疾病或障礙是選自如下一組中的至少一種腎炎、肝炎、關節炎、急性腎衰竭、慢性腎衰竭、動脈硬化、腎小球性腎炎、腎盂腎炎、膀胱炎、前列腺炎、尿道炎、附睪炎、睪丸炎。
3.根據第1項的組合物，其中所述藥物可接受的載體是脂質體。
4.根據第1項的組合物，其中所述NF-κB誘餌包含一個序列GGATTTCCC。
5.根據第1項的組合物，其中所述疾病或障礙是骨關節炎或類風溼性關節炎。
6.根據第1項的組合物，其適於膝關節給藥。
7.根據第6項的組合物，其包含至少10mg所述NF-κB誘餌。
8.根據第6項的組合物，其包含至少30mg所述NF-κB誘餌。
9.一種治療和預防關節疾病或障礙的藥物組合物，其包含至少一種NF-κB誘餌，及一種藥物可接受的載體。
10.根據第9項的組合物，其中所述疾病或障礙是選自如下一組中的至少一種類風溼性關節炎、骨關節炎、肩關節周炎、頸臂症候群和繼發性關節炎。
11.根據第9項的組合物，其中所述藥物可接受的載體是脂質體。
12.根據第9項的組合物，其中所述NF-κB誘餌包含一個序列GGATTTCCC。
13.根據第9項的組合物，其中所述疾病或障礙是骨關節炎或類風溼性關節炎。
14.根據第9項的組合物，其中所述疾病或障礙是類風溼性關節炎，其包含至少治療有效量的所述誘餌。
15.根據第14項的組合物，其中所述治療有效量是至少0.01mg/kg體重。
16.根據第9項的組合物，其適於膝關節給藥。
17.根據第16項的組合物，其中所述NF-κB包含至少10mg。
18.根據第16項的組合物，其中所述NF-κB誘餌包含至少30mg。
19.一種治療或預防炎症性疾病或障礙的方法，包括給予患者一種組合物，所述組合物包含至少一種NF-κB誘餌，及一種藥物可接受的載體。
20.根據第19項的方法，其中所述疾病或障礙是選自如下一組中的至少一種腎炎、肝炎、關節炎、急性腎衰竭、慢性腎衰竭、動脈硬化、腎小球性腎炎、腎盂腎炎、膀胱炎、前列腺炎、尿道炎、附睪炎和睪丸炎。
21.根據第19項的方法，其中所述藥物可接受的載體是脂質體。
22.根據第19項的方法，其中所述NF-κB誘餌包含一個序列GGATTTCCC。
23.根據第19項的方法，其中所述疾病或障礙是骨關節炎或類風溼性關節炎。
24.根據第19項的方法，其中所述組合物適於膝關節給藥。
25.根據第24項的方法，其中所述組合物包含至少10mg的NF-κB誘餌。
26.根據第24項的方法，其中所述組合物包含至少30mg的NF-κB誘餌。
27.一種治療和預防關節疾病或障礙的方法，包括給予患者一種組合物，所述組合物包含至少一種NF-κB誘餌，及一種藥物可接受的載體。
28.根據第27項的方法，其中所述疾病或障礙是選自如下一組中的至少一種類風溼性關節炎、骨關節炎、肩關節周炎、頸臂症候群和繼發性關節炎。
29.根據第27項的方法，其中所述藥物可接受的載體是脂質體。
30.根據第27項的方法，其中所述NF-κB誘餌包含一個序列GGATTTCCC。
31.根據第27項的方法，其中所述疾病或障礙是骨關節炎或類風溼性關節炎。
32.根據第27項的方法，其中所述疾病或障礙是類風溼性關節炎，所述誘餌包含至少治療有效量。
33.根據第27項的方法，其中所述治療有效量是至少0.01mg/kg體重。
34.根據第27項的方法，其中所述組合物適於膝關節給藥。
35.根據第34項的方法，其中所述組合物包含至少10mg的所述NF-κB誘餌。
36.根據第34項的方法，其中所述組合物包含至少30mg的所述NF-κB誘餌。
37.至少一種NF-κB誘餌在生產治療和預防炎症性疾病或障礙的藥物中的應用。
38.根據第37項的應用，其中所述疾病或障礙是選自如下一組中的至少一種腎炎、肝炎、關節炎、急性腎衰竭、慢性腎衰竭、動脈硬化、腎小球性腎炎、腎盂腎炎、膀胱炎、前列腺炎、尿道炎、附睪炎和睪丸炎。
39.根據第37項的應用，其中所述藥物可接受的載體是脂質體。
40.根據第37項的應用，其中所述NF-κB誘餌包含一個序列GGATTTCCC。
41.根據第37項的應用，其中所述疾病或障礙是骨關節炎或類風溼性關節炎。
42.根據第37項的應用，其中所述組合物適於膝關節給藥。
43.根據第42項的應用，其中所述組合物包含至少10mg的NF-κB誘餌。
44.根據第42項的應用，其中所述組合物包含至少30mg的NF-κB誘餌。
45.至少一種NF-κB誘餌在生產治療和預防關節疾病或障礙的藥物中的應用。
46.根據第45項的應用，其中所述疾病或障礙是選自如下一組中的至少一種類風溼性關節炎、骨關節炎、肩關節周炎、頸臂症候群和繼發性關節炎。
47.根據第45項的應用，其中所述藥物可接受的載體是脂質體。
48.根據第45項的應用，其中所述NF-κB誘餌包含一個序列GGATTTCCC。
49.根據第45項的應用，其中所述疾病或障礙是骨關節炎或類風溼性關節炎。
50.根據第45項的應用，其中所述疾病或障礙是類風溼性關節炎，所述誘餌包含至少治療有效量。
51.根據第45項的應用，其中所述治療有效量是至少0.01mg/kg體重。
52.根據第45項的應用，其中所述組合物適於膝關節給藥。
53.根據第52項的應用，其中所述組合物包含至少10mg的所述NF-κB誘餌。
54.根據第52項的方法，其中所述組合物包含至少30mg的所述NF-κB誘餌。
本領域技術人員通過閱讀及理解如下詳細描述，及如果需要則參考附圖，對本發明的這些及其它優點將更清楚。
附圖簡述

圖1是示出在猿膠原蛋白關節炎模型的關節中出現由本發明的誘餌所致的改變的X光照片。不加處理和接受混雜的誘餌的模型無作用，而接受本發明誘餌處理的模型示出許多顯著的改善，如滑膜炎症的改變、關節腫脹的抑制及關節軟骨和關節中破骨的抑制等。
圖2示出關節切面的照片，示出NF-κB對骨關節炎大鼠模型的作用。該圖示出一個正常的供體，一個膠原蛋白產生的關節炎模型，及NF-κB誘餌(給予10mg和30mg)對這個模型的作用和類固醇對這個模型的作用。給予10mg的誘餌已經獲得顯著作用，給予30mg誘餌則消滅關節炎。這些作用超過類固醇所獲得的那些作用。另外，與類固醇處理相反，這種處理無副作用。
圖3示出本發明的治療膠原蛋白產生的關節炎的方案。
圖4示出本發明的治療骨關節炎的方案。
最佳實施方式下文將對本發明加以描述。應理解在本說明書中單數形式(例如「一個、一種」等)除了特別說明之外均包括其複數的概念。還應理解本文所用術語除了特別說明之外均具有本領域典型使用的含義。因此，除了特別說明之外，本文所用的所有技術和科學術語均具有本領域技術人員所一般了解的相同含義。如果有任何不一致之處，本說明書提前加以說明。
本文所用術語「誘餌」或「誘餌化合物」是指一種化合物，其模擬轉錄因子，如NF-κB所結合的一個染色體位點，或者其模擬轉錄調節因子結合的由轉錄因子，如NF-κB等控制的一個基因的染色體位點(後文稱作「靶結合位點」)，從而與結合轉錄因子的染色體結合位點競爭。典型地，所述誘餌或誘餌化合物包括一種核酸及其類似物。
當一種誘餌存在於細胞核中時，所述誘餌與轉錄調節因子競爭結合該轉錄調節因子的靶結合位點。結果，由轉錄調節因子與靶結合位點結合而產生的生物學功能被抑制。所述誘餌含有能結合靶結合序列的至少一個核酸序列。本發明的誘餌可用於製備一種藥物組合物，只要該誘餌具有與靶結合序列結合的活性。
所述誘餌的實例包括含有關於NF-κB的GGGATTTC的寡核苷酸。優選的誘餌的實例包括5』-CCTTGAAGGGATTTCCCTCC-3』(SEQID NO1)(NF-κB誘餌)，5』-GATCTAGGGATTTCCGGGAAATGAAGCT-3』(SEQ ID NO2)(STAT-1誘餌)，5』-AGCTTGAGATAGAGCT-3』)(SEQ ID NO3)(GATA-3誘餌)，5』-GATCAAGACCTTTTCCCAAGAAATCTAT-3』(SEQ ID NO4)(STAT-6誘餌)，5』-AGCTTGTGAGTCAGAAGCT-3』(SEQ ID NO5)(AP-1誘餌)，及5』-AATTCACCGGAAGTATTCGA-3』(SEQ ID NO6)(Ets誘餌)，5』-TGACGTCA-3』(CRE誘餌序列)，或者其含有寡核苷酸的互補序列、其突變體，或者含有這些分子的化合物。所述寡核苷酸可以是DNA或RNA。所述寡核苷酸還可以包括一種修飾的核酸和/或假核酸。另外，這些寡核苷酸可以是其突變體，或者含有其的化合物。所述寡核苷酸可以具有單鏈或雙鏈，或者可以是線性或環形的。突變體是具有上述序列的核酸，其一部分具有一個突變、取代、插入或缺失，就所述因子結合的核酸結合位點而言，其特異性拮抗一種轉錄因子，如NF-κB等，或者由轉錄因子如NF-κB等控制的基因的另一種轉錄調節因子。轉錄因子，如NF-κB等或由轉錄因子如NF-κB等控制的基因的其它轉錄調節因子的誘餌的更優選的實例包括含有一或多個上述核酸序列的雙鏈寡核苷酸或其突變體。含有一或多個上述核酸序列的核酸，當包含的核酸序列數是2時稱為雙重誘餌，當包含的核酸序列數是3時稱為三重誘餌，表明核酸序列數。
本發明中使用的寡核苷酸包括經修飾的以對體內降解具有抗性的寡核苷酸，如具有三磷酸二酯鍵的寡核苷酸(S-oligo)，所述鍵是一種磷酸二酯鍵，其氧原子被硫原子置換，及包括其磷酸二酯鍵被一個無電荷的甲基磷酸基團取代的寡核苷酸等。
本發明的誘餌可以利用本領域已知的化學或生物化學合成方法生產。例如，當一種核酸被用作誘餌化合物時，可應用遺傳工程中一般使用的核酸合成方法。例如，可以使用DNA合成儀直接合成指定的誘餌核酸。另外，可以合成這些核酸、含有所述核酸或其一部分的核酸，隨後使用PCR方法和一個克隆載體進行擴增等。另外，將通過這些方法獲得的核酸使用一種限制酶切割，並使用DNA連接酶連接以產生指定的核酸。為獲得在細胞中更穩定的誘餌核酸，可以將所述核酸的鹼基、糖和磷酸部分進行化學修飾，如烷化、醯化等。
本發明提供了一種藥物組合物，其只包含上述誘餌化合物或者組合一種穩定化合物、一種稀釋劑、一種載體或另一種成分、或者一種藥劑。
本發明的藥物組合物可以這樣一種形式應用，即所述誘餌被攝入受影響部分的細胞中或者指定組織的細胞中。
本發明的藥物組合物是在任何無菌的生物適合的藥物載體中給予的(所述載體包括但非限於生理鹽水、緩衝的生理鹽水、葡萄糖和水)。任何這些分子與一種合適的賦形劑、佐劑和/或藥物可接受的載體混和的一種藥物組合物可單獨給予患者，或者與另一種藥物組合物中的藥劑組合給予。在本發明的一個實施方案中，所述藥物可接受的載體是無藥物學活性的。
本發明的藥物組合物通過口服或非腸道給予。非傳道給藥方法包括局部給藥、動脈內給藥(例如通過頸動脈給藥)、肌內給藥、皮下給藥、髓內給藥、注入蛛網膜下隙、心室內給藥、靜脈內給藥、腹膜內給藥或鼻內給藥。在本發明中，任何給藥途徑均可使用，只要所述組合物通過該途徑可以到達進行治療的部位，特別是炎症部位即可。因此，本發明提供了一種新的治療方法以在炎症部位或動脈進行基因轉染及進行該方法的一種組合物。
除了所述誘餌化合物之外，這些藥物組合物還含有一種合適的藥物可接受的載體，包括促進所述誘餌化合物進程的另一種化合物以產生可以藥物學應用的賦形劑或製品。關於所述誘餌化合物的製備和給藥的技術的詳細描述見例如最近增補的日本藥典最新版本及「REMINGTON』S PHARMACEUTICAL SCIENCES」(MaackPublishing Co.，Easton，PA)所述。
口服給藥的藥物組合物可以使用本領域熟知的一種藥物可接受的載體以適於給藥的給藥形式製備。這種載體可以被製成片劑、藥丸、糖衣藥物、膠囊、液體、凝膠、糖漿、漿液、懸浮液等，適於患者攝取該藥物組合物。
口服給藥的藥物組合物可以如下方式獲得將一種活性化合物與一種固體賦形劑組合，如果需要則將所得混合物粉碎，如果需要則再加入一種合適的混合物以獲得一種片劑或糖衣藥物的核心，加工成粒狀混合物。所述合適的賦形劑可以是碳水化合物或蛋白質充填劑，包括但非限於如下物質糖包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇；衍生自玉米、小麥、水稻、馬鈴薯或其它植物的澱粉；纖維素如甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素或者羧甲基纖維素鈉；樹膠包括阿拉伯樹膠和黃蓍樹膠；及蛋白質如明膠和膠原蛋白。如果需要可使用一種分解劑或增溶劑，如交聯的聚乙烯吡咯烷酮、瓊脂、藻酸或其鹽(例如藻酸鈉)。
提供的糖衣藥物核心是具有一種合適的包衣，如濃縮的糖溶液。所述糖衣藥物核心還可以含有阿拉伯樹膠、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、carbopolygel、聚乙二醇和/或二氧化鈦、漆溶液及一種合適的有機溶劑或溶劑混和溶液。為鑑別產物或確定活性化合物的量(即劑量)，可以在片劑或糖衣藥物中加入染料或色素。
口服給藥的藥物製品可含有，例如，密閉的軟膠囊，其由明膠膠囊、明膠和包衣(例如甘油或山梨糖醇)組成。所述凝膠膠囊可含有一種活性成分混和一種充填劑或結合劑，如乳糖或澱粉，一種潤滑劑，如滑石或硬脂酸鎂，及任選一種穩定劑。在軟膠囊中，所述誘餌化合物可以溶解或懸浮於一種合適的液體，如脂肪油、液體石蠟或液體聚乙二醇中，有或無穩定劑。
非腸道給藥的藥物製品含有活性化合物的一種水溶液。為進行注射，本發明的藥物組合物是在水溶液中製備的，優選在Hank’s溶液、Ringer’s溶液或生理學合適的緩衝液，如緩衝的生理鹽水中製備。進行注射的水相懸浮液可含有提高懸浮液粘性的一種物質(例如羧甲基纖維素鈉、山梨糖醇或葡聚糖)。另外，所述活性化合物的懸浮液可以製備成一種合適的油相懸浮液。合適的親脂性溶劑或載體包括脂肪酸，如芝麻油，合成的脂肪酸酯，如油酸乙酯或甘油三酯，或脂質體。如果需要，所述懸浮液可含有一種穩定劑以製備高濃度溶液，或者含有一種合適的藥劑或試劑以提高所述化合物的溶解性。
就局部或鼻內給藥而言，可以在製備中使用一種滲透特殊屏障的合適滲透劑。這種滲透劑是本領域所熟知的。
本發明的藥物組合物可以使用與本領域已知方法相似的方法生產(例如，常規混和、分解、形成顆粒、製備糖衣製劑、淘析、乳化、包囊化、包含、冷凍乾燥或凍幹)。
優選地，在非腸道給藥的情況中，如局部給藥或從頸部灌注入受影響部分的細胞或指定組織的細胞中，本發明的藥物組合物可含有一種合成的或天然的親水性聚合物作為載體。這種親水性聚合物例如包括羥丙基纖維素和聚乙二醇。本發明的誘餌化合物可以與上述親水性聚合物在合適的溶劑中混和。所述溶劑可以通過如空氣乾燥方法除去。所得化合物可以根據所希望的形式成形，如薄片，然後給予靶位點。含有親水性聚合物的這種製品的含水量低，具有良好的保存期限及良好的誘餌保持力，因為當使用時所述製品吸收水分轉變為凝膠。
或者，當一種核酸或其修飾體用作誘餌時，本發明的藥物組合物優選以基因導入方法中通常使用的形式有利地應用，如使用仙臺病毒(HVJ)等的膜融合脂質體製品，使用胞吞等的脂質體製品，含有陽離子脂質如Lipofectamine(Gibco BRL)等的製品，或者使用逆轉錄病毒載體、腺病毒載體的病毒製品。特別優選膜融合脂質體製品。
所述脂質體製品是任何脂質體構建體，其是大單層小泡(LUV)、多層小泡(MLV)和小單層小泡(SUV)。LUV的顆粒大小為大約200-1000nm。MLV的顆粒大小為大約400-3500nm。SUV的顆粒大小為大約20-50nm。使用HVJ等的膜融合脂質體製品優選應用顆粒大小為大約200nm-1000nm的MLV。
對生產脂質體的方法無特殊限制，只要所述脂質體具有一個誘餌。所述脂質體可以通過常規使用的方法生產，例如，反相蒸發方法(Szoka，F et al.，Biochim Biophys Acta，Vol.601 559(1980))、醚浸漬(ether infusion)方法(Deamer，D.W.Ann.N.Y.Acad.Sci.，Vol.308 250(1978))、表面活性劑方法(Brunner，J et al.BiochimBiophys Acta，Vol.455 322(1976))等。
形成脂質體結構的脂質例如包括磷脂、膽固醇、氮脂質等。通常優選磷脂，包括天然的磷脂，如磷脂醯膽鹼、磷脂醯絲氨酸、磷脂醯甘油、磷脂醯肌醇、磷脂醯乙醇胺、磷脂酸、心磷脂、鞘磷脂、卵黃卵磷脂、大豆卵磷脂、溶血卵磷脂等，或者通過常規使用的方法氫化相應的磷脂，及另外的合成的磷脂，如聯十六烷磷酸酯、二硬脂醯磷脂醯膽鹼、二棕櫚醯磷脂醯膽鹼、二棕櫚醯磷脂醯乙醇胺、二棕櫚醯磷脂醯絲氨酸、桐醯磷脂醯膽鹼、桐醯磷脂醯乙醇胺、桐油醯磷脂醯絲氨酸等。
包括這些磷脂的所述脂質可以單獨使用，或者至少兩種組合使用。在這種情況中，可以使用在分子內具有一個正電基團的原子基團的脂質，如乙醇胺、膽鹼等，以提高負電性誘餌核酸的結合速度。除了用於形成脂質體的主要磷脂之外，可以使用一種添加劑，如膽固醇、硬脂醯胺、α-生育酚等，這些添加劑是通常已知形成脂質體的添加劑。
由此獲得的脂質體可另外含有一種促進膜融合的物質，如從HVJ、失活的HVJ、仙臺病毒等中純化的一種膜融合促進蛋白質，以促進被攝入受影響部位的細胞或指定組織的細胞中。
生產脂質體製品的方法的實例在下文特別加以描述。例如，將上述形成脂質體的物質與膽固醇一起溶解於一種有機溶劑，如四氫呋喃、氯仿、乙醇等中。將所得溶液置於一個合適的試管中，隨後在減壓下除去所述溶劑，從而在試管內壁上形成脂質體形成物質的一層膜。向該試管中加入含有誘餌的一種緩衝溶液，隨後攪動。如果需要則將上述膜融合促進物質加入所得脂質體中，隨後分離所述脂質體。可以將由此獲得的含有所述誘餌的脂質體懸浮於一種合適的溶劑中，或者可以凍幹，隨後分散於一種合適的溶劑中。所得懸浮液可以用於治療。在分離脂質體之後及使用之前的過渡時期可以加入所述膜融合促進物質。
本發明的組合物或試劑盒可進一步包含一種生物適合的材料。這種生物適合的材料可含有選自如下一組中的至少一種矽氧烷、膠原、明膠、乙醇酸-乳酸共聚物、乙烯乙酸乙烯酯共聚物、聚氨基甲酸酯、聚乙烯、聚四氟乙烯、聚丙烯、聚丙烯酸酯和聚甲基丙烯酸酯。優選矽氧烷，因為其易於成型。生物可降解的聚合物例如包括膠原、明膠、通過脫水縮聚而不用催化劑從選自以下一組中的至少一種合成的聚合物或共聚物α-羥基羧酸(例如乙醇酸、乳酸、羥丁酸等)、羥基二羧酸(例如蘋果酸等)和羥基三羧酸(例如檸檬酸等)或其混合物；聚α氰基丙烯酸酯、聚胺基酸(例如聚-γ-偶苯醯-L-穀氨酸等)，基於順丁烯二酸酐的共聚物的可聚合的酸酐(例如苯乙烯-順丁烯二酸共聚物等)。聚合的類型是隨機的、嵌段的及接枝的。當α-羥基羧酸、羥基二羧酸和羥基三羧酸在分子中具有光學活性中心時，可以使用任何D-異構體、L-異構體和DL-異構體。優選地，可以使用乙醇酸-乳酸共聚物。
在一個實施方案中，本發明的組合物或試劑盒可以是緩釋形式。所述緩釋劑量形式可以是本領域已知的任何形式，只要其在本發明中使用即可。這種形式包括例如條棒形式(小球形式、圓柱形式、針狀等)、片劑形式、圓盤形式、球形和薄片形式。製備緩釋形式的方法為本領域所已知，並見於例如日本藥典、美國藥典及其它國家的藥典所揭示。生產一種緩釋製品(延長給藥的製品)的方法例如包括利用藥物從複合物中解體的方法、使用一種水相懸浮液注射的方法、使用一種油相溶液注射或油相懸浮液注射的方法、使用一種乳狀液(o/w類型和w/o類型乳狀液注射等)注射的方法。
在緩釋形式的情況中，可將一種緩釋製品(小球製品等)包埋於準備給予所述製品的部位的附近。或者，可以使用一個滲透泵等持續及逐漸地給予所述緩釋製品。
可以通過本領域熟知的方法製備注射製劑。例如，將一種成分溶解於一種合適的溶劑中(生理鹽水、緩衝液如PBS、無菌用水等)，隨後使用濾膜過濾滅菌。之後，將所得溶液充填於一個無菌容器(例如安瓿等)中，從而製備所述注射製劑。如果需要則所述注射製劑可含有一種常用的藥物載體。在脂質體形式的情況中，可加入脂質體製備所需要的試劑，如懸浮劑、冷凍劑及通過離心濃縮的冷凍劑。所述脂質體優選通過非腸道給予。因此，當給予所述脂質體時，可以使用一種非侵入性導管、一種非侵入性注射器等給予。例如，作為使用非侵入性導管的給藥方法，本發明的組合物被直接灌注於腦部或者通過頸動脈而注入腦部。
本發明的藥物組合物包括含有有效量的誘餌化合物的一種組合物，所述有效量是指可以達到指定目的的誘餌化合物。「治療有效量」或「藥物有效量」是為本領域技術人員所熟知的術語，是指有效產生指定藥理學作用的藥物量。因此，治療有效量是指足以降低所治療的疾病表現的量。針對一種預定應用證實有效量(例如治療有效量)的一種有效的試驗是測定疾病的恢復程度。根據所治療的個體情況準確地給予一定量。所述量優選最佳化以達到所希望的作用而又無顯著的副作用。治療有效量的確定在本領域技術人員的能力範圍內。
任何化合物的治療有效劑量最初可以使用細胞培養分析或任何合適的動物模型進行估計。所述動物模型用於獲得所希望的濃度範圍和給藥途徑。之後，這種信息可用於確定用於給予人體的劑量和途徑。
治療有效量是指誘餌化合物的一個量，這個量導致疾病的症狀或狀況減輕。這種化合物的治療作用和毒性可以通過標準藥理學程序在細胞培養物或實驗動物中確定(例如ED50，半數治療有效量；LD50，半數致死量)。治療作用和毒性作用之間的劑量比是一個治療指數，可以表示為ED50/LD50比值。優選呈現高治療指數的藥物組合物。從細胞培養分析和動物研究中獲得的數據可用於配製用於人體的劑量範圍。這種化合物的劑量優選在循環濃度包括ED50時毒性很低或無毒性的範圍內。這種劑量可在此範圍內根據所應用的劑型、患者的易感性及給藥途徑而變化。例如，誘餌的劑量是根據患者年齡及其它狀況、疾病類型、所應用的誘餌的類型等而適當選擇的。例如，所述誘餌每日一次或多次給予腦部，每次10-10000nmole。所述誘餌一般通過頸動脈給予，每日一或多次，每次10-10000nmole。
在一個實施方案中，所述治療有效量典型地可以是至少0.01mg/kg體重，通常為至少0.05mg/kg體重，優選為至少0.1mg/kg體重。在膝治療的情況中，治療有效量可以是100μg-100mg/關節，通常為至少5mg/關節，優選為至少10mg/關節，更優選為至少20mg/膝，及更優選為至少30mg/關節。治療有效量/體重可以根據所治療的屬、物種而變化。在人類患者的情況中，治療有效量可以是至少1mg/關節，通常為至少5mg/關節，優選為至少10mg/關節，更優選為至少20mg/關節，更優選為至少30mg/關節。在給予骨關節炎和類風溼性關節炎的膝的情況中，治療有效量可以是0.01-500mg/關節，通常為0.05-100mg/關節，優選為至少0.1-5mg/關節。在其它膝的情況中，給予量可以與關節腔的體積成比例設定。可以從猴、大鼠等動物中高概率推出所述治療有效量。給藥頻率可以是任何頻率，通常是每四周一次至每日一次。在骨關節炎和類風溼性關節炎的情況中，上述劑量適於作為治療有效量。
在一個優選的實施方案中，本發明的誘餌或誘餌化合物可以至少0.1mg/ml的量存在，更優選1.0mg/ml。在另一個優選的實施方案中，本發明的誘餌或誘餌化合物可以至少2.0mg/ml，至少5.0mg/ml，至少5.0mg/ml，至少20.0mg/ml，至少30.0mg/ml，至少50.0mg/ml，至少70.0mg/ml，至少100.0mg/ml，至少200mg/ml或更多的量存在。
精確劑量及組合物中的誘餌濃度由各個醫生根據所治療的患者的狀況加以確定。對劑量和給藥加以調節以提供足夠水平的活性部分或者具有所希望的作用。要考慮的額外因素包括疾病症狀的嚴重程度(例如腫瘤的大小和部位、患者的年齡、體重及性別、限制飲食的時間及給藥頻率、藥物組合、反應易感性及對治療的抗性/應答)。根據特異製品的半衰期和消除率，每3-4天、每周或兩周一次給予持續作用的藥物組合物。在本領域已知的出版物中提供了特異劑量和給藥方法的指導。
含有由此獲得的誘餌作為主要成分的藥物可以根據疾病的類型、所應用的誘餌的類型等而以多種方式給予。例如，就炎症性疾病或障礙而言，所述藥物可以血管內給予、應用於疾病部位、給予疾病部位、或者血管內給予疾病部位。例如在慢性關節風溼症、骨關節炎等情況中，所述藥物可以直接灌注於關節。
一方面，由本發明的化合物治療的疾病或障礙是炎症性疾病或障礙。另一方面，本發明治療的疾病或障礙是關節疾病或障礙(如關節炎)。
本文所用術語「炎症(炎症反應)」是指一種基本病理學過程，包括由一種物理、化學或生物學活性因素、疾病血管及其相鄰的組織所導致的細胞和/或組織反應的一種動態複合體。炎症包括局部反應過程，由此導致的形態學改變，損害性物質的破壞和清除，修復和痊癒。炎症的主要症狀包括紅(變為紅色)、觸冷感熱(高溫)、生長(腫脹)、痛(疼痛)等。另外，可以發生功能喪失(功能抑制或喪失)。所有這些症狀均可以觀測到，但不是所有症狀均存在。炎症是相應於對微循環系統分布的組織的毒性刺激的一種局部應答。毒性刺激可例如是外源物、物理能量等，而且損害的組織本質上也可以是這種炎性刺激。因此，炎症是對微循環系統中分布的組織中不利刺激應答的一種局部應答。這種不利刺激包括例如外源物、物理能量等，另外包括損害的組織本身，其可以是致炎症原。因此，在高等動物中炎症的特徵在於對刺激的一系列微循環系統應答。即在正常的炎症中，微循環系統瞬時自身收縮，之後自身擴展，從而開放通常是密閉的毛細管床，導致血流體積增加。另外，小靜脈區域的內皮細胞的開放空間產生血管滲透增強現象，其中血漿成分通過該空間流出至間質組織中。這種血管滲透增強在兩個階段發生，第一個階段是由組胺或5-羥色胺產生的微弱應答，第二個階段是晚期類型滲透，在炎症的血管滲透中起主要作用。然後，多核白細胞、單核細胞(巨噬細胞)、淋巴細胞等從小靜脈區域出來至間質組織中。由這些血漿和細胞成分產生的活性劑的作用促進組織細胞的增殖，從而開始修復。這一系列過程被描述為紅、腫、熱、痛。基本上，炎症是局部的保護性反應，而且另外可以具有組織損害作用。因此，炎症還包括功能性紊亂作為主要症狀。因此，詳細而言，炎症反應是與局部組織的一種複雜反應，涉及細胞病、循環紊亂、增殖等，並因此本質上可以稱作整體動態過程。
本文所用術語「炎症性疾病」是指導致整體疾病部位的慢性炎症的一種疾病，其涉及炎性細胞如淋巴細胞、漿細胞、嗜酸細胞、嗜中性粒細胞。這種炎症性疾病包括，例如，炎症，包括關節炎如類風溼性關節炎和骨關節炎、腎炎、肝炎；急性腎衰竭、慢性腎衰竭、動脈硬化、腎小球性腎炎、腎盂腎炎、膀胱炎、前列腺炎、尿道炎、附睪炎和睪丸炎等。
本文所用術語「關節疾病或障礙」包括關節的一種疾病或障礙，包括例如，類風溼性關節炎、骨關節炎、肩關節周炎、頸臂症候群及繼發性關節炎等。
本文所用術語「關節炎」是指導致關節炎症的一種疾病。在關節內部，關節腔由軟骨和滑液形成，包括在軟骨下的骨，及在滑液外部的關節囊、骨、肌、腱、韌帶等。關節易患炎症，因為當活動時關節經常受到機械刺激。炎症的原因可以是感染、外傷、過敏、代謝障礙等。相關的症狀可以是關節腫脹、疼痛(關節痛)、局部熱、運動紊亂等。病理學上，可觀測到細胞侵潤滑膜、水腫、結締組織增生等。
本文所用術語「類風溼性關節炎」是指一種疾病，特徵在於未知原因所致的慢性關節炎。男性與女性的比值為1∶4，30-50歲的人通常易患這種疾病。在日本這種疾病的發病率估計為總人口的0.3-0.5％。然而至今還未知病因，推測可能涉及許多多因素遺傳因子，特別是HLA-D4及病毒感染。關節炎可以在所有滑膜關節中發生，並存在多發及對稱傾向。最初，只觀測到滑膜炎症，然後進展為軟骨和骨的衰竭，以及軟骨變形、脫臼及骨僵硬，導致運動喪失。特別地，觀測到特徵性的腕跗骨易於變形、在掌指關節處尺骨錯位、腕骨彎曲(swan-neck)變形、腕骨紐孔花(bouttoniere)變形、及跗骨外翻。除了關節之外，可關聯到外層心包炎、脈管炎、皮下結節及纖維肺，而且在脈管炎類型的情況中預後更壞，如瀰漫性壞死性動脈周炎，因此這種類型稱為惡性類風溼性關節炎。常規地，藥物治療包括使用緩解症狀藥物(palliation introductory agent)，如類固醇、非類固醇抗炎劑、金製劑、D-青黴胺等；矯形治療，如滑膜切除術、關節成形術、置換關節成形術等；恢復治療，如熱處理、訓練治療、矯正治療、假肢修復術治療等。然而，這樣均難以達到完全治癒。特別地，類固醇等具有成問題的不利作用。
本文所用術語「關節變形(arthritis deformans)」和「骨關節炎」是指一種疾病，其中慢性退化性改變和產生性變化在關節中同時發生，從而改變關節的形狀。其可以分為原發性骨關節炎和繼發性骨關節炎。前者(原發性)是在中老年人中發現的，因此除了年齡增長之外還隨著機械刺激而進展。後者(繼發性)也可以見於較年輕的人中，發生明顯的原因，如關節外傷、畸形、疾病、代謝障礙等之後。病理學上，關節軟骨逐漸磨損或缺損，導致骨的暴露。同時，軟骨隨著血管形成而肥大性生長並形成骨刺。觀測到滑膜生長、關節囊肥大或萎縮、離析物出現。常規地，藥物治療是給予非類固醇類消炎劑及關節內注射類固醇等。另一方面，當損害進展時，進行外科手術治療，關節固定術、關節成形術、切骨術和假肢置換關節成形術等。
通過本發明治療的部位可以衍生自任何類型的生物體。通過本發明治療的生物體包括脊椎動物和非脊椎動物，優選哺乳動物(例如靈長類動物、嚙齒類動物等)，更優選靈長類動物，最優選人。
本發明的組合物和試劑盒典型地在醫師監督下應用，或者在由所涉及的國家的權威機構及法律許可下使用。
另一方面，本發明提供了治療腦缺血障礙的一種試劑盒。該試劑盒包含本發明的誘餌或誘餌化合物，及提供了給予所述誘餌或誘餌化合物的產品說明書。所述產品說明書描述了給予所述誘餌或誘餌化合物的一種合適的方法。所述產品說明書是根據實踐本發明的國家的權威機構(例如Health，Labor and Welfare Ministry(日本)，Food andDrug Administration(FDA)(美國)等)指定的形式準備的，明確地描述了由權威機構許可的用法說明。所述產品說明書是一種所謂的包裝插入物，其典型地但非限於是紙製品、電子製品(網際網路網址和電子郵件)。
本發明的誘餌或誘餌化合物的量可由本領域技術人員根據使用目的、靶疾病(類型、嚴重程度等)、患者年齡、體重、性別和病史、細胞中生物活性物質的形式或類型、細胞的形式或類型等容易地確定。
應用於患者的本發明方法的頻率也由本領域技術人員根據使用目的、靶疾病(類型、嚴重程度等)、患者年齡、體重、性別和病史、治療進展等確定。所述頻率例如包括每日一次至幾個月進行一次(例如1次/周至1次/月)。優選地，根據進展給予1次/周至1次/月。
在另一個實施方案中，本發明的治療方法可進一步包括給予另一種藥物。這種藥物可以是本領域中的任何藥物，包括藥理學領域已知的任何藥物(例如抗生素等)。當然，這種藥物可以是至少兩種其它藥物。所述藥物例如包括在最新版本的日本藥典、美國藥典及其它國家的藥典中所述那些藥物。所述藥物優選是對腦缺血疾病(例如抗血小板劑、腦神經功能改善劑、腦代謝改善劑、血流改善劑等)有作用的那些藥物。
本文所用的分子生物學技術、生物化學技術和微生物學技術是本領域熟知並常用的，見例如Ausubel F.A.等編輯(1998)，CurrentProtocols in Molecular Biology，Wiley，紐約，NY；Sambrook J等(1987)，Molecular CloningA Laboratory Manual，第2版，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，NY；Jikken-Igaku「Idenshi-Donyu Hatsugen-Kaiseki-Jikkenho [Experimental medicine「Experimentalmethods for Gene introduction Expression Analysis」，Yodo-sha，special issue，1997等。
如本文所用，除非特別說明，「核酸」、「核酸分子」、「多核苷酸」和「寡核苷酸」在此可交替地指包含一系列核苷酸的一種大分子(聚合物)。核苷酸是指其鹼基是磷酯的一種核苷。所述核苷酸的鹼基是嘧啶或嘌呤鹼基(嘧啶核苷酸和嘌呤核苷酸)。多核苷酸包括DNA或RNA。
另外，使用軟體如BLAST，基於本發明的誘餌的序列通過同源搜索一個遺傳信息資料庫如GenBank(人類基因組計劃的基因組數據)而獲得的序列也包含在本發明的範圍內。
使用BLAST(序列分析工具)，使用默認參數計算鹼基序列的相同性對比。
本文所用「在嚴格條件下雜交的多核苷酸」是指本領域熟知的並通常使用的條件。這種多肽可以通過使用選自本發明的多核苷酸的一種多核苷酸進行集落雜交、噬菌斑雜交、Southern印跡雜交等而獲得。特別地，使用其上固定了衍生自集落或噬菌斑的DNA的一種濾膜在65℃在存在0.7-1.0M NaCl下進行雜交。之後，使用0.1-2倍濃度的SSC(鹽水-檸檬酸鈉)溶液(1倍濃度的SSC溶液是由150mM NaCl和15mM檸檬酸鈉組成)在65℃洗滌該濾膜。通過這種方法鑑別的多核苷酸稱作「在嚴格條件下雜交的多核苷酸」。可以根據例如Molecular Cloning第2版、Current Protocols in Molecular Biology，Supplement 1-38，DNA Cloning 1Core Techniques，A PracticalApproach，第2版，牛津大學出版社(1995)等所述的方法進行雜交。在此，在嚴格條件下雜交的序列優選不包括僅含有A或T的序列。
術語「高嚴格條件」是指設計為允許序列是高度互補的DNA鏈雜交的那些條件，並排除明顯錯配的DNA雜交。雜交嚴格性主要是通過溫度、離子強度和變性劑如甲醯胺的濃度而確定。針對雜交和洗滌的「高嚴格條件」例如是在65-68℃，使用0.0015M的NaCl，0.0015M的檸檬酸鈉，或者在42℃使用0.015M的NaCl，0.0015M的檸檬酸鈉以及50％的甲醯胺。見Sambrook，FritschManiatis，Molecular CloningA Laboratory Manual(第2版，冷泉港實驗室，N.Y.，1989)；Anderson等，Nucleic Acid HybridizationA PracticalApproach Ch.4(IRL出版有限公司)(牛津出版社)。可以任選更嚴格的條件(如較高的溫度、較低的離子強度、較高的甲醯胺或者其它變性劑)。根據降低非特異性和/或背景雜交的目的，在雜交和洗滌緩衝液中可以包含其它試劑。儘管也可以使用其它合適的試劑，但例如可以使用0.1％牛血清白蛋白，0.1％聚乙烯吡咯烷酮，0.1％的焦磷酸鈉，0.1％的十二烷基硫酸鈉(NaDodSO4或SDS)，Ficoll，Denhardt’s溶液，超聲處理的鮭精DNA(或另一種非互補的DNA)，及硫酸葡聚糖。可以改變這些添加劑的濃度和類型而基本不影響雜交條件的嚴格性。雜交實驗通常在pH6.8-7.4進行；然而，在典型的離子強度條件下，雜交的速度幾乎不依賴於pH。見Anderson等，Nucleic AcidHybridizationA Practical Approach Ch.4(IRL出版有限公司，英國牛津)。
影響DNA雙鏈體的穩定性的試劑包括鹼基對錯配的鹼基組成、長度和程度。雜交條件可以由本領域技術人員加以調節以順應這些變量，並使得不同序列的相關的DNA形成雜合體。完全匹配的DNA雙鏈體的解鏈溫度可以通過如下等式計算Tm(℃)＝81.5+16.6(log[Na+])+0.41(％G+C)-600/N-0.72(％甲醯胺)其中N是形成的雙鏈體的長度，[Na+]是在雜交或洗滌溶液中的鈉離子摩爾濃度，％G+C是雜合體中(鳥嘌呤+胞嘧啶)鹼基的百分比。就不完全匹配的雜合體而言，解鏈溫度隨著每錯配1％而降低大約1℃。
術語「中等嚴格條件」是指在此條件下能形成比在「高嚴格條件下」可以發生的鹼基對錯配程度更高的DNA雙鏈體。典型的「中等嚴格條件」例如是在50-65℃使用0.015M的NaCl和0.0015M檸檬酸鈉，或者在37-50℃使用0.015M的NaCl，0.0015M檸檬酸鈉和20％甲醯胺。例如，在50℃在0.015M的鈉離子中的「中等嚴格條件」允許大約21％的錯配。
本領域技術人員意識到在「高嚴格條件」和「中等嚴格條件」之間沒有絕對界限。例如，在0.015M的鈉離子(無甲醯胺)情況中，完全匹配的長DNA的解鏈溫度為大約71℃。就在65℃洗滌(在相同離子濃度)而言，這允許大約6％錯配。為捕捉更不相關的序列，本領域技術人員可以簡單地降低溫度或提高離子強度。
在1M的NaCl中就直至大約20個核苷酸的寡核苷酸探針而言，解鏈溫度的如下估算Tm＝(2℃/A-T鹼基對)+(4℃/G-C鹼基對)注意在6×檸檬酸鈉鹽(SSC)中鈉離子濃度為1M。見Suggs等，Developmental Biology Using Purified Genes 683(Brown and Fox，eds.，1981)。
用作誘餌如NF-κB的核酸可以易於從一個cDNA文庫中分離，所述文庫具有含有例如SEQ ID NO1-8任一所述核酸序列的一部分的PCR引物和雜交探針。在誘餌如NF-κB中所用的核酸或其變體或片段等優選可與SEQ ID NO1-8所示序列的整體或部分在低嚴格條件下雜交，所述條件是雜交緩衝液在42℃，基本上含有1％牛血清白蛋白(BSA)，500mM磷酸鈉(NaPO4)，1mM EDTA和7％的SDS，洗滌緩衝液是在50℃，基本含有2×SSC(600mM NaCl，60mM檸檬酸鈉)及0.1％SDS；更優選在如下低嚴格條件下雜交即雜交緩衝液在50℃，基本上含有1％牛血清白蛋白(BSA)，500mM磷酸鈉(NaPO4)，15％甲醯胺，1mM EDTA和7％的SDS，洗滌緩衝液是在50℃，基本含有1×SSC(300mM NaCl，30mM檸檬酸鈉)及1％SDS；最優選在如下的低嚴格條件下雜交即雜交緩衝液在50℃，基本上含有1％牛血清白蛋白(BSA)，200mM磷酸鈉(NaPO4)，15％甲醯胺，1mM EDTA和7％的SDS，洗滌緩衝液基本含有0.5×SSC(150mMNaCl，15mM鈉。
基因的「同源性」是指兩或多個基因序列之間的相同性程度。因此，某兩個基因之間的同源性越高，則其序列之間的相同性或相似性越高。兩個基因之間是否具有同源性可以通過直接對比兩個序列或者通過在嚴格條件下雜交進行研究。當直接對比兩個基因序列時，如果基因的DNA序列有至少50％，優選至少70％，更優選至少80％、90％、95％、96％、97％、98％或99％是相同的，則所述基因具有同源性。
本文所用核酸分子的「片段」是指一種多核苷酸，其長度比參比核酸分子的全長短，但足以至少用作本發明中的一個因子。因此，在此所述片段是指一種多核苷酸，其序列長度是參比多核苷酸全長的1至n-1(參比多核苷酸的長度是n)。根據目的可以適當地改變片段的長度。例如，在多核苷酸的情況中，所述片段的長度低限為5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、40、50、75、100和更多個核苷酸。由在此未特別說明的整數表示的長度(例如11等)可以是低限。
「可雜交的多核苷酸」是指一種多核苷酸，其可以與其它多核苷酸在上述雜交條件下雜交。特別地，所述可雜交的多核苷酸包括至少一種多核苷酸，其與SEQ ID NO1所示鹼基序列具有至少60％同源性，優選具有至少80％同源性的多核苷酸，更優選具有至少95％同源性的多核苷酸。在此所述的同源性是使用例如應用Altschul等(分J.Mol.Biol.215，403-410(1990))所揭示的算法的搜索程序BLAST的分值表示的。因此，除非特別說明，胺基酸和鹼基序列的相似性、相同性和同源性對比是利用FASTA，使用默認參數計算的，FASTA是進行序列分析的一個工具。
本文所用基因(例如核酸序列、胺基酸序列等)的「相似性」是指當在上述同源性中保守取代被認為是陽性的(相同)時，兩或多個序列之間的相同性的比例。因此，同源性和相似性在存在保守取代的情況中彼此不同。如果保守取代不存在，則同源性和相似性具有一樣的值。
本文所用「序列(胺基酸、核苷酸等)的相同性、同源性或相似性百分比」是通過在一個對比窗對比兩個最佳排列的序列而確定的，其中對比窗中的多核苷酸或多肽序列的部分與用於兩序列間進行最佳對比的參比序列相比可包含添加或缺失(例如缺口)(所述參比序列不包含添加或缺失(如果另一個序列包含添加，則可發生缺口))。所述百分比是通過確定在這兩個序列中出現相同的核酸鹼基或胺基酸殘基的位置數，將匹配的位置數除以參比序列中位置總數(即窗口大小)，並將結果乘以100而計算的，以產生序列相同性百分比。當在一個搜索中使用時，同源性是通過一種合適的技術估值的，所述技術選自本領域熟知的多種序列對比算法和程序。這種算法和程序包括例如但非限於TBLASTN、BLASTP、FASTA、TFASTA和CLUSTALW(Pearson and Lipman，1988，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85(8)2444-2448，Altschul et al.，1990，J.Mol.Biol.215(3)403-410，Thompson et al.，1994，Nucleic Acids Res.22(2)4673-4680，Higginset al.，1996，Methods Enzymol.266383-402，Altschul et al.，1990，J.Mol.Biol.215(3)403-410，Altschul et al.，1993，Nature Genetics 3266-272)。
本文所用術語「相應」基因或序列(例如一種誘餌、啟動子序列等)是指一種基因或序列，其具有或預期具有與在一個物種中進行對比參考的一種預定基因或序列相似的功能。當多數這種基因或序列呈現具有這種功能時，這種相應的基因或序列是指具有相同進化起源的基因或序列。因此，相應於給定基因或序列的一個基因可以是給定基因或序列的直向同源基因(ortholog)。因此，相應於小鼠NF-κB基因等的基因可以在其它動物(人、大鼠、豬、牛等)中發現。這種相應的基因可以通過本領域熟知的技術鑑別。因此，例如在一種給定動物中的相應基因可以通過使用一種參比基因(例如小鼠NF-κB基因等)的序列作為查詢序列，搜索該動物(例如人、大鼠)的序列資料庫而發現。如此本發明包括相應於本發明的特異序列(例如SEQ IDNO1-8任一的序列)的序列。
術語「衍生的寡核苷酸」是指一種寡核苷酸，包括核苷酸的衍生物或者核苷酸之間具有非常規鍵的衍生物。特別地，這種寡核苷酸例如包括其中磷酸二酯鍵被轉變為硫代磷酸酯(phosphothioate)鍵的一種衍生的寡核苷酸，其中磷酸二酯鍵被轉變為N3』-P5』氨基磷酸酯鍵的一種衍生的寡核苷酸，其中核糖和磷酸二酯鍵被轉變為肽-核酸鍵的一種衍生的寡核苷酸，其中尿嘧啶被C-5丙炔基尿嘧啶取代的一種衍生的寡核苷酸，其中尿嘧啶被C-5噻唑尿嘧啶取代的一種衍生的寡核苷酸，其中胞嘧啶被C-5丙炔基胞嘧啶取代的一種衍生的寡核苷酸，其中胞嘧啶被吩噁嗪修飾的胞嘧啶取代的一種衍生的寡核苷酸，其中核糖被2』-O-丙炔基核糖取代的一種衍生的寡核苷酸，其中核糖被2』-甲氧基乙氧基核糖取代的一種衍生的寡核苷酸等。
本文所用「生物活性」是指某一因子(例如多核苷酸或多肽)在生物體內所具有的活性，包括呈現多種功能的活性。例如，當某一因子是轉錄因子時，其生物活性包括調節轉錄活性的活性。當某一因子是一種酶時，其生物活性包括酶活性。再例如，當某因子是配體時，其生物活性包括與配體相應的受體的結合。在本發明的一個實施方案中，其生物活性包括結合至少一種轉錄因子的活性。
本文所用「核苷酸」是指任何天然的核苷酸和非天然的核苷酸。「衍生的核苷酸」是指一種核苷酸，其與天然的核苷酸不同但與其起源的天然的核苷酸具有相似的功能。這種衍生的核苷酸是本領域熟知的。
本文所用「變體」是指與原始的物質部分不同的一種物質，如多核苷酸等。這種變體例如包括一種取代變體、添加變體、缺失變體、截短變體、等位基因變體等。等位基因是指位於與相應的基因相同的基因座的一種遺傳變體，其中兩個基因彼此不同。因此，「等位基因變體」是指與某基因具有等位基因關係的一種變體。核酸分子的「同源物」是指一種核酸分子，其具有的核苷酸序列與參比核酸分子的核苷酸序列具有同源性。代表性地，「同源物」是指一種多核苷酸，其在嚴格條件下與參比核酸分子雜交。在本發明的核酸分子的情況中，「同源物」是指一種核酸分子，其具有的核酸序列與本發明的誘餌的核酸序列具有同源性，其生物學功能與本發明的啟動子的功能相同或相似。因此，「同源物」和「變體」的概念部分重疊。因此，同源物與某一物種中某一基因具有胺基酸或核苷酸同源性(優選至少60％同源性、更優選至少80％、至少85％、至少90％及至少95％同源性)。從本發明的描述中將明了獲得這種同源物的方法。例如，本發明的誘餌的同源物可以是在相同物種中的一個同源基因或者在其它物種中的相應基因。因此，本發明的誘餌可包括所述誘餌的所有同源物。
本文所用術語「分離的」生物製劑(例如核酸、蛋白質等)是指從天然的生物體的細胞中的其它生物製劑中基本上分離或純化的一種生物學製劑(例如在核酸的情況中，除了核酸之外的製劑及具有除了指定的核酸之外的核酸序列的核酸；在蛋白質的情況中，除了蛋白質之外的製劑及具有除了指定蛋白質之外胺基酸序列的蛋白質)。「分離的」核酸和蛋白質包括通過標準純化方法純化的核酸和蛋白質。分離的核酸和蛋白質還包括化學合成的核酸和蛋白質。因此，一個實施方案中，本發明的核酸可以是這種分離的核酸。
一方面，本發明提供了治療和預防炎症疾病或障礙、衍生於這種疾病或障礙的障礙以及關節炎的一種藥物組合物；本發明還提供了使用這種組合物治療和預防炎症疾病或障礙、衍生於這種疾病或障礙的障礙以及關節炎的一種方法。在一個優選的實施方案中，所述組合物包括至少一種NF-κB誘餌和一種藥物可接受的載體。
在一個實施方案中，本發明感興趣的疾病可以是選自如下一組中的至少一種疾病類風溼性關節炎、骨關節炎、肩關節周炎、頸臂症候群和繼發性關節炎。
在另一個實施方案中，上述藥物可接受的載體可以是藥物可接受的任何載體，優選是脂質體。更優選地，本發明的藥物組合物是以HVJ脂質體形式提供的。
本發明中使用的NF-κB誘餌可包含序列GGATTTCCC。更優選地，所述NF-κB誘餌可包含一個序列CCTTGAAGGGATTTCCCTCC(SEQ ID NO1)。在另一個實施方案中，所述NF-κB誘餌可以是進一步修飾的形式。
在一個優選的實施方案中，本發明的組合物和方法可以使用一種直接給藥途徑應用於疾病部位。
優選地，這種基因由於其在炎症部位和/或關節中表達而可以呈現一種作用。所述基因例如包括NF-κB、STAT-1、GATA-3、STAT-6、AP-1、E2F、Ets和CRE的誘餌。優選的誘餌例如包括5』-CCTTGAAGGGATTTCCCTCC-3』(SEQ ID NO1)(NF-κB誘餌)，5』-GATCTAGGGATTTCCGGGAAATGAAGCT-3』(SEQ ID NO2)(STAT-1誘餌)，5』-AGCTTGAGATAGAGCT-3』(SEQ ID NO3)(GATA-3誘餌)，5』-GATCAAGACCTTTTCCCAAGAAATCTAT-3』(SEQ ID NO4)(STAT-6誘餌)，5』-AGCTTGTGAGTCAGAAGCT-3』(SEQ ID NO5)(AP-1誘餌)，及5』-AATTCACCGGAAGTATTCGA-3』(SEQ ID NO6)(Ets誘餌)，5』-TGACGTCA-3』(CRE誘餌)，或者其互補寡核苷酸，其變體，或含有它們的化合物。在一個優選的實施方案中，所述藥物可接受的載體可以是脂質體。
在本發明中，論證了用與轉錄因子NF-κB結合的順式元件誘餌的體內轉染用於改善炎症如類風溼性關節炎。
在常規的炎症治療中，通常使用類固醇或非類固醇抗炎劑。然而，類固醇的應用導致整體的不良作用，腎上腺皮質萎縮，並導致退縮症候群、腎衰竭、糖尿病、滿月臉，及類固醇性挫傷、類固醇性溢血、皮膚萎縮、多毛、感染性疾病等局部不良作用。
另外，NF-κB的靶基因包括凋亡相關基因(包括TP53(見Wu H，Lozano G.，J Biol Chem.1994，26920067-74)和c-myc(LaRosa FA，Pierce JW，Sonenshein GE.，Mol Cell Biol.1994，141039-44))。因此，根據本發明的使用針對NF-κB結合位點的誘餌的基因治療抑制了涉及炎症應答及關節損害的基因表達(包括凋亡)。
誘餌治療有許多益處，包括瞬時作用、低花費及很少或無併發症。使用裸E2F誘餌的基因治療已經在臨床嘗試預防靜脈移植(vein-graft)疾病(見Mann MJ.Whittemore AD，Donaldson MC，Belkin M，Conte MS，Polak JF et al.，Lancet.19993541493-8)。
如上所述，應注意誘餌在炎症疾病和關節炎障礙領域中的應用在如下描述中示出。
在後文中，本發明通過實施例進行描述，如下實施例只是為了例證本發明。因此，本發明的範圍限於權利要求所述而非實施例所述。
實施例在如下實施例中，舉例說明了使用的典型材料和方法。
實施例1NF-κB誘餌對猿膠原性關節炎模型的作用這個實施例測試了NF-κB誘餌在猿膠原性關節炎模型中的作用。通過將NF-κB給予關節內部位測試了對猿II型膠原性關節炎模型的作用。另外，將其效力和毒性與關節內給予類固醇加以對比。在本測試中不應用GLP。
使用的測試物質如下1)測試物質NF-κB誘餌寡核苷酸(後文也稱作NF-κB誘餌)(AnGes MG)，(100mg/小瓶，保持在-20℃冷凍)。所用的ODN的序列為NF-κB誘餌ODN，5』-CCTTGAAGGGATTTCCCTCC-3』(SEQID NO1)。
2)陽性對照乙酸倍他米松，倍他米松磷酸鈉(Rinderon懸浮液，後文稱作Rinderon)(SHIONOGI)(組成乙酸倍他米松2mg，倍他米松磷酸鈉0.66mg/0.5mL/安瓿)。
3)敏化物質牛II型膠原(Collagen Gijutsu Kenshukai＝CollagenTechnology Instutute)(-20℃，避光保存)。
4)佐劑Freund完全佐劑(Becton Dickinson and Company)(避光保存)。
5)培養基-1鹽水(Otsuka Seiyaku Kojo)(在室溫保存)。
6)培養基-25mmol/L乙酸鹽溶液(由Wako Pure Chemical生產＝乙酸鹽，Otsuka Seiyaku Kojo＝鹽水)(冷凍保存)。
測試物質及陽性對照物質的製備和給予測試物質和陽性對照物質的製備和給予如下進行製備方法NF-κB誘餌將其加入測試物質小瓶中，加入鹽水溶解稀釋為6、20和60mg/mL以進行應用，並棄去剩餘的溶液。
Rinderon安瓿中的陽性對照物質用鹽水稀釋。製備0.2mg/mL的乙酸倍他米松。一個安瓿(0.5mL)稀釋為10mL(20被稀釋)並棄去剩餘的溶液。
作為測試動物，將40隻猿((恆河猴，專業繁殖飼養(purposebred))，體重2-3.5kg(在馴化起始時)，年齡2-3年，來源於中國(培育地為中國廣西南寧Yongwu路14號，中國廣西靈長類動物中心(Guangxi Primate Center of China)，郵編530001)，進口方中國國家科學設備及材料進出口公司)馴化，並將其中30隻進行給藥處理。通常，將猿認為是與人相似的測試動物。其關節形式與人相似，而且其大小相似以及易於評估。因此，使用猿作為模型。就動物應用的倫理標準而言，本發明實施例是根據Shin-Nihon kagaku的動物實驗倫理標準的許可進行的。
如下進行培育培育溫度設定為26±2℃，培育溼度設定為50±10％。換氣周期設定為15次/小時，光照使用人工光照設定為12小時/天(6:00a.m.至6:00p.m.)。使用的培育籠是由不鏽鋼製成的，而且符合USDA許可，圈養數為1隻猿/籠。使用的飼料是固體飼料(Teklad Global經檢驗合格的25％蛋白質靈長類飼料，Harlan SpragueDawley Inc.)，每天在3:00pm給予一次大約108g(大約12g×9)，在第二天9:00am給予一次，收集剩餘的飼料。在進行血液測試、血液生物化學測試、給藥及屍檢前一天，在大約5:00pm收集剩餘的飼料。
飲用水使用自動飲水供應設備(Okasaki Sangyo KabushikiKaisha)隨意給予，水質符合Water Works Law的標準。
每日用水對室內進行清潔，並用水清潔籠內的下水道。
動物的鑑別如下個體鑑別在動物胸部紋身編號(SpauldingSpecial Electric Tattoo Marker，SpauldingRogers Mfg.，Inc.)。為對猿進行鑑別，使用彩色卡片(具有測試編號、組編號、給藥量、性別和動物編號)。
馴化選擇40隻經檢疫的雌性猿稱重。馴化階段設定為在開始給藥前3周，其間一天觀測一次一般狀況，並在開始給藥之前7天每天進行一次食物攝取測定，在分組時及馴化結束時對每隻動物進行稱重。進行一次血液學和血液生物化學測試。詳細的方法見「17.觀測及測試章節」。
動物分組對從開始馴化及直至開始敏化的前期觀測無異常的動物進行分組，以便每組在開始敏化之前一天具有大約相同的平均體重(每組有5隻雄性動物，共30隻)。未用於該測試的動物作為剩餘動物剔除出該測試，並保留作為後備培育動物。
將猿用氯胺酮(鹽酸氯胺酮，大約10mg/kg，Sigma Chemical Co.，肌內注射，任選額外的給藥途徑)，然後在踝關節、膝關節和腕(intracarpus)關節給藥(左側、右側，共6處)。給藥量為0.5mL/關節(踝關節和腕關節)及1.0mg/關節(膝關節)。給藥周期如下1-3組和6組6次(兩周一次)；4組5次(兩周一次，在第四周期後4周(第70天)進行第5次給藥)；5組3次(四周一次，在第二次給藥後大約6周(第72天)進行第3次給藥)。選擇猿的給藥周期以預測臨床應用於人體。給藥時間是10:00到中午。
測試方法1)膠原性關節炎模型的製備使用30隻雌性恆河猴。將24mg/小瓶牛II型膠原加入6mL的5mmol/L乙酸鹽水中，在冰箱中(4℃)攪動24小時使之溶解。在將等量的該溶液和Freund’s完全佐劑混和後，通過充分懸浮產生乳狀液。使用一次性注射器和針頭為每隻猿經皮內注射於背部，給予2mL該乳狀液(II型膠原，4mg)以進行敏化(初級敏化)。在初級敏化一周後，在背部經皮內注射背部給予相同成分的乳狀液以強化免疫。在氯胺酮e(鹽酸氯胺酮e，大約10mg/kg，Sigma Chemical Co.，肌內注射，任選額外的給藥途徑，記錄給藥量)麻醉下給予該乳狀液。
測試組構成使用對照組1；測試物質4組；及陽性對照物質1組(共6組)進行如下實驗。方案示於圖3。
表1

*給予膝關節雙倍量**與測試物質相似的方式給予鹽水***4組第5次給藥是在第4周期後4周(第70天)進行，5組的第3次給藥是在第2次給藥後大約6周(第72天)進行。
在猿II型膠原關節炎模型的測試中，在兩周間隔給予10mg/關節NFκB誘餌的有效比為3/4。觀測到混雜的誘餌的有效比為1/4。因此，考慮到在臨床中的安全性，最大量設定為30mg/關節，隨後量設定為10和3mg/關節，總比值(common ratio)為3。另外，由於NFκB誘餌當被摻入細胞核時示出長期的效力，因此還設立四周給予一次30mg量的實驗組。由於類固醇(Rinderon)的劑量為2mg/關節，因此猿的劑量根據體重設定為1/20。
觀測和測試參數如下。起始給藥時間設定為在第0天給藥，開始給藥的那周設定為給藥第1周。
1)一般條件在給藥期間進行觀測一天一次以上(早晨和中午)，在屍檢期間針對所有樣例一天一次。關節的腫脹用4個階段評估(無異常、輕度腫脹、中度腫脹及高度腫脹)，記錄結果。
2)飼料量在開始給藥之前7天記錄飼料數及剩餘量，針對所有樣例計算飼料量(g)，並計算每周平均量作為該周每日平均量。
3)體重用電子稱(HP-40K，A and D，Inc.)在敏化前一天(分組當天)、給藥前一天(最後馴化當天)、在開始給藥後一周及屍檢時針對所有樣例測定體重。
4)血液學測試測試頻率1-3組和6組在馴化期間、在(給藥前)第0、14、28、42、56和70天及屍檢時測試一次。
4和5組在馴化期間、第0、14、28、42、56、70天(給藥前)及第84天測試一次。
實例數每組中所有樣例血液取樣方法使用注射器從股靜脈中取血樣。使用經EDTA-2K抗凝處理的全血。
測試項如下表。
表2

*總血液學測試設備(ADVIA120，BAYER DIAGNOSTICSMANUFACTURINGLTD)5)血液生物化學測試測試頻率1-3組和6組在馴化期間、在第0、14、28、42、56和70天(給藥前)及屍檢時測試一次。
4和5組在馴化期間、第0、14、28、42、56、70天(給藥前)及第84天測試一次。
實例數每組中所有樣例血液取樣方法使用注射器從股靜脈放血大約1.2mL血液。在將該樣品在室溫靜置20-40分鐘後，在3000rpm離心15分鐘，使用所得的血清。
測試項測定CRP(濁度免疫學分析(TIA)，見Clin Chim Acta1977 May 2，76(3)377-88)。
6)X光成像使用可攜式X光機(DOP-82S-120-D型，Hitachi Medico，Inc.)在如下日期在氯胺酮麻醉下(使用大約10mg/kg的鹽酸氯胺酮，SigmaChemical Co.，肌內注射，任選額外的注射途徑，記錄給藥量)對踝關節，膝關節和腕關節(均為左右側)進行放射顯影分析在1-3組和6組的所有樣例中(初級敏化之前)，在第0、14、28、42、56和70天(給藥前)及在屍檢前一天或當天；在4-5組的所有樣例中，在第0、14、28、42和70天(給藥前)及在屍檢前一天和當天。對腕關節從前面照相(同時右側和左側)，對膝關節從前面(同時右側和左側)及側面(單側橫向，從內側照射，膝彎曲60°)照相，對踝關節從側面(單側橫向，從內側照射)照相以獲得照片。照射距離設定基本相同。對X光照片進行標記。
7)骨體積測定就所有樣例而言，在開始給藥之前及在解剖時使用雙能量X光吸收分析儀(double energy X-ray absorption analyzer)(DPX-α，LUNAR)測定股骨的遠端和脛骨近端(均左右雙側)的骨體積。
8)血液抗膠原抗體值的測定血液取樣頻率1-3組和6組 在初級敏化之前、第0、14、28、42、56和70天(給藥前)及屍檢，4-5組 在初級敏化之前、第0、14、28、42和70天(給藥前)及第84天。
實例數 每組所有的樣例放血體積大約1mL(大約0.4mL血清)。在屍檢時及給藥第84天時進一步取大約7.5mL(大約3mL血清)。
血液取樣方法使用注射器從股靜脈取血樣。將血液在室溫放置20-40分鐘，然後在3000rpm離心15分鐘獲得血清。
將所得血清在-20℃冷凍保存直至使用(在屍檢時及給藥第84天額外取血清(大約3mL)，在-80℃保存)。將該血清在乾冰存在下送至測試請求人(AnGesMG，Inc.)。
測定方法將牛II型膠原包被於一個微滴板(microplate)上形成固相。為測定抗體值，獲得的血清用作初級抗體，抗IgG(Fc)、過氧化物酶標記的山羊抗體和猿IgM(Fc)過氧化物酶標記的山羊抗體用作二級抗體以進行ELISA測定。在產生顏色之後使用平板讀數器(SEM3400，Iwaki Glass，Inc.)進行測定。
9)關節內內窺鏡檢查測試頻率給藥第4、8和12周實例數給藥第4周每個未處理組、對照組、NF-κB 30mg組(兩周間隔)及給予類固醇組(動物編號4，19和29)均一個。
給藥第8和12周未處理組一個、兩個對照組(動物編號2和4)、NF-κB 10mg組一個(兩周間隔)、NF-κB 30mg組一個(兩周間隔)及給予類固醇組(動物編號13，19和29)一個。
測試方法在吸入麻醉或鹽酸美託咪定麻醉下將關節內內窺鏡插入膝關節。
10)屍檢對死亡的樣品在稱重後迅速屍檢，並對腕關節、膝關節和踝關節(左右側)進行X光照相。另外，將針對關節觀測和組織病理學檢驗而貯存的器官貯存在10％中性緩衝的福馬林中。針對剩留的器官和組織，進行總體觀測。根據負責屍檢的人的判斷，通過總體觀測觀測到其中有改變的組織和器官貯存在福馬林中。根據通過前肢頭(forearmcephalic)靜脈給藥在觀測的最後時間給予活樣品0.4mL/kg戊巴比妥水溶液(64.8mg/mL)(Tokyo Kasei Kogyo Co.Ltd.)。在麻醉下通過放血進行安樂死之後，將動物通過灌注10％中性緩衝的福馬林而固定，以與針對死亡樣品同樣的方式進行觀測。當觀測到異常時，對其中出現認為是由於給予測試物質所致的變化的動物進行照相。
11)組織病理學檢驗實例數所有樣品標本製備通過灌注而固定後獲得器官(指貯存的器官)。切下腕關節、膝關節和踝關節(左右側)(關節滑膜和關節軟骨)，脫鈣，在石蠟中包埋，並切成薄片，這些由Shin Nippon BiochemicalLaboratories，Ltd。將每種樣品的一個進行H.E.染色的樣品和兩個未染色的樣品送至檢測儀。當需要檢驗其中通過總體觀測觀測到改變的器官和組織時，根據本領域熟知的及常規使用的技術製備H.E.染色的樣品。
貯存的器官心、肺*、支氣管、肝、膽囊、腎*、腎上腺*、腕關節*、膝關節*、踝關節*及異常部位。
*是指兩側均貯存的器官。
樣本的貯存將上述器官和組織(大器官的一部分)在真空後貯存。
結果本實施例的結果示於圖1。在圖1中，通過X光照片示出了在猿膠原關節炎模型中由本發明的誘餌對關節的改變。觀測到未處理及混雜誘餌無作用，而接受本發明誘餌處理的模型觀測到具有顯著改善，如抑制滑膜炎症改變、關節腫脹、關節軟骨和關節的骨破折。
實施例2NF-κB對大鼠骨關節炎模型的作用這個實施例闡述了NF-κB誘餌組合透明質酸(hyarulonic acid)對大鼠骨關節炎模型的作用。將NF-κB與透明質酸的組合藥物經關節內給予大鼠以檢測其對大鼠骨關節炎模型的作用。
在切下大鼠的交叉韌帶後，經關節內給予用FITC標記的NF-κB誘餌以在一和兩個月後研究誘餌轉移進軟骨中的特性。本測試作為非GLP測試進行。
測試物質如下1)測試物質1NF-κB誘餌寡核苷酸(後文稱作NF-κB誘餌)(AnGes MG)(100mg/小瓶，在-20℃冷凍保存)。
2)測試物質2低分子量的透明質酸(ARTS(商標)；SEIKAGAKUCORPORATION，在-20℃貯存)。
3)測試物質3HVJ-E導入的NF-κB(AnGes MG)(0.1mg(NF-κB)，2000 HAU(HVJ-E))，在-20℃貯存。如參考文獻(Morishita R，Sugimoto T，Aoki M，Kida I，Tomita N，Moriguchi Aet al.，Nat Med.1997，3894-9)所述製備HVJ病毒-脂質體複合物。簡而言之，將磷脂醯絲氨酸(PS)、磷脂醯膽鹼(PC)和膽固醇(Chol)以1∶4.8∶2的重量比混和。將該脂質混合物(10mg)在旋轉蒸發器中通過除去溶劑(四氫呋喃)而沉澱在培養瓶的側壁上。將乾燥的脂質在含有200μg的ODN的200μl的生理鹽水中水合。通過搖動和超聲製備脂質體。將脂質體懸浮液(0.5mL，含有10mg的脂質)與在生理鹽水中失活的HVJ(10000血凝單位)混和，總體積為4mL。將該混合物在4℃溫育5分鐘，然後在30℃輕輕搖動30分鐘。通過密度梯度離心從HVJ脂質體中除去游離的HVJ。收集蔗糖梯度的上層應用。ODN的序列如下NF-κB誘餌ODN為5』-CCTTGAAGGGATTTCCCTCC-3』(SEQ ID NO1)，混雜誘餌ODN為5』-CATGTCGTCACTGCGCTCAT-3』(SEQ ID NO7)，及5』-ATGAGCGCAGTGACGACATG-3』(SEQ ID NO8)。
測試物質的製備與給予製備方法就測試物質1而言，稱重20mg的NF-κB誘餌，在室溫溶解於鹽水中，如果需要則加以稀釋應用。棄去剩餘溶液。
就測試物質2而言，在一個安瓿中(2.5mL)含有25mg透明質酸鈉的溶液中製備誘餌。
就混雜誘餌而言，如NF-κB誘餌同樣製備。
上述製備使用前進行。
對於測試動物，將50隻雄性大鼠(Fischer 334品系)(在測試開始時體重250-300g，12周齡，Japan Charles River Inc.，Hino，Gamo-gun，Shiga)馴化，並將其中43隻動物進行給藥。通常，大鼠廣泛用作實驗動物，而且易於進行膝關節操作及進行藥理學作用評價，因此用作骨關節炎模型。就動物應用倫理標準而言，本發明人根據Osaka大學規定的動物實驗倫理標準的許可進行實驗。
如下進行動物培養。培育溫度設為26±2℃，培育溼度設為50±10％。通風頻率設為15次/小時，人工照明為每天12小時(照明時間為6:00am至6:00pm)。培育籠由不鏽鋼製成，其大小符合USDA標準。圈養動物數設為5隻/籠。所用飼料為固體飼料，動物可自由攝食。
飲用水為由自動供水裝置(Okazaki Sangyo Co.Ltd.)製備的符合Water Works Law規定的水質標準的水。
動物鑑別個體鑑別應用顏料籠鑑別使用籠卡片(描述測試編號、組別、給藥量、動物編號)醫學觀察和馴化從接受醫學觀察的動物中選擇43個雄性大鼠並稱重。操作前1周被確定為馴化期間，在此期間觀察一般狀況。
動物分組在馴化最後的時間隨機選擇在馴化期間未顯示異常的動物(43個雄性動物)。不進行動物分組。未用作檢查的多餘動物實行安樂死。
骨關節炎模型的製備隨機選擇在馴化期間沒有顯示異常的動物(33個)。為動物肌內注射300μl的Ketalar(氯胺酮)和Celactal(甲苯噻嗪)2∶1的水溶液。在這種麻醉下，暴露膝關節並切斷交叉韌帶。未用作檢查的多餘動物實行安樂死。
如下進行給藥。選擇關節內給藥為給藥途徑，這是為了根據臨床給藥途徑而進行。選擇在麻醉下直接注射進大鼠膝關節作為給藥方法。關節內給藥常規用於大鼠的治療。給藥量為0.05mL/關節，給藥頻率設定為每周8次。選擇這一頻率是為了預測人臨床情況。
測試方法劑量和動物數將動物分為3組，創建模型。每輪操作數平均化。測試組構成和動物編號如下所示。給藥計劃如圖4所示。
表3 第一操作組

表4 第二操作組

表5 第三操作組

在II型膠原關節炎猿模型測試中，以兩周間隔給藥NF-κB誘餌10mg/關節，有效率為3/4，同時觀察到給予混雜誘餌的有效率為1/4。由於能關節內給予大鼠的最大劑量為0.05mL，因此給予大鼠關節的以相應於10mg/mL猿有效劑量的劑量設定為0.5mg/關節。另外，以相同量給予混雜誘餌，其DNA序列對於NF-κB誘餌是隨機化的。
將臨床應用的透明質酸與NF-κB誘餌組合給藥，並比較NF-κB誘餌的有效性。所使用的HVJ-E如下製備用Triton滅活HVJ病毒並除去其RNA，然後與NF-κB誘餌10mg/mL混合後而將NF-κB誘餌包括進病毒。
將NF-κB誘餌包括進HVJ-E的劑量為25600HAU(1HAU＝1×106病毒)/mg的NF-κB誘餌，每個關節給予約2000HAU。
以這種方式，計算出給藥量為0.1mg。因此測定包括NF-κB誘餌的HVJ-E。
觀察和檢查項目(給藥日設定為第0天)如下1)一般狀況在給藥前1天、給藥日給藥後立即、之後每日以及屍檢日進行觀察，並記錄存活或死亡樣例。在給藥日，任選地定期進行觀察。
2)體重用電子稱(得自A and D Co.Ltd的EP-41KA或HP-40K)對所有樣例在開始日、給藥日稱重，之後每周稱重1次，在屍檢日也稱重。
3)血液學測試實例數所有樣例取血樣日期屍檢時取血樣方法用注射器取血樣。使用經EDTA-2K進行抗凝血處理的全血。
測試項目如下表6

*多項自動血細胞計數儀(E-4000，Sysmex Co.Ltd.)
**血細胞自動分析儀(MICROX HEG-120A，OMRON)4)血液生化測試樣例數所有樣例取血樣日期屍檢時取血樣方法取血樣後，室溫放置40-60分鐘，之後在3000rpm離心15分鐘以獲得血清備用。
測試項目通過免疫比濁法測定CRP。
5)X光成像在屍檢時使用小動物X光系統(可攜式X光裝置，DOP-82S-120D，Hitachi Medico)對麻醉下對後肢進行X光照相。
6)屍檢死亡實例在稱重後迅速進行屍檢，對腕關節、膝關節和踝關節(左右側)進行X光照相。另外，將欲儲存進行關節觀察和組織病理學檢查的器官儲存在10％中性緩衝的福馬林中。對於其餘的器官和組織進行大致觀察。根據屍檢負責人員的判斷，將由大致觀察而觀察到有變化的組織和器官儲存在福馬林中。存活實例在觀察的最後一日在前臂頭靜脈給予0.4mL/kg戊巴比妥水溶液(64.8mg/mL)(Tokyo Kasei Kogyo Co.Ltd.)。在麻醉下放血安樂死後，以與死亡實例相同的方式觀察動物。
7)組織病理學檢查樣品數從所有實例取後肢膝關節，之後固定、包埋在石蠟中，根據本領域常規方法製備薄切片，進行檢查。
樣本製備和檢查方法將後肢膝關節用10％中性緩衝的福馬林固定。固定後將樣本切片，將樣本包埋於石蠟中並製備薄切片，進行H.E.染色，通過顯微鏡觀察染色情況。如果需要特殊染色，由負責檢查的人員判斷並進行這種染色。
儲存的器官膝關節照相對代表性膝關節進行照相。
(結果)在圖2中，NF-κB誘餌對骨關節炎大鼠模型的效果以關節的切片照片示出，其中顯示了健康供體、膠原衍生關節炎模型以及NF-κB誘餌(10mg、30mg給藥)的效果。10mg誘餌給藥已經有顯著改善，30mg誘餌給藥完全消除了關節炎症。這一效果優於類固醇。另外，類固醇處理伴有其所特有的不利作用，但是當使用本發明誘餌時，未發現這種顯著的不利作用。
儘管本文描述了一些優選的實施方案，但是這些實施方案不應被看作對權利要求書限定的本發明範圍的限制。本領域技術人員在閱讀說明書後能夠了解並且在不偏離本發明的範圍和實質的前提下做出多種其它修飾和等價替換。本文所引用的所有專利、公布的專利申請以及出版物以其全文併入參考。
工業實用性本發明提供了一種使用誘餌而治療或預防炎症性疾病或障礙的藥物組合物。另外，用於本發明治療方法中的組合物的製備、病毒構建體、試劑盒和藥物有充分的工業實用性。本發明被認為具備工業實用性，因為例如製藥工業可以不通過醫生而工業生產本發明的組合物。本發明方法除了純粹的醫生用藥，還可用於臨床試驗，這是商業目的，因此本發明方法具備工業實用性。另外，直接或間接實施本發明治療方法在醫藥業被認為是實用的，因此具備工業實用性。
序列表110安琪士多摩奇 株式會社120治療和預防炎症性疾病的誘餌組合物130AN008PCT150JP2002-1565241512002-5-2916021170PatentIn Ver.2.1210121120212DNA213Artificial Sequence220
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權利要求
1.一種治療和預防炎症性疾病或障礙的藥物組合物，其包含至少一種NF-κB誘餌，及一種藥物可接受的載體。
2.權利要求1的組合物，其中所述疾病或障礙是選自如下一組的至少一種疾病或障礙腎炎、肝炎、關節炎、急性腎衰竭、慢性腎衰竭、動脈硬化、腎小球性腎炎、腎盂腎炎、膀胱炎、前列腺炎、尿道炎、附睪炎、睪丸炎。
3.權利要求1的組合物，其中所述藥物可接受的載體是脂質體。
4.權利要求1的組合物，其中所述NF-κB誘餌包含一個序列GGATTTCCC。
5.權利要求1的組合物，其中所述疾病或障礙是骨關節炎或類風溼性關節炎。
6.權利要求1的組合物，其適於膝關節給藥。
7.權利要求6的組合物，其包含至少10mg所述NF-κB誘餌。
8.權利要求6的組合物，其包含至少30mg所述NF-κB誘餌。
9.一種治療和預防關節疾病或障礙的藥物組合物，其包含至少一種NF-κB誘餌，及一種藥物可接受的載體。
10.權利要求9的組合物，其中所述疾病或障礙是選自如下一組的至少一種疾病或障礙類風溼性關節炎、骨關節炎、肩關節周炎、頸臂症候群和繼發關節炎。
11.權利要求9的組合物，其中所述藥物可接受的載體是脂質體。
12.權利要求9的組合物，其中所述NF-κB誘餌包含一個序列GGATTTCCC。
13.權利要求9的組合物，其中所述疾病或障礙是骨關節炎或類風溼性關節炎。
14.權利要求9的一種組合物，其中所述疾病或障礙是類風溼性關節炎，所述組合物包含至少治療有效量的所述誘餌。
15.權利要求14的組合物，其中所述治療有效量是至少0.01mg/kg體重。
16.權利要求9的組合物，其適於膝關節給藥。
17.權利要求16的組合物，其包含至少10mg所述NF-κB誘餌。
18.權利要求16的組合物，其包含至少30mg所述NF-κB誘餌。
19.一種治療或預防炎症性疾病或障礙的方法，包括給予患者一種組合物，所述組合物包含至少一種NF-κB誘餌，及一種藥物可接受的載體。
20.權利要求19的方法，其中所述疾病或障礙是選自如下一組的至少一種疾病或障礙腎炎、肝炎、關節炎、急性腎衰竭、慢性腎衰竭、動脈硬化、腎小球性腎炎、腎盂腎炎、膀胱炎、前列腺炎、尿道炎、附睪炎、睪丸炎。
21.權利要求19的方法，其中所述藥物可接受的載體是脂質體。
22.權利要求19的方法，其中所述NF-κB誘餌包含一個序列GGATTTCCC。
23.權利要求19的方法，其中所述疾病或障礙是骨關節炎或類風溼性關節炎。
24.權利要求19的方法，其中所述組合物適於膝關節給藥。
25.權利要求24的方法，其中所述組合物包含至少10mg的NF-κB誘餌。
26.權利要求24的方法，其中所述組合物包含至少30mg的NF-κB誘餌。
27.一種治療和預防關節疾病或障礙的方法，包括給予患者一種組合物，所述組合物包含至少一種NF-κB誘餌，及一種藥物可接受的載體。
28.權利要求27的方法，其中所述疾病或障礙是選自如下一組的至少一種疾病或障礙類風溼性關節炎、骨關節炎、肩關節周炎、頸臂症候群和繼發關節炎。
29.權利要求27的方法，其中所述藥物可接受的載體是脂質體。
30.權利要求27的方法，其中所述NF-κB誘餌包含一個序列GGATTTCCC。
31.權利要求27的方法，其中所述疾病或障礙是骨關節炎或類風溼性關節炎。
32.權利要求27的方法，其中所述疾病或障礙是類風溼性關節炎，所述誘餌的量是至少治療有效量。
33.權利要求27的方法，其中所述治療有效量是至少0.01mg/kg體重。
34.權利要求27的方法，其中所述組合物適於膝關節給藥。
35.權利要求34的方法，其中所述組合物包含至少10mg的NF-κB誘餌。
36.權利要求34的方法，其中所述組合物包含至少30mg的NF-κB誘餌。
37.至少一種NF-κB誘餌在生產治療和預防炎症性疾病或障礙的藥物中的應用。
38.至少一種NF-κB誘餌在生產治療和預防關節疾病或障礙的藥物中的應用。
全文摘要
本發明目的是有效治療炎症性疾病而不引起副作用。這個目的可以通過提供一種治療和預防炎症性疾病和障礙和由所述疾病和障礙引起的障礙的藥物組合物實現，所述組合物含有至少一種NF－κB誘餌或類似的轉錄因子及一種藥物可接受的載體；本發明還提供了治療和預防的方法。
文檔編號A61P19/02GK1671424SQ0381816
公開日2005年9月21日 申請日期2003年5月20日 優先權日2002年5月29日
發明者富田哲也, 吉川秀樹, 森下竜一 申請人:安琪士多摩奇株式會社