預防和治療疾病的免疫原性組合物及其製備方法

2023-12-08 18:45:36 2

專利名稱：預防和治療疾病的免疫原性組合物及其製備方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，特別是涉及一種預防和治療疾病的免疫原性組合物及其製備方法，另外還涉及該預防和治療疾病的免疫原性組合物的用途。
背景技術：
目前針對於惡性腫瘤、傳染性疾病、自身免疫病、過敏性疾病、器官移植排斥等疾病的治療尚無特效藥物，多應用抗癌藥物、抗病毒藥物、免疫抑制劑等對上述疾病進行對症治療，在臨床使用過程中，上述藥物常產生嚴重的毒副作用以及過敏反應，並很容易產生耐藥性，給臨床有效治療上述疾病帶來了一定的困難。近年來，對上述疾病治療藥物的研究重點逐漸轉移到生物技術藥物領域。
特異性抗體的製備對相關疾病的診斷、治療和預防具有重要意義，因而受到國內外生物醫學界的廣泛關注，已開展了大量的工作並取得了較大的進展。在現有技術中多採用單克隆抗體應用於疾病的診斷和生物治療，其中單克隆抗體的製備方法一般包括獲取疾病相關抗原、免疫小鼠和融合雜交瘤三個步驟，亦即a)首先利用生化和免疫化學的方法獲取攜帶有疾病相關信息的抗原，b)然後將該疾病相關抗原多次重複注射入小鼠體內，待小鼠發生特異性免疫反應一定時間後，取出其脾臟並分離出帶有疾病相關抗原信息的致敏淋巴細胞，再將該致敏淋巴細胞與小鼠骨髓瘤細胞融合成雜交瘤細胞，再篩選出針對於疾病相關抗原的陽性雜交瘤細胞進行體外擴增或接種於小鼠腹腔內，即可從培養上清液或小鼠腹水中獲得所需的單克隆抗體。
單克隆抗體作為治療劑的研究也於近年獲得重要進展。單抗藥物(monoclonal antibody agents)可應用於治療腫瘤、病毒性感染、心血管病以及其它疾患，尤其是用於傳染性疾病的治療，已顯示出良好的應用前景。
抗體藥物一般包括兩類，一是抗病原體單克隆抗體(簡稱單抗)或多克隆抗體(簡稱多抗)；二是抗病原體單抗或多抗偶聯物，或稱免疫偶聯物(immunoconjugate)。免疫偶聯物分子由單抗或多抗與「彈頭」藥物兩部分構成，故稱為導向藥物，又稱為生物飛彈或「魔彈」(magic bullets)，與之相對應的治療方法稱為導向治療。單抗或多抗所針對的靶標通常為病原體表面的相關抗原或特定的受體。用作「彈頭」的物質主要有三類，即放射性核素、藥物和毒素，其與單抗或多抗連接分別構成放射免疫偶聯物、化學免疫偶聯物和免疫毒素。自80年代以來，對抗病原體尤其是抗腫瘤單抗藥物進行了大量研究，特別是自1997年以來，Rituxan、Herceptin在美國相繼獲批准用於臨床腫瘤治療，單抗藥物的研究與開發有了新的發展勢頭，成為生物技術藥物的新熱點(甄永蘇，單克隆抗體藥物治療腫瘤的研究現狀與展望，中國醫學科學院學報，2000，229-12)。
儘管單抗藥物的臨床研究結果已為其應用於治療腫瘤展示出良好的前景，但仍有許多問題需要進一步研究解決(Nguyen DT，Amess JA，Doughty H，et al.IDEC-C2B8 anti-CD20(rituxmab)immunotherapy in patients with low-grade non-Hodgkin′s lymphoma and lymphoproli ferative disordersevaluation of response on 48 patients.Eur J Haematol，1999，6276-82)。單抗藥物存在的問題主要涉及免疫學和藥理學兩方面。免疫學方面的問題關鍵是人抗鼠Ig抗體(HAMA)反應，因為多年來用於臨床研究的單抗藥物多數使用小鼠單抗製備，往往導致HAMA反應。此外，病原體在抗原性方面的異質性，病原體的抗原性調變等也能影響單抗藥物的療效。藥理學方面的問題主要是到達病原體的藥量不足。單抗藥物在體內運送過程中受多種因素影響。由於它是異體蛋白，會被網狀內皮系統攝取，有相當數量將積聚於肝、脾和骨髓；再者就是機體對該異體蛋白產生抗體而降低其效力。單抗藥物是大分子物質，通過毛細血管內皮層以及穿透病變部位均受到限制。(甄永蘇，單克隆抗體藥物治療腫瘤的研究現狀與展望，中國醫學科學院學報，2000，229-12)。
疾病的免疫治療是利用病原體免疫原進行主動免疫來激發、增強機體對病原體的主動特異性免疫反應。目前所研究的病原體疫苗主要是基因工程疫苗、肽疫苗、核酸疫苗、抗獨特型抗體疫苗。其中a)病原體基因工程疫苗是通過基因重組技術，將目的基因導入受體細胞而製備的疫苗。b)肽疫苗是基於在免疫反應中抗原在胞漿內降解為短肽，最後形成肽-MHC-TCR複合體最終激發細胞毒性T淋巴細胞(CTL)反應。c)核酸疫苗是由編碼能引起保護性免疫反應的抗原基因片段和載體構建而成的，包括DNA疫苗和RNA疫苗，目前研究較多的為DNA疫苗。核酸疫苗能夠同時刺激機體產生體液免疫和細胞免疫反應，誘導許多亞單位疫苗不能誘導的CTL效應。d)抗獨特型抗體疫苗(Ab2疫苗)是根據抗獨特型抗體具有模擬抗原及免疫調節的雙重作用，同時能克服機體免疫抑制，打破免疫耐受故能代替病原體抗原誘發特異性主動免疫反應(Bhattacharya CM，Mukerjee S，biddle W，et al.Murine monoclonalanti-idiotype antibldy as a potential netword antigen for human carcinoembryonic antigen.J Immumol，1990，1452758.)。
在上述病原體疫苗免疫治療方法中，由於病原體抗原的抗原性強弱不同，且病原體宿主經常處於免疫抑制狀態，難以激發有效的抗病原體反應。儘管抗獨特型抗體的研究已取得許多進展，但事物總是兩方面的。Ab2疫苗應用存在許多困難，因為抗獨特型抗體β(Ab2β)雖能模擬小分子多肽抗原，卻難以精確反映大分子蛋白質抗原的決定簇，尤其是Ab2β單抗。再者由於病原體抗原極其複雜，常發生調變等，製備廣譜的病原體特異性獨特型疫苗難度很大。更重要的是目前使用的Ab2β主要來自鼠雜交瘤細胞，為異種蛋白，能激發人免疫系統產生人抗鼠Ig抗體(HAMA)，發生中和反應並產生毒性免疫複合物，而降低療效，嚴重時可引起血清病反應。
禽類尤其是雞在系統發育上與哺乳動物有很大差異，雞的免疫球蛋白與哺乳動物免疫球蛋白在免疫學特性上也有很大不同。雞的免疫系統能識別更多的免疫反應位點和更多的抗原決定簇，因此雞免疫系統對哺乳動物的蛋白或生物分子能產生具有更高效價和親和力的特異性抗體。雞免疫系統針對於外源性蛋白所產生的IgY不僅具有更高的免疫特異性，更重要的是這種特異性IgY主要儲存在雞蛋黃中，因此可利用下蛋母雞作為免疫反應器來大量生產具有重要臨床應用價值的抗體藥物。
眾所周知雞蛋作為人類的常用食品和化妝品原料，無論內服和外用均對人體無任何生物毒性和不良作用。因此，利用禽類作為免疫反應器來大量生產抗體藥物，並應用於疾病的診斷和免疫治療，將具有極廣闊的應用前景。以疾病特異性蛋黃抗體IgY為原料製備的免疫藥物和抗獨特型抗體疫苗(Ab2疫苗)可以很好地解決上述單抗偶聯物或上述病原體疫苗所存在的HAMA反應和異質性問題。
授權中國專利申請號93112409.3公開了「一種新型免疫原性複合物製劑及製備方法」，本發明由抗原與抗體組建，抗原量多於抗體量，利用抗原抗體複合物為載體，攜帶抗原，改變抗原提呈形式，增強機體免疫性。本發明採用血源純化B肝表面抗原，很難避免其潛在的感染性。況且該複合物是一種抗原抗體複合物，而不是抗原、抗體、抗獨特性抗體和重組DNA複合物。
授權中國專利申請號97106291.9公開了「抗原-抗體-重組DNA複合型疫苗」，本發明由微生物抗原-抗體與帶有編碼微生物的一種或幾種基因的重組質粒DNA製備成複合型疫苗，通過誘生對微生物感染處於免疫應答低下或免疫耐受者產生應答，可顯著提高機體的特異性體液免疫與細胞免疫，具有抗原提呈形式多，誘生免疫應答速度快，而且用量少，穩定性高等特點。本發明採用基因重組B肝表面抗原和抗體，再加入B肝DNA重組質粒。該方法需要基因工程技術，技術工藝周期長，難度大，況且該複合物是一種抗原-抗體-重組DNA複合物，而不是抗原、抗體、抗獨特性抗體和重組DNA複合物。
中國專利申請號02113744.7公開了「抗禽類病毒性疫病的複合卵黃抗體及其製備和應用」，是由蛋黃抗腸毒素免疫球蛋白、卵轉鐵蛋白、溶菌酶和餘量的水分、灰分及微量元素組成的蛋白複合物，而不是抗原、抗體、抗獨特性抗體和重組DNA複合物。
中國專利申請號00125941.5公開了「蛋黃免疫活性蛋白複合物」，是由具有抗體活性的抗禽流感、新城疫的雞卵黃抗體(抗-ANIgY)組成的抗體複合物，也不是抗原、抗體、抗獨特性抗體和重組DNA複合物。
在現有技術中，單克隆抗體藥物和疫苗為兩大類相互獨立的免疫藥物，其中單克隆抗體藥物用於免疫治療，疫苗用於免疫預防。臨床通常是分別單獨使用，其中疫苗用於未病先預防，而單克隆抗體藥物則主要施用於已病患者，但是，在臨床上很難及時判斷出就診者是未發病還是已發病，當就診者處於觀察期或疾病處於窗口期時，是施用疫苗還是施用抗體藥物就變得非常難把握，假如對未病者施用抗體藥物，不但會造成浪費而且又不能起到預防的目的；如果對已病者施用疫苗，不但達不到預防的目的而又失去了早期治療的機會，因此臨床急需一種能夠真正實現有病治病未病預防的複合型抗體藥物。另外，對於減毒或滅活病原體疫苗的使用，還會給患者帶來潛在感染的隱患，再者就是基因重組亞單位疫苗所存在的的免疫作用不完全等問題。因此研製開發一種既能治病又能防病、安全高效的治療性疫苗已成為生物技術領域的重大課題。
發明目的本發明的目的在於克服上述現有技術的缺點與不足，提供一種預防和治療疾病的免疫原性組合物，主要是由有效量的抗原、抗體、抗獨特型抗體、重組DNA和藥用敷料組成。以達到既能治病又能防病的目的。該預防和治療疾病的免疫原性組合物用於作為疾病生物預防和治療劑，能顯著增強機體對疾病相關病原體的特異性體液和細胞免疫反應，且療效確切、快速和全面，適用於作為人類腫瘤、傳染性疾病、自身免疫病、過敏性疾病和器官移植排斥的治療性疫苗以及食品、保健品添加劑；也適用於作為畜禽傳染病的治療性疫苗和畜禽飼料添加劑。
本發明的另一目的還在於預防和治療疾病的免疫原性組合物的製備方法。
本發明的另一目的還在於預防和治療疾病的免疫原性組合物的用途。
技術方案本發明的技術方案是這樣實現的一種預防和治療疾病的免疫原性組合物，主要是由抗原、抗體和重組DNA組成，其特徵在於由有效量的抗原、抗體、抗獨特型抗體、重組DNA和藥用敷料組成，其中抗原、抗體、抗獨特型抗體是純化或重組的特異性抗原、抗體、抗獨特型抗體，重組DNA是能夠表達所述特異性抗原、抗體和抗獨特型抗體中的任一種或其多種的重組DNA質粒。
根據本發明，其特徵還在於在該免疫原性組合物中各組分重量比分別為抗原 0.001～99％抗體 0.001～99％抗獨特型抗體 0.001～99％重組DNA0.01～99％藥用敷料 0.01～99％其中以預防為目的者，抗原+抗獨特型抗體+重組DNA的量(w/w)＞抗體的量；以治療為目的者，抗體的量(w/w)＞抗原+抗獨特型抗體+重組DNA的量；以預防性治療或早期治療為目的者，抗體的量(w/w)＝抗原+抗獨特型抗體+重組DNA的量。
根據本發明，其特徵還在於在該免疫原性組合物中還含有特異性抗原(Ag)、抗體(Ab)和抗獨特型抗體(Ab2)特異性結合後所形成的免疫複合物；所述抗獨特型抗體包括抗獨特型抗體α(Ab2α)、抗獨特型抗體β(Ab2β)、抗獨特型抗體γ(Ab2γ)、抗獨特型抗體ε(Ab2ε)中的任一種或其組合；所述免疫複合物包括抗原-抗體複合物(Ag-Ab)、抗原-抗體-抗獨特型抗體複合物(Ag-Ab-Ab2α、Ag-Ab-Ab2β、Ag-Ab-Ab2γ、Ag-Ab-Ab2ε)和抗體-抗獨特型抗體複合物(Ab-Ab2α、Ab-Ab2β、Ab-Ab2γAb-Ab2ε)中的任一種或其組合。
根據本發明，其特徵還在於所述特異性抗原、抗體、抗獨特型抗體和重組DNA是分別針對於同一種或同一類疾病相應免疫原的動物源性或人源性特異性抗原、抗體、抗獨特型抗體和重組DNA。
根據本發明，其特徵還在於所述抗原、抗體、抗獨特型抗體和重組DNA是分別針對於純化或重組的腫瘤免疫原、傳染性疾病病原體免疫原、自身免疫病免疫原、過敏性疾病免疫原、移植器官免疫原和畜禽傳染病病原體免疫原的動物源性或人源性抗原、抗體、抗獨特型抗體和重組DNA；上述腫瘤免疫原包括純化或滅活的腫瘤抗原或細胞、通過基因工程技術重組的腫瘤特異性抗原、多肽或疫苗瘤苗、腫瘤特異性DNA或mRNA及其與相應載體組成的重組體、針對於腫瘤特異性抗原的單克隆或多克隆抗體、針對於腫瘤特異性抗體的抗獨特性抗體；以及上述腫瘤免疫原的納米微粒或脂質體複合物；上述傳染性疾病病原體免疫原包括純化或滅活的病原體、純化或重組的病原體抗原、多肽或疫苗、病原體特異性DNA或mRNA及其與相應載體組成的重組體、針對於病原體特異性抗原的單克隆或多克隆抗體、針對於傳染性疾病病原體特異性抗體的抗獨特性抗體；以及上述傳染性疾病病原體免疫原的納米微粒或脂質體複合物；上述過敏性疾病免疫原包括純化或重組的變應原、多肽、變應原特異性DNA或mRNA及其與相應載體組成的重組體、針對於變應原的單克隆或多克隆抗體、針對於變應原特異性抗體的抗獨特性抗體；以及上述過敏性疾病免疫原的納米微粒或脂質體複合物；上述自身免疫病免疫原包括純化或重組抗原、多肽、自身抗原或疫苗、細胞因子靶向抗原、自身免疫病特異性DNA或mRNA及其與相應載體組成的重組體、針對於自身免疫病特異性抗原和細胞因子靶向抗原的單克隆或多克隆抗體、針對於自身抗原和細胞因子靶向抗原特異性抗體的抗獨特性抗體；以及上述自身免疫病免疫原的納米微粒或脂質體複合物；所述細胞因子靶向抗原包括人類白細胞分化抗原CD、粘附分子、補體、細胞因子及其受體、免疫球蛋白超家族；所述細胞因子及其受體包括白細胞介素(IL)及其受體、集落刺激因子(CSF)及其受體、腫瘤壞死因子(TNF)及其受體、趨化因子及其受體；上述移植器官免疫原包括移植器官供體或移植器官受體的純化或重組抗原、多肽、自身抗原或疫苗、細胞因子靶向抗原、自身免疫病特異性DNA或mRNA及其與相應載體組成的重組體、針對於自身免疫病特異性抗原和細胞因子靶向抗原的單克隆或多克隆抗體、針對於自身抗原和細胞因子靶向抗原特異性抗體的抗獨特性抗體；以及上述自身免疫病免疫原的納米微粒或脂質體複合物； 所述細胞因子靶向抗原包括人類白細胞分化抗原CD、粘附分子、補體、細胞因子及其受體、免疫球蛋白超家族；所述細胞因子及其受體包括白細胞介素(IL)及其受體、集落刺激因子(CSF)及其受體、腫瘤壞死因子(TNF)及其受體、趨化因子及其受體；上述畜禽傳染病病原體免疫原包括純化或滅活的病原體、純化或重組的病原體抗原、多肽或疫苗、病原體特異性DNA或mRNA及其與相應載體組成的重組體、針對於病原體特異性抗原的單克隆或多克隆抗體、針對於畜禽傳染病病原特異性抗體的抗獨特性抗體；以及上述畜禽傳染病病原體免疫原的納米微粒或脂質體複合物；上述抗原、抗體、抗獨特型抗體是通過分離、純化和基因工程技術包括噬菌體展示多肽、細菌表面展示多肽和人工合成多肽中的任一種或其組合途徑獲得的；
根據本發明，其特徵還在於所述的疾病特異性抗獨特型抗體(Ab2)是針對於上述疾病免疫原所對應的特異性抗體(Ab)包括蛋黃抗體IgY的抗獨特型抗體(Ab2)；所述抗獨特型抗體(Ab2)包括抗獨特型抗體α(Ab2α)、抗獨特型抗體β(Ab2β)、抗獨特型抗體γ(Ab2γ)和抗獨特型抗體ε(Ab2ε)中的任一種或其組合。
所述抗獨特型抗體(Ab2)是針對於外來抗原的抗體分子(Ab1)可變區上獨特型(Id)可刺激機體產生相應的抗Id抗體(Ab2)。其中Ab2α屬半抗原非抑制性Ab2，具有調節作用，可促進或抑制Ab1克隆；Ab2β具有與外來抗原相似的胺基酸排列順序或空間構型，它能夠在體內模擬始動抗原的作用，故被認為是外部抗原在機體免疫系統中的「內影像」(internal image)，可抑制Ab1與相應抗原的結合反應；Ab2γ屬半抗原非抑制性Ab2，能抑制抗原與Ab1的結合，具有調節作用，可促進或抑制帶有相應Id克隆細胞增殖；Ab2ε是一種雙特異性抗體，又稱Epibody，能識別Ab1骨架區上的抗原決定簇，同時又能識別自身或外來抗原上的表位，更有利於上述疾病的免疫治療。
具有內影像特點的抗獨特型抗體能模擬病原體相關抗原誘導機體產生主動免疫應答，其應答過程極其複雜，但主要涉及體液免疫和細胞免疫兩方面。Ab2β作為胸腺依賴抗原(TD)激活輔助T淋巴細胞亞群(Th1和Th2)，分泌一系列細胞因子，如Th1細胞產生幹擾素-γ(INF-γ)、IL-10、TNF和白細胞介素-2(IL-2)；Th2細胞產生IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等。Th2細胞產生的細胞因子影響和促進B淋巴細胞分化和增殖，產生特異性抗體Ab3，Ab3一部分能與Ab1互相模擬，即具有與抗原結合性，稱之為抗病原體抗體(Ab1′)。總Ab3的產生已被證實與微小病原體病灶消退和/或病人病情好轉呈正相關。被激活的Th1細胞釋放細胞因子，如INF-γ可通過影響NK細胞及T細胞功能而發揮抗病原體效應，IL-2可促進T細胞生長、克隆性擴增而增強機體的免疫功能，亦可誘導或促進多種細胞毒性細胞活性，如自然殺傷細胞(NK)、細胞毒性T淋巴細胞(CTL)、淋巴因子激活的殺傷細胞(LAK)及腫瘤浸潤淋巴細胞(TIL)等，發揮免疫監視及抗病原體效應。同時IL-2還可協同刺激B細胞增殖及分泌抗體，與補體及效應細胞相作用，發揮抗體依賴性細胞毒作用(ADCC)及補體依賴性細胞毒性(CDC)抗病原體作用(龔非力等，醫學免疫學，第二版，武漢科學出版社，2000)。
人體內免疫系統是一個處於自身動態平衡中的系統。在患者體內的免疫系統中，抗獨特型抗體是一個較關鍵的系統要素，用人為的方法改變抗獨特型抗體的質量和數量，必然會使系統發生變化，從而在更高的層次上達到新的平衡。使對病原體免疫的系統平衡按照理論上預測的有利於患者的方向發展變化，在某種意義上這正是抗獨特型抗體應用的關鍵所在。
核酸疫苗主要是DNA疫苗可以引發全面的免疫應答反應。一方面，核酸疫苗導入宿主體內後，被抗原提呈細胞(APC)攝取，表達的蛋白質被細胞內蛋白酶體複合物降解為8～10個胺基酸多肽，多肽被內質網腔上的抗原轉運蛋白(TAP)運送進入內質網，在那裡與MHC-I類分子及β2-微球蛋白形成三聚體，三聚體移出細胞並定位在細胞膜上，從而誘導MHC-I限制的抗原特異性的CTL，產生細胞免疫；另一方面，胞內表達的蛋白質通過分泌或細胞裂解釋放入血，並被專職APC內吞，在其中被降解為12～18個胺基酸的多肽，與此同時，胞漿內質網合成的MHC-II類分子(含α，β，γ三鏈)也被高爾基體運至內體，在體內，γ鏈被降解，剩餘的MHC-II類分子的α，β鏈與抗原肽結合成抗原肽-II類分子複合物而提呈於APC表面，成為CD4+Th細胞免疫監視的靶位，Th細胞分泌淋巴因子，刺激B細胞轉化為漿細胞，產生抗體，誘導了抗原特異性的體液免疫應答。
根據本發明，其特徵還在於所述疾病相應免疫原包括腫瘤、傳染性疾病、自身免疫病、過敏性疾病、移植器官特異性的純化或重組抗原、抗體、抗獨特型抗體、重組DNA、細胞因子及其受體和組織細胞中的任一種或其任一組合；所述免疫原是蛋白質、多肽、粘多糖、脂多糖、糖蛋白、細胞核、細胞質、細胞膜、細胞表面受體、核蛋白、DNA、RNA、線粒體、微粒體中的任一種或其組合。
根據本發明，其特徵還在於所述的疾病相應免疫原包括畜禽傳染病病原體特異性純化或重組抗原、抗體、抗獨特型抗體、重組DNA、細胞因子及其受體和組織細胞中的任一種或其組合；所述免疫原是蛋白質、多肽、粘多糖、脂多糖、糖蛋白、細胞核、細胞質、細胞膜、細胞表面受體、核蛋白、DNA、RNA、線粒體、微粒體中的任一種或其組合。
根據本發明，其特徵還在於在該組合物中還含有藥用輔料；所述藥用輔料包括包衣材料、蛋白穩定劑、藥用佐劑、免疫增強劑，其中包衣材料為丙烯酸樹脂、羥丙基甲基纖維素及其衍生物中的任一種或其組合；蛋白穩定劑為聚乙二醇、蔗糖、海藻糖中的任一種或其組合；藥用佐劑為氫氧化鋁、表面活性劑、弗氏(Freund)佐劑中的任一種；免疫增強劑為多聚糖、糖肽、糖脂和磷脂中的任一種或其組合，其中脂類包括三棕櫚醯絲氨醯甘油基半胱氨酸(P3CSS)、單棕櫚脂酸、雙棕櫚脂酸、三棕櫚脂酸、棕櫚醯賴氨酸、α-氨基十六烷酸(Had、含線性飽和脂性側鏈)、月桂醯肽脂中的任一種或其組合；上述脂類是以分子內佐劑的形式與所述本發明中的抗原、抗體、抗獨特型抗體和重組DNA結合成複合物。
根據本發明，其特徵還在於所述預防和治療疾病的免疫原性組合物包括腫瘤特異性免疫原性組合物、傳染性疾病病原體特異性免疫原性組合物、自身免疫病特異性免疫原性組合物、過敏性疾病變應原特異性免疫原性組合物、移植器官特異性免疫原性組合物中的任一種或其組合。
上述腫瘤特異性免疫原包括甲胎蛋白AFP、癌胚抗原CEA、絨毛膜促性腺激素HCG、前列腺特異性抗原PSA、卵巢腫瘤相關癌抗原CA125、癌抗原CA15-3、糖鏈抗原CA19-9、鱗狀細胞癌抗原SCC、組織多肽抗原TPA的純化或重組抗原、抗體、抗獨特型抗體及其重組DNA中的任一種；所述腫瘤特異性免疫原性組合物包括上述腫瘤抗原的特異性免疫原性組合物，其中癌胚抗原CEA特異性免疫原性組合物是由癌胚抗原CEA、癌胚抗原蛋黃抗體CEA-IgY、CEA-IgY特異性蛋黃抗獨特型抗體、癌胚抗原CEA重組DNA質粒和藥用輔料組成，其中各組分重量比分別為CEA抗原 0.01～99％CEA-IgY抗體 0.01～99％CEA-IgY特異性蛋黃抗獨特型抗體 0.01～99％CEA重組DNA質粒0.1～99％藥用敷料 0.1～99％上述傳染性疾病特異性免疫原包括愛滋病、B型肝炎、C型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、庚型肝炎、結核、幽門螺桿菌性胃炎、梅毒、淋病等性傳播性疾病、病毒性腸炎、病毒性肺炎、病毒性腦炎、支原體、衣原體肺炎、斑疹傷寒、皰疹、風疹、流感及寄生蟲感染性疾病病原體的純化或重組抗原、抗體、抗獨特型抗體及其重組DNA中的任一種；所述傳染性疾病病原體特異性免疫原性組合物包括上述疾病的病原體特異性免疫原性組合物，其中B型肝炎病毒特異性免疫原性組合物是由B肝表面抗原HBsAg、B肝表面抗原特異性蛋黃抗體IgY、B肝表面抗體特異性蛋黃抗獨特型抗體、B肝表面抗原重組DNA質粒和藥用輔料組成，其中各組分重量比分別為B肝表面抗原HBsAg 0.01～99％B肝表面抗原特異性蛋黃抗體IgY 0.01～99％B肝表面抗體特異性蛋黃抗獨特型抗體0.01～99％B肝表面抗原重組DNA質粒 0.1～99％藥用敷料 0.1～99％上述自身免疫病特異性免疫原包括多發性硬化症、類風溼關節炎、強直性脊柱炎、系統性紅斑狼瘡、混合結締組織病、胰島素依賴性糖尿病、自身免疫性溶血性貧血、甲狀腺功能亢進症、橋本甲狀腺炎、乾燥症候群疾病相關因子的純化或重組抗原、抗體、抗獨特型抗體及其重組DNA中的任一種；所述自身免疫病特異性免疫原性組合物包括上述疾病的特異性免疫原性組合物，其中類風溼關節炎的免疫原性組合物是由B淋巴細胞表面抗原CD20、CD20-IgY、CD20-IgY特異性蛋黃抗獨特型抗體、CD20重組DNA質粒和藥用輔料組成，其中各組分重量比分別為CD20抗原 0.01～99％CD20-IgY抗體 0.01～99％
CD20-IgY特異性蛋黃抗獨特型抗體0.01～99％CD20重組DNA質粒 0.1～99％藥用敷料 0.1～99％上述過敏性疾病變應原特異性免疫原性組合物包括變應性鼻炎、過敏性哮喘、特應性皮炎、過敏性結膜炎、過敏性胃腸炎的變應原純化或重組抗原、抗體、抗獨特型抗體及其重組DNA中的任一種；所述過敏性疾病變應原特異性免疫原性組合物包括上述疾病的變應原特異性免疫原性組合物，其中變應性鼻炎免疫原性組合物是由變應原塵蟎抗原、蟎抗體-IgY、蟎抗體-IgY特異性蛋黃抗獨特型抗體、蟎抗原重組DNA質粒和藥用輔料組成，其中各組分重量比分別為蟎抗原0.01～99％蟎抗體-IgY0.01～99％蟎抗體-IgY特異性蛋黃抗獨特型抗體 0.01～99％蟎抗原重組DNA質粒 0.1～99％藥用敷料 0.1～99％上述移植器官特異性免疫原性組合物包括腎移植、肝移植、心臟移植、胰腺移植、骨髓移植、幹細胞移植中排斥反應因子的純化或重組抗原、抗體、抗獨特型抗體及其重組DNA中的任一種；所述移植器官特異性免疫原性組合物包括上述器官移植排斥反應因子特異性免疫原性組合物，其中腎移植特異性免疫原性組合物是由CD154、CD154-IgY、CD154-IgY特異性蛋黃抗獨特型抗體、CD154重組DNA質粒和藥用輔料組成，其中各組分重量比分別為CD154抗原 0.01～99％CD154-IgY抗體 0.01～99％CD154-IgY特異性蛋黃抗獨特型抗體 0.01～99％CD154重組DNA質粒 0.1～99％藥用敷料 0.1～99％根據本發明，其特徵還在於所述預防和治療疾病的免疫原性組合物包括畜禽傳染病病原體特異性免疫原性組合物。
上述畜禽傳染病特異性免疫原包括口蹄疫、狂牛症、牛瘟、狂犬病、雞新城疫、雞傳染性法氏囊病、禽流感、雞減蛋症候群、雞馬立克氏病、雞傳染性鼻炎、雞支原體病、雞傳染性喉氣管炎、雞霍亂、雞傷寒、鴨瘟、小鵝瘟、豬瘟、豬紅斑丹毒絲菌感染、豬傳染性胃腸炎、豬囊蟲病、豬肺疫、馬傳染性貧血病、兔瘟、羊脫毛症候群、魚類暴發性出血病的病原體純化或重組抗原、抗體、抗獨特型抗體及其重組DNA中的任一種；所述畜禽傳染病特異性免疫原性組合物包括上述疾病的病原體特異性免疫原性組合物，其中雞新城疫病毒免疫原性組合物是由雞新城疫病毒NDV抗原、NDV-IgY抗體、NDV-IgY特異性蛋黃抗獨特型抗體、NDV抗原重組DNA質粒和藥用輔料組成，其中各組分重量比分別為NDV抗原 0.01～99％NDV-IgY抗體 0.01～99％NDV-IgY特異性蛋黃抗獨特型抗體 0.01～99％NDV抗原重組DNA質粒0.1～99％藥用敷料 0.1～99％根據本發明，其特徵還在於在上述免疫原性組合物中還含有免疫偶聯物；所述免疫偶聯物包括上述疾病病原體特異性抗體與放射性核素、藥物和毒素以及細胞因子的偶聯物中的任一種或其組合其中所述放射性核素包括碘131I、磷32P、鍶89Sr、釔90Y、釤153Sm、錸188Re中的任一種或其組合；所述藥物包括抗癌藥物、抗病毒藥物、抗菌素、免疫調節藥物和免疫抑制劑中的任一種或其組合；所述毒素包括包括篦麻籽毒素(RT)、相思子毒素(abrin)、苦瓜毒素(MD)、氧化苦參鹼(OXY)、去甲斑蝥素、白喉毒素(DT)、假單胞菌內毒素以及綠膿桿菌外毒素(PE)中的任一種或其組合所述細胞因子包括白細胞介素、集落刺激因子(CSF)、腫瘤壞死因子(TNF)、趨化因子中的任一種或其組合；從而使所述免疫原性組合物具有導向或靶向作用。
根據本發明，其特徵還在於所述的免疫原性組合物是其納米微粒或脂質體複合物。
根據本發明，其特徵還在於所述免疫原性組合物是任一種藥劑學上所述的劑型；所述劑型包括注射劑、膠囊、口服液、氣霧劑、貼劑中的任一種劑型。
一種預防和治療疾病的免疫原性組合物的製備方法，其特徵在於包括以下步驟1)採用蛋白質鹽析、柱層析純化疾病特異性抗原或通過基因重組的辦法製備疾病病原體特異性抗原；所述疾病病原體特異性抗原包括人類腫瘤、傳染性疾病、自身免疫病、過敏性疾病、器官移植排斥及畜禽傳染病病原體的純化或重組特異性抗原；即得到該免疫原性組合物組分之一抗原(Ag)；2)通過免疫動物製備針對於上述抗原的單克隆或多克隆抗體；或通過基因重組的辦法製備上述疾病相關病原體抗原的特異性抗體；即得到該免疫原性組合物組分之一抗體(Ab)；3)以步驟1)製備的疾病相關病原體特異性抗原為免疫原，多次重複免疫注射給禽類優選是雞，待5-20天後禽類尤其是雞的產蛋中即含有針對於上述疾病相關病原體特異性免疫原的蛋黃抗體IgY；所述的免疫原注射量為1-2ml，免疫原量10-500μg/ml+等量不完全弗氏佐劑；4)禽蛋尤其是雞蛋去殼取黃，經滅菌處理後，依次進行a)用5倍體積的0.1mol/L PH7.2磷酸鹽-海藻糖稀釋液稀釋蛋黃；b)自-20℃到室溫反覆凍融，每分鐘500-1000轉低速離心後合併上清液備用；c)向上清液中加入乙醇至終濃度為30-50％，靜置沉澱後，取沉澱備用；d)取沉澱通過進一步浸提、萃取、濃縮、純化、冷凍或噴霧乾燥，即得到該免疫原性組合物組分之一蛋黃抗體IgY；5)取步驟2)製備的針對於上述病原體抗原的抗體或步驟4)製備的蛋黃抗體IgY為免疫原，多次重複免疫注射給禽類優選是雞，待5-20天後禽類尤其是雞的產蛋中即含有針對於上述相應抗體包括蛋黃抗體IgY的蛋黃抗獨特型抗體；所述的免疫原抗體Ab1的注射量為1-2ml，免疫原抗體Ab1的用量為10-2000μg/ml+等量不完全弗氏佐劑；6)重複步驟4)的過程，即得到該免疫原性組合物組分之一蛋黃抗獨特型抗體(Ab2)；7)取特異性基因片段經過聚合酶鏈反應(PCR)後，提取和純化表達上述疾病特異性抗原、抗體和抗獨特型抗體的DNA片段，通過酶切後，與相應分子克隆載體重組，構建成上述疾病特異性抗原、抗體和抗獨特型抗體的真核表達質粒，即得到該免疫原性組合物組分之一重組DNA；8)根據實際需要按重量配比調製步驟1)所得的抗原、步驟2)所得的抗體或步驟4)所得的蛋黃抗體IgY、步驟6)所得的蛋黃抗獨特型抗體和步驟7)所得的重組DNA，再輔以可接受量的藥用輔料即得到所述的免疫原性組合物，其中各組分重量比分別為抗原 0.001～99％抗體 0.001～99％抗獨特型抗體 0.001～99％重組DNA 0.01～99％藥用敷料 0.01～99％9)取步驟8)製備的免疫原性組合物經過無菌、安全及毒性試驗合格後，再通過相應的製劑工藝製備成藥劑學上相應的劑型；所述劑型包括注射劑、膠囊、口服液、氣霧劑、貼劑中的任一種劑型。
根據本發明的製備方法，其特徵還在於包括以下步驟1)提取純化或重組疾病相關病原體特異性抗原；2)提取純化或重組疾病相關病原體特異性抗體；3)分別取上述抗原和抗體包括蛋黃抗體IgY作為免疫原，分別連續或同時多次重複免疫注射給禽類優選是雞；還可將上述抗原和抗體包括蛋黃抗體IgY按1∶1比例混合後作為免疫原進行免疫注射；待5-20天後禽類尤其是雞的產蛋中即同時含有針對於上述抗原的蛋黃抗體IgY和針對於上述抗體包括蛋黃抗體IgY的特異性蛋黃抗獨特型抗體；4)取上一步驟所得的禽蛋或雞蛋，經滅菌處理後，依次進行a)用5倍體積的0.1mol/L PH7.2磷酸鹽-海藻糖稀釋液稀釋蛋黃；b)自-20℃到室溫反覆凍融，每分鐘500-1000轉低速離心後合併上清液備用；c)向上清液中加入乙醇至終濃度為30-50％，靜置沉澱後，取沉澱備用；d)取沉澱通過進一步浸提、萃取、濃縮、純化、冷凍或噴霧乾燥；如此一次性提取純化，可同時得到蛋黃抗體IgY和蛋黃抗獨特型抗體組合物；5)取特異性基因片段經過聚合酶鏈反應(PCR)後，提取和純化表達上述疾病特異性抗原、抗體和抗獨特型抗體的DNA片段，通過酶切後，與相應分子克隆載體重組，構建成上述疾病特異性抗原、抗體和抗獨特型抗體的真核表達質粒，即得到該免疫原性組合物組分之一重組DNA；6)根據實際需要按重量配比調製步驟1)所得的抗原、步驟2)所得的抗體、步驟4)所得的蛋黃抗體IgY和蛋黃抗獨特型抗體組合物和步驟5)所得的重組DNA，再輔以可接受量的藥用輔料即得到所述的免疫原性組合物，其中各組分重量比分別為抗原0.001～99％抗體0.001～99％抗獨特型抗體0.001～99％重組DNA 0.01～99％藥用敷料0.01～99％7)取步驟6)製備的免疫原性組合物經過無菌、安全及毒性試驗合格後，再根據實際需要，通過相應的製劑工藝製備成藥劑學上相應的劑型；所述劑型包括注射劑、膠囊、口服液、氣霧劑、貼劑中的任一種劑型。
根據本發明，預防和治療疾病的免疫原性組合物的用途，其特徵在於應用於製備疾病生物預防和治療劑以及食品、保健品添加劑，特別是應用於製備人類惡性腫瘤、傳染性疾病、自身免疫病、過敏性疾病和器官移植排斥的治療性疫苗以及食品、保健品添加劑。
根據本發明，預防和治療疾病的免疫原性組合物的用途，其特徵還在於應用於製備畜禽傳染病的治療性疫苗和畜禽飼料添加劑。
技術效果本發明將抗原、抗體、抗獨特型抗體和重組DNA有機巧妙地結合在一起，既適用於治療又適用於預防疾病，兼具治病和防病於一身，不但避免了單克隆抗體藥物和減毒活疫苗及基因重組亞單位疫苗之功能單一的缺點，而且有效地解決了鼠源性單抗所產生的HAMA反應問題。
更重要的是在本發明中由於抗原-抗體、抗體-抗獨特型抗體和抗原-抗體-抗獨特型抗體免疫複合物的形成，能夠通過上述免疫複合物所攜帶的抗原或抗獨特型抗體，從而改變抗原提呈形式，更有利於抗原的提呈，並增強抗原的免疫原性，強化機體免疫應答，以達到降低或增加機體免疫耐受的目的，另外，上述免疫複合物所攜帶的抗體的中和或消除或耐受靶向抗原的功能同其所攜帶的抗獨特型抗體的調節、抑制、模擬「內影像」及雙特異性等功能相得益彰、相互促進、相互協調、相互增強或降低等多種功能協同作用，再加上重組DNA的強化和協同作用以共同達到防病和治病的雙向目的。
本發明就是採用上述方法所製備的所述預防和治療疾病的免疫原性組合物，即疾病特異性抗原、抗體、抗獨特型抗體、重組DNA和藥用輔料的免疫原性組合物，作為疾病的治療性疫苗而應用於上述疾病的特異性免疫預防和治療。該免疫原性組合物能夠激活或抑制特定的淋巴細胞〔B細胞和T細胞〕，產生相應的對抗疾病病原體的整體免疫作用即體液和細胞免疫作用，並對將來的疾病病原體產生記憶反應，激活機體免疫系統甚至重新調節機體免疫系統平衡，調動或協調機體的體液免疫和細胞免疫作用，產生特異性對抗上述疾病病原體的抗體或反應性淋巴細胞，來共同消滅或耐受病原體、變應原、自身抗原和被移植器官，克服了滅活病原體疫苗的潛在感染問題、基因重組亞單位疫苗的不完全免疫反應問題以及免疫抑制劑的毒性問題，以達到全面、有效、快速預防和治療上述疾病的目的。
本發明通過實驗例和動物實驗，取得了意想不到的效果，其實驗結果(見實驗例)表明，本發明具有下列優點；1、本發明服用、攜帶、運輸方便，適用於男女、老幼正常人和患者使用。
2、本發明療效確切、無毒副作用和過敏反應，適用於作為人類腫瘤、傳染性疾病、自身免疫病、器官移植排斥的治療性疫苗以及食品、保健品添加劑；也適用於作為畜禽傳染病的治療性疫苗以及畜禽飼料添加劑。
3、本發明可替代和補充昂貴的抗腫瘤、抗病毒、抗細菌以及免疫抑制藥物，能有效避免上述藥物的耐藥性及毒副作用。
4、本發明製備原料包括免疫原、禽類及其蛋黃、飼料、純化設備及其所用化學原料來源廣泛易得，經濟實用。
5、本發明製備工藝成熟，純度高且質量可靠，易於規模化實施。
6、本發明防治功能全面、快速，防病與治病集於一身，克服了抗體藥物和亞單位疫苗的各自的弱點。
7、本發明有效避免了鼠源性單抗的HAMA反應問題。
8、本發明還具有較好的導向性或靶向性，在一定程度上具有生物飛彈的功能。
9、本發明各組分間協同作用，相互促進、相互增強、相互協調，能有效防治上述疾病，且療效全面，應用面廣。
10、本發明中的抗原-抗體、抗體-抗獨特型抗體、抗原-抗體-抗獨特型抗體免疫複合物更有利於抗原和抗獨特型抗體模擬「內影像」抗原性的提呈，並且上述免疫複合物比單獨免疫原更能誘生高滴度的抗體產生和淋巴細胞增殖反應，從而更有效地誘生體液和細胞免疫反應，以達到防病和治病的雙向目的。
具體實施例方式
下面就結合實施例對本發明作進一步描述，但所述實施例並不限制本發明。
實施例1傳染性疾病的免疫原性組合物的製備(以B型肝炎特異性免疫原性組合物為例)一、抗原的來源和製備(以B肝表面抗原HBsAg為例)HBsAg為自HBsAg陽性血漿分離、純化，經胃蛋白酶消化及甲醛滅活的B型肝炎病毒表面抗原。
重組HBsAg重組B肝表面抗原疫苗由上海生物製品研究所提供。
二、抗體的來源和製備(以B肝表面抗體HBsAb為例)鼠源性抗-HBs以上述HBsAg加入2mg/ml氫氧化鋁佐劑，經腹腔免疫BALB/c小鼠，加強2周後取血、分離製備成抗血清，其純化抗-HBs效價為1∶256。
人Fab噬菌體抗-HBs用RT-PCR技術擴增出人抗體輕鏈k基因和重鏈Fd基因，將二基因先後克隆入PComb3Hss載體中，轉化大腸桿菌，再用輔助噬菌體感染，構建含抗-HBs的人源性噬菌體抗體庫，進一步篩選出針對於HBsAg的人Fab噬菌體抗體。
蛋黃抗體IgY的製備(以B肝表面抗原特異性蛋黃抗體IgY為例)1)用具有免疫活性的血源純化B肝表面抗原或基因重組B肝表面抗原或B肝表面抗原疫苗作為免疫原，其中血源純化B肝表面抗原和基因重組B肝表面抗原均由北京科衛臨床診斷試劑廠提供，重組B肝表面抗原疫苗由上海生物製品研究所提供；2)取6月齡SPF純系萊航產蛋母雞於標準II級清潔級動物房飼養，每隻雞於胸腹部多點注射上述B型肝炎免疫原1ml(免疫原量100μg/ml+等量完全福氏佐劑)，待3周後加強免疫注射2次，待15天後免疫母雞所產的雞蛋中即含有針對於上述B型肝炎免疫原的蛋黃抗體IgY；3)取步驟2)獲得的雞蛋10個去蛋清後的蛋黃液135ml，充分攪拌均勻後，加入蛋黃勻漿液5倍體積的0.1mol/L PH7.2磷酸鹽-海藻糖稀釋液，然後置於冰盒(-20℃)冰凍1小時，取出於室溫復融並低速離心(1000r/min)後，收集上清液，再向沉澱物中加入2倍體積的0.1mol/L PH7.2磷酸鹽-海藻糖稀釋液，充分混勻溶解沉澱物，依上法再次凍融收集上清液，如此反覆凍融3次，合併收集各次得到的上清液，加入乙醇至終濃度為50％，3000轉/分離心後，取沉澱備用；4)取步驟3)獲得的沉澱物通過進一步浸提、萃取、濃縮、純化、冷凍或噴霧乾燥，即得到本發明免疫原性組合物組分之一蛋黃抗體IgY，共得到IgY1.12g，其收率為71％。該蛋黃抗體IgY是針對於上述B型肝炎免疫原的。
三、蛋黃抗獨特型抗體的製備(以B肝表面抗體特異性蛋黃抗獨特型抗體為例)1)用具有免疫活性的血源純化B肝表面抗體或基因重組B肝表面抗體或上述實施例1第二條中所製備的B肝表面抗原特異性蛋黃抗體IgY為免疫原，其中血源純化B肝表面抗體和基因重組B肝表面抗體均由北京科衛臨床診斷試劑廠提供；2)取6月齡SPF純系萊航產蛋母雞於標準II級清潔級動物房飼養，每隻雞於胸腹部多點注射上述B型肝炎免疫原1ml(上述免疫原的用量為500μg+等量完全福氏佐劑)，待3周後加強免疫注射2次，待15天後免疫母雞所產的雞蛋中即含有針對於上述B型肝炎免疫原的蛋黃抗獨特性抗體；3)取步驟2)獲得的雞蛋10個去蛋清後的蛋黃液155ml，充分攪拌均勻後，加入蛋黃勻漿液5倍體積的0.1mol/L PH7.2磷酸鹽-海藻糖稀釋液，然後置於冰盒(-20℃)冰凍1小時，取出於室溫復融並低速離心(1000r/min)後，收集上清液，再向沉澱物中加入2倍體積的0.1mol/L PH7.2磷酸鹽-海藻糖稀釋液，充分混勻溶解沉澱物，依上法再次凍融收集上清液，如此反覆凍融3次，合併收集各次得到的上清液，加入乙醇至終濃度為50％，3000轉/分離心後，取沉澱備用；4)取步驟3)獲得的沉澱物通過進一步浸提、萃取、濃縮、純化、冷凍或噴霧乾燥，即得到本發明蛋黃抗體組合物組分之一蛋黃抗獨特型抗體，共得到IgY1.37g，其收率為76％。該蛋黃抗獨特型抗體是針對於上述B型肝炎表面抗體或B肝特異性蛋黃抗體IgY免疫原的。
四、蛋黃抗體IgY和蛋黃抗獨特型抗體組合物的製備(以B型肝炎蛋黃抗體IgY和蛋黃抗獨特型抗體組合物為例)1)分別取上述實施例1第一條中的B肝表面抗原免疫原和上述實施例1第二條中的B肝表面抗體包括B肝蛋黃抗體IgY免疫原等量混合之，成為B肝表面抗原和B肝表面抗體包括B肝蛋黃抗體IgY的混合免疫原；2)取6月齡SPF純系萊航產蛋母雞於標準II級清潔級動物房飼養，每隻雞於胸腹部多點注射上述B型肝炎混合免疫原1ml(上述免疫原的用量為1000μg+等量完全福氏佐劑)，待3周後加強免疫注射2次，待15天後免疫母雞所產的雞蛋中即含有針對於上述B型肝炎混合免疫原的蛋黃抗體IgY和蛋黃抗獨特性抗體；3)取步驟2)獲得的雞蛋去蛋清後的蛋黃液160ml，充分攪拌均勻後，加入蛋黃勻漿液5倍體積的0.1mol/L PH7.2磷酸鹽-海藻糖稀釋液，然後置於冰盒(-20℃)冰凍1小時，取出於室溫復融並低速離心(1000r/min)後，收集上清液，再向沉澱物中加入2倍體積的0.1mol/L PH7.2磷酸鹽-海藻糖稀釋液，充分混勻溶解沉澱物，依上法再次凍融收集上清液，如此反覆凍融3次，合併收集各次得到的上清液，加入乙醇至終濃度為50％，3000轉/分離心後，取沉澱備用；4)取步驟3)獲得的沉澱物通過進一步浸提、萃取、濃縮、純化、冷凍或噴霧乾燥，即得到本發明蛋黃抗體組合物的主要組分即蛋黃抗體IgY和蛋黃抗獨特型抗體的混合物，共得到IgY1.32g，其收率為80％。該蛋黃抗體混合物是針對於上述B型肝炎表面抗原和B型肝炎表面抗體包括B肝特異性蛋黃抗體IgY免疫原的。
五、重組DNA的製備(以B肝表面抗原重組DNA質粒為例)將編碼HBV表面抗原preS2+S片段的基因片段插入到真核細胞表達載體pJW4303中，構建成真核表達質粒pJW4303/HBV-S2.S重組體，在此稱為B肝表面抗原重組DNA質粒。
六、免疫原性組合物的製備(以B肝特異性免疫原性組合物I為例)取實施例1第一條中製備的B肝表面抗原100mg、實施例1第二條中製備的特異性蛋黃抗體IgY200mg、實施例1第三條中製備的B肝表面抗體特異性蛋黃抗獨特型抗體100mg和實施例1第五條中製備的B肝表面抗原重組DNA質粒400mg，將四者充分混合，然後加入等量氫氧化鋁佐劑900mg，充分混勻，再經過巴氏滅菌和除熱源處理後即為本發明B肝特異性免疫原性組合物I。
七、B肝表面抗原特異性蛋黃抗體IgY與氧化苦參鹼偶聯物的製備首先取葡聚糖10g，加入200mL蒸餾水後加高碘酸鈉3g，室溫下避光反應過夜，使葡聚糖充分氧化為多醛基葡聚糖，蒸餾水充分透析後凍幹；注射治療前2小時內取多醛基葡聚糖100mg加入0.15mol/L(pH7.2)的磷酸緩衝液20mL中，加氧化苦參鹼100mg，室溫下反應24小時後，再加入已純化的B肝表面抗原特異性蛋黃抗體IgY100mg，4℃攪拌反應24小時；然後在上述反應混合物中加硼氫化鈉2mg，在4℃下還原2小時，離心後經Sephadex G-150層析柱過柱，收集第一峰即可應用。
八、B肝特異性免疫原性組合物II的製備取實施例1第七條中製備的B肝表面抗原特異性蛋黃抗體IgY與氧化苦參鹼的偶聯物200mg和上述實施例1第一條中製備的B肝表面抗原100mg、實施例1第三條中製備的B肝表面抗體特異性蛋黃抗獨特型抗體100mg、實施例1第五條中製備的B肝表面抗原重組DNA質粒400mg，將四者充分混合，然後加入分子內佐劑棕櫚醯賴氨酸200mg，充分混勻，待反應完全後再經過巴氏滅菌和除熱源處理後即成為極易穿透細胞脂質膜且具有靶向抗B肝病毒作用的B肝特異性免疫原性組合物II。該免疫原性組合物II不僅具有上述實施例1第六條中所製備的免疫原性組合物I所具備的免疫協調和治療作用，而且還具有針對於B肝病毒的生物飛彈功能，因此對於B肝病毒具有更強的特異性殺傷能力。
九、B肝特異性免疫原性組合物II注射劑的製備按照實施例1第八條中B肝特異性免疫原性組合物II的配方組成，取該組合物1.0g，再加入分子內佐劑棕櫚醯賴氨酸200mg，再加入藥用敷料海藻糖2.0g，充分混勻，待反應完全後再經過巴氏滅菌和除熱源處理後，冷凍乾燥或乾燥處理後裝安培、封口即成為注射劑。
十、B肝特異性免疫原性組合物II膠囊的製備按照實施例1第八條中B肝特異性免疫原性組合物II的配方組成，取該組合物1.0g，再加入分子內佐劑棕櫚醯賴氨酸200mg，再加入藥用敷料蔗糖200g、大豆磷脂200g，充分混勻，待反應完全後再經過巴氏滅菌和除熱源處理後，裝入空心膠囊即成為用於口服的膠囊。
十一、B肝特異性免疫原性組合物II口服液的製備按照實施例1第八條中B肝特異性免疫原性組合物II的配方組成，取該組合物1.0g，再加入分子內佐劑棕櫚醯賴氨酸200mg，再加入藥用敷料蔗糖200g，補足重蒸餾水至10ml，充分混勻，待反應完全後再經過巴氏滅菌和除熱源處理後，裝入口服液瓶並無菌封口即成為口服液。
十二、B肝特異性免疫原性組合物II氣霧劑的製備按照實施例1第八條中B肝特異性免疫原性組合物II的配方組成，取該組合物1.0g，再加入分子內佐劑棕櫚醯賴氨酸200mg，再加入藥用敷料氣霧劑溶劑，待反應完全後再經過巴氏滅菌和除熱源處理後，打壓裝帶噴嘴耐壓氣霧劑瓶中即成為氣霧劑。
十三、B肝特異性免疫原性組合物II貼劑的製備按照實施例1第八條中B肝特異性免疫原性組合物II的配方組成，取該組合物1.0g，再加入分子內佐劑棕櫚醯賴氨酸200mg，再加入適量的藥用敷料羥丙基甲基纖維素，充分混勻，待反應完全後再經過巴氏滅菌和除熱源處理後，塗布於貼劑基質載體表面即成為貼劑。
實施例2惡性腫瘤的免疫原性組合物的製備(以腸癌特異性癌胚抗原CEA的免疫原性組合物為例)一、抗原的來源和製備(以癌胚抗原CEA為例)CEA為自腸癌組織經分離、純化的癌胚抗原。
二、抗體的來源和製備(以抗-CEA為例)鼠源性抗-CEA以上述CEA加入2mg/ml氫氧化鋁佐劑，經腹腔免疫BALB/c小鼠，加強2周後取血、分離製備成抗血清，其純化抗-CEA效價為1∶128。
癌胚抗原蛋黃抗體CEA-IgY的製備用具有免疫活性的腸癌組織純化CEA作為免疫原，按照實施例1第二條中的2)、3)、4)步驟即可獲得癌胚抗原蛋黃抗體CEA-IgY，用157ml蛋黃液共得到CEA-IgY1.52g，其收率為73％。
三、癌胚抗原蛋黃抗體CEA-IgY特異性蛋黃抗獨特型抗體的製備用具有免疫活性的癌胚抗原蛋黃抗體CEA-IgY為免疫原，按照實施例1第三條中的2)、3)、4)步驟即可獲得癌胚抗原蛋黃抗體CEA-IgY特異性蛋黃抗獨特型抗體，用142ml蛋黃液共得到CEA-IgY特異性蛋黃抗獨特型抗體1.52g，其收率為73％。
四、癌胚抗原特異性蛋黃抗體IgY和其特異性蛋黃抗獨特型抗體組合物的製備分別取實施例2第一條中製備的CEA和實施例2第二條中製備的癌胚抗原蛋黃抗體CEA-IgY等量混合之，成為混合免疫原，按照實施例1第四條中的2)、3)、4)步驟即可獲得癌胚抗原蛋黃抗體CEA-IgY和其特異性蛋黃抗獨特型抗體的組合物，用112ml蛋黃液共得到871mg，其收率為64％。
五、重組DNA的製備(以CEA重組DNA質粒為例)將人特異表達的癌胚抗原CEA的cDNA克隆到逆轉錄病毒質粒載體pLXSN中，構建成真核表達重組質粒pLXSN-CEA，在此稱為CEA重組DNA質粒。
六、癌胚抗原特異性免疫原性組合物I的製備取實施例2第一條中製備的CEA 100mg、實施例2第二條中製備的CEA-IgY200mg、實施例2第三條中製備的CEA-IgY特異性蛋黃抗獨特型抗體100mg和實施例2第五條中製備的CEA重組DNA質粒500mg，將四者充分混合，然後加入氫氧化鋁佐劑500mg，充分混勻，再經過巴氏滅菌和除熱源處理後即為癌胚抗原特異性免疫原性組合物I。
七、CEA-IgY與絲裂黴素偶聯物的製備首先取葡聚糖10g，加入200mL蒸餾水後加高碘酸鈉3g，室溫下避光反應過夜，使葡聚糖充分氧化為多醛基葡聚糖，蒸餾水充分透析後凍幹；注射治療前2小時內取多醛基葡聚糖100mg加入0.15mol/L(pH7.2)的磷酸緩衝液20mL中，加絲裂黴素100mg，室溫下反應24小時後，再加入已純化的CEA-IgY100mg，4℃攪拌反應24小時；然後在上述反應混合物中加硼氫化鈉2mg，在4℃下還原2小時，離心後經Sephadex G-150層析柱過柱，收集第一峰即可應用。
八、癌胚抗原特異性免疫原性組合物II的製備取實施例2第一條中製備的CEA 100mg、實施例2第七條中製備的CEA-IgY與絲裂黴素的偶聯物200mg、實施例2第三條中製備的CEA-IgY特異性蛋黃抗獨特型抗體100mg和實施例2第五條中製備的CEA重組DNA質粒200mg，將四者充分混合，然後加入分子內佐劑棕櫚醯賴氨酸400mg，充分混勻，待反應完全後再經過巴氏滅菌和除熱源處理後即成為極易穿透細胞脂質膜且具有靶向抗癌作用的癌胚抗原特異性免疫原性組合物II。該免疫原性組合物II不僅具有上述實施例2第六條中所製備的免疫原性組合物I所具有的免疫協調和治療作用，而且還具有針對於癌細胞的生物飛彈功能，因此對於癌細胞具有更強的特異性殺傷能力。
九、癌胚抗原特異性免疫原性組合物II注射劑的製備按照實施例2第八條中癌胚抗原特異性免疫原性組合物II的配方組成，取該組合物1.0g，再加入藥用敷料海藻糖2.0g，充分混勻，待反應完全後再經過巴氏滅菌和除熱源處理後，冷凍乾燥或乾燥處理後裝安培、封口即成為注射劑。
十、癌胚抗原特異性免疫原性組合物II口服液的製備按照實施例2第八條中癌胚抗原特異性免疫原性組合物II的配方組成，取該組合物1.0 g，再加入藥用敷料蔗糖500g，補足重蒸餾水至10ml，充分混勻，待反應完全後再經過巴氏滅菌和除熱源處理後，裝入口服液瓶並無菌封口即成為口服液。
實施例3自身免疫病的免疫原性組合物的製備(以類風溼性關節炎特異性CD20免疫原性組合物為例)一、抗原的來源和製備(以CD20為例)CD20為自人白細胞經分離、純化的CD20抗原。
二、抗體的來源和製備(以抗-CD20為例)鼠源性抗-CD20以上述CD20抗原加入2mg/ml氫氧化鋁佐劑，經腹腔免疫BALB/c小鼠，加強2周後取血、分離製備成抗血清，其純化抗-CD20效價為1∶128。
CD20蛋黃抗體CD20-IgY的製備用具有免疫活性的純化CD20抗原作為免疫原，按照實施例1第二條中的2)、3)、4)步驟即可獲得蛋黃抗體CD20-IgY，用157ml蛋黃液共得到CD20-IgY1.52g，其收率為76％。
三、蛋黃抗體CD20-IgY特異性蛋黃抗獨特型抗體的製備用具有免疫活性的CD20-IgY為免疫原，按照實施例1第三條中的2)、3)、4)步驟即可獲得蛋黃抗體CD20-IgY特異性蛋黃抗獨特型抗體，用142ml蛋黃液共得到CD20-IgY特異性蛋黃抗獨特型抗體1.52g，其收率為73％。
四、特異性蛋黃抗體CD20-IgY和其特異性蛋黃抗獨特型抗體組合物的製備分別取上述實施例3第一條中製備的CD20和上述實施例3第二條中製備的蛋黃抗體CD20-IgY等量混合之，成為混合免疫原，按照實施例1第四條中的2)、3)、4)步驟即可獲得蛋黃抗體CD20-IgY和其特異性蛋黃抗獨特型抗體的組合物，用112ml蛋黃液共得到895mg，其收率為67％。
五、重組DNA的製備(以CD20重組DNA質粒為例)將人CD20分子胞外區基因片斷插入到真核表達載體pExSecI的多克隆位點上，構建pExSecI/CD20重組質粒，在此稱為CD20重組DNA質粒。
六、CD20免疫原性組合物I的製備取實施例3第一條中製備的CD20 100mg、實施例3第二條中製備的CD20-IgY200mg、實施例3第三條中製備的CD20-IgY特異性蛋黃抗獨特型抗體100mg和實施例3第五條中製備的CD20重組DNA質粒500mg，將四者充分混合，然後加入氫氧化鋁佐劑500mg，充分混勻，再經過巴氏滅菌和除熱源處理後即為CD20特異性免疫原性組合物I。
七、CD20-IgY與氧化苦參鹼偶聯物的製備首先取葡聚糖10g，加入200mL蒸餾水後加高碘酸鈉3g，室溫下避光反應過夜，使葡聚糖充分氧化為多醛基葡聚糖，蒸餾水充分透析後凍幹；注射治療前2小時內取多醛基葡聚糖100mg加入0.15mol/L(pH7.2)的磷酸緩衝液20mL中，加氧化苦參鹼100mg，室溫下反應24小時後，再加入已純化的CD20-IgY100mg，4℃攪拌反應24小時；然後在上述反應混合物中加硼氫化鈉2mg，在4℃下還原2小時，離心後經Sephadex G-150層析柱過柱，收集第一峰即可應用。
八、CD20免疫原性組合物II的製備取上述實施例3第七條中製備的CD20特異性蛋黃抗體CD20-IgY與氧化苦參鹼的偶聯物100mg和上述實施例3第一條中製備的CD20抗原50mg、實施例3第三條中製備的CD20-IgY特異性蛋黃抗獨特型抗體50mg、實施例3第五條中製備的CD20重組DNA質粒100mg，將四者充分混合，然後加入分子內佐劑棕櫚醯賴氨酸100mg，充分混勻，待反應完全後再經過巴氏滅菌和除熱源處理後即成為極易穿透細胞脂質膜且具有靶向治療類風溼性關節炎的免疫原性組合物。該免疫原性組合物II不僅具有上述實施例3第六條中所製備的免疫原性組合物I所具備的免疫協調和治療作用，而且還具有針對於CD20陽性淋巴細胞的生物飛彈功能，因此對類風溼性關節炎具有更強的免疫治療作用。
九、CD20免疫原性組合物II注射劑的製備按照實施例3第八條中CD20免疫原性組合物II的配方組成，取該組合物II1.0g，再加入分子內佐劑棕櫚醯賴氨酸200mg，再加入藥用敷料海藻糖2.0g，充分混勻，待反應完全後再經過巴氏滅菌和除熱源處理後，冷凍乾燥或乾燥處理後裝安培、封口即成為注射劑。
十、CD20-IgY免疫原性組合物II貼劑的製備按照實施例3第八條中CD20免疫原性組合物II的配方組成，取該組合物II1.0g，再加入藥用敷料羥丙基甲基纖維素2.0g，充分混勻，待反應完全後再經過巴氏滅菌和除熱源處理後，塗布於貼劑基質載體表面即成為貼劑。
實施例4過敏性疾病的免疫原性組合物的製備(以變應性鼻炎塵蟎抗原的免疫原性組合物為例)
一、抗原的來源和製備(以蟎抗原為例)蟎抗原為採用上海醫大紅旗藥廠生產的蟎逸口含免疫劑經分離、純化的蟎抗原。
二、抗體的來源和製備(以蛋黃抗體蟎抗體-IgY為例)蟎抗體-IgY的製備用具有免疫活性的純化蟎抗原作為免疫原，按照實施例1第二條中的2)、3)、4)步驟即可獲得蟎抗體-IgY，用132ml蛋黃液共得到蟎抗體-IgY1.32g，其收率為75％。
三、蟎抗體-IgY特異性蛋黃抗獨特型抗體的製備用具有免疫活性的蟎抗體-IgY為免疫原，按照實施例1第三條中的2)、3)、4)步驟即可獲得蟎抗體-IgY特異性蛋黃抗獨特型抗體，用112ml蛋黃液共得到蟎抗體-IgY特異性蛋黃抗獨特型抗體1.2g，其收率為67％。
四、特異性蟎抗體-IgY和其特異性蛋黃抗獨特型抗體組合物的製備分別取上述實施例4第一條中製備的蟎抗原和上述實施例4第二條中製備的蟎抗體-IgY等量混合之，在加入等量完全佐劑而成為混合免疫原，按照實施例1第四條中的2)、3)、4)步驟即可獲得蟎抗體-IgY和其特異性蛋黃抗獨特型抗體的組合物，用125ml蛋黃液共得到830mg，其收率為61％。
五、重組DNA的製備(以蟎抗原重組DNA質粒為例)採用基因重組的方法構建能夠表達蟎抗原的重組DNA質粒。
六、蟎抗原特異性免疫原性組合物的製備取實施例4第一條中製備的蟎抗原100mg、實施例4第二條中製備的蟎抗體-IgY200mg、實施例4第三條中製備的蟎抗體-IgY特異性蛋黃抗獨特型抗體100mg和實施例4第五條中製備的蟎抗原重組DNA質粒500mg，將四者充分混合，然後加入氫氧化鋁佐劑500mg，充分混勻，再經過巴氏滅菌和除熱源處理後即為蟎抗原抗原特異性免疫原性組合物。
七、蟎抗原特異性免疫原性組合物注射劑的製備按照實施例4第六條中蟎抗原特異性免疫原性組合物的配方組成，取該組合物1.0g，再加入分子內佐劑棕櫚醯賴氨酸100mg，再加入藥用敷料海藻糖2.0g，充分混勻，待反應完全後再經過巴氏滅菌和除熱源處理後，冷凍乾燥或乾燥處理後裝安培、封口即成為注射劑。
實施例5用於器官移植的免疫原性組合物的製備(以腎移植用的免疫原性組合物為例)一、抗原的來源和製備(以CD154抗原為例)CD154抗原為自人白細胞經分離、純化的CD154抗原。
二、抗體的來源和製備(以蛋黃抗體CD154-IgY為例)蛋黃抗體CD154-IgY的製備用具有免疫活性的純化CD154抗原作為免疫原，按照實施例1第二條中的2)、3)、4)步驟即可獲得蛋黃抗體CD154-IgY，用125ml蛋黃液共得到CD154-IgY1.12g，其收率為74％。
三、CD154-IgY特異性蛋黃抗獨特型抗體的製備用具有免疫活性的CD154-IgY為免疫原，按照實施例1第三條中的2)、3)、4)步驟即可獲得CD154-IgY特異性蛋黃抗獨特型抗體，用112ml蛋黃液共得到CD154-IgY特異性蛋黃抗獨特型抗體1.2g，其收率為67％。
四、特異性CD154-IgY和其特異性蛋黃抗獨特型抗體組合物的製備分別取上述實施例5第一條中製備的CD154抗原和上述實施例5第二條中製備的CD154-IgY等量混合之，在加入等量完全佐劑而成為混合免疫原，按照實施例1第四條中的2)、3)、4)步驟即可獲得CD154-IgY和其特異性蛋黃抗獨特型抗體的組合物，用120ml蛋黃液共得到840mg，其收率為62％。
五、重組DNA的製備(以CD154抗原重組DNA質粒為例)採用基因重組的方法構建能夠表達CD154抗原的重組DNA質粒。
六、CD154抗原特異性免疫原性組合物的製備取實施例5第一條中製備的CD154抗原100mg、實施例5第二條中製備的CD154-IgY200mg、實施例5第三條中製備的CD154-IgY特異性蛋黃抗獨特型抗體100mg和實施例5第五條中製備的CD154抗原重組DNA質粒500mg，將四者充分混合，然後加入氫氧化鋁佐劑500mg，充分混勻，再經過巴氏滅菌和除熱源處理後即為CD154抗原特異性免疫原性組合物。
七、CD154抗原特異性免疫原性組合物注射劑的製備按照實施例5第六條中CD154抗原特異性免疫原性組合物的配方組成，取該組合物1.0g，再加入分子內佐劑棕櫚醯賴氨酸100mg，再加入藥用敷料海藻糖2.0g，充分混勻，待反應完全後再經過巴氏滅菌和除熱源處理後，冷凍乾燥或乾燥處理後裝安培、封口即成為注射劑。
實施例6畜禽傳染病的免疫原性組合物的製備(以新城疫病毒抗原NDV的免疫原性組合物為例)一、抗原的來源和製備(以NDV抗原為例)NDV為自新城疫病毒滅活疫苗經分離、純化的NDV抗原，其中雞新城疫病毒滅活疫苗來源於吉林省生物製品廠。
二、抗體的來源和製備(以蛋黃抗體NDV-IgY為例)NDV蛋黃抗體NDV-IgY的製備用具有免疫活性的純化NDV抗原作為免疫原，按照實施例1第二條中的2)、3)、4)步驟即可獲得蛋黃抗體NDV-IgY，用120ml蛋黃液共得到NDV-IgY1.2g，其收率為73％。
三、蛋黃抗體NDV-IgY特異性蛋黃抗獨特型抗體的製備用具有免疫活性的NDV-IgY為免疫原，按照實施例1第三條中的2)、3)、4)步驟即可獲得蛋黃抗體NDV-IgY特異性蛋黃抗獨特型抗體，用112ml蛋黃液共得到NDV-IgY特異性蛋黃抗獨特型抗體1.2g，其收率為67％。
四、特異性蛋黃抗體NDV-IgY和其特異性蛋黃抗獨特型抗體組合物的製備分別取上述實施例6第一條中製備的NDV和上述實施例6第二條中製備的蛋黃抗體NDV-IgY等量混合之，在加入等量完全佐劑而成為混合免疫原，按照實施例1第四條中的2)、3)、4)步驟即可獲得蛋黃抗體NDV-IgY和其特異性蛋黃抗獨特型抗體的組合物，用130ml蛋黃液共得到890mg，其收率為66％。
五、重組DNA的製備(以NDV重組DNA質粒為例)將雞新城疫病毒NDV的HN基因片斷插入到真核表達載體pIRES1的多克隆位點上，構建pIRHN重組表達載體，在此稱為NDV重組DNA質粒。
六、NDV免疫原性組合物的製備取實施例6第一條中製備的NDV 100mg、實施例6第二條中製備的NDV-IgY200mg、實施例6第三條中製備的NDV-IgY特異性蛋黃抗獨特型抗體100mg和實施例6第五條中製備的NDV重組DNA質粒500mg，將四者充分混合，然後加入氫氧化鋁佐劑500mg，充分混勻，再經過巴氏滅菌和除熱源處理後即為雞新城疫病毒NDV抗原特異性免疫原性組合物。
七、NDV免疫原性組合物注射劑的製備按照實施例6第六條中NDV免疫原性組合物的配方組成，取該組合物1.0g，再加入分子內佐劑棕櫚醯賴氨酸100mg，再加入藥用敷料海藻糖2.0g，充分混勻，待反應完全後再經過巴氏滅菌和除熱源處理後，冷凍乾燥或乾燥處理後裝安培、封口即成為注射劑。
下面就結合實驗例對本發明作進一步描述，但所述實驗例並不限制本發明。
實驗例1免疫原性組合物的性能檢測一、抗原、蛋黃抗體IgY和蛋黃抗獨特型抗體的效價檢測(以重組B肝表面抗原及其特異性蛋黃抗體IgY和蛋黃抗獨特型抗體組合物為例)1)方法原理重組B肝表面抗原的檢測採用ELISA雙抗體夾心法；B型肝炎表面抗原特異性蛋黃抗體IgY的檢測採用ELISA間接法，即以B型肝炎表面抗原液包被酶標板孔，採用辣根過氧化物酶標記的鼠抗雞IgY抗體作為二抗；B型肝炎表面抗體特異性蛋黃抗獨特型抗體的檢測採用ELISA雙抗體夾心法，即以B肝表面抗原特異性蛋黃抗體IgY包被酶標板孔，採用辣根過氧化物酶標記的B肝表面抗原特異性蛋黃抗體IgY作為標記抗體。
2)試劑材料a)包被緩衝液(PH9.6碳酸鹽緩衝液)取Na2CO30.16g和NaHCO30.29g，蒸餾水加至100ml；b)稀釋液(PH7.2磷酸鹽緩衝液)取Na2HPO4·12H2O2.9g、KH2PO40.2g、NaCL8.0g和KCL0.2g蒸餾水加至1000ml；c)封閉液取上述稀釋液500ml加入牛血清白蛋白2.5g和Tween-20 0.25ml即可；d)洗滌液取上述稀釋液200ml加入表面活性劑Tween-20 0.1ml即可；e)底物緩衝液(0.1mol/L PH5.0磷酸鹽-檸檬酸緩衝液)取Na2HPO4·12H2O 1.8g和檸檬酸0.52g，蒸餾水加至100ml，4℃存放，用前加H2O2；f)終止液(2.0mol/LH2SO4)取濃硫酸55.5ml加蒸餾水444.5ml即可；g)包被材料血源純化B肝表面抗原(HBsAg)和B型肝炎表面抗體(單克隆抗-HBs)均由北京科衛臨床診斷試劑廠提供；鼠抗雞IgY由北京成文免疫化學研究所提供，其中辣根過氧化物酶標記鼠抗雞IgY和單克隆抗-HBs自行按照過碘酸鈉法標記。
h)酶標反應底物用四甲基聯苯胺(TMB)。
3)試驗設備酶聯免疫檢測儀(國產Biocell2010型)、37℃水浴箱、48孔或96孔聚苯乙烯酶標板、微量移液器(50μl、100μl)4)間接法ELISA檢測操作步驟a)取包被材料血源純化B肝表面抗原(HBsAg)或B型肝炎表面抗體(單克隆抗-HBs)，用包被液稀釋成100μg/ml，取100μl/孔量分別加入聚苯乙烯酶標板孔中，於4℃吸附過夜；b)取上述已包被過夜的酶標板，用洗滌液洗3次，每次3分鐘；然後每孔加入200μl封閉液，於4℃封閉過夜；再用洗滌液洗3次，每次3分鐘；待幹後備用(如暫時不用置4℃存放)；c)分別取上述實施例1第二、三、四條中所製備的B肝特異性蛋黃抗體IgY、蛋黃抗獨特型抗體、蛋黃抗體IgY和蛋黃抗獨特型抗體的混合物，分別進行1∶1至1∶4096的比例稀釋，取各種不同的稀釋樣品分別加入各自相應的檢測酶標板孔中，每孔100μl，同時設立空白、陰性和陽性對照孔；d)於37℃孵育反應1小時後用洗滌液洗4次，每次5分鐘；e)每孔加入100μl辣根過氧化物酶標記的鼠抗雞IgY抗體(二抗)，37℃孵育反應1小時後用洗滌液洗5次，每次3分鐘；
f)配製底物溶液用前取0.1mol/L PH5.0磷酸鹽-檸檬酸緩衝液7.0ml，加入3％H2O290μl和10mg/ml的四甲基聯苯胺(TMB)溶液0.1ml，混勻避光備用；g)加入新配製的底物溶液100μl/孔，保溫15分鐘，然後加入終止液(2.0mol/LH2SO4)50μl/孔以終止反應；h)將酶標板放入酶聯免疫檢測儀中，波長450nm，以空白對照調零，讀取各孔吸光度(OD)值；i)結果計算按照公式P/N≥2.1為陽性，否則P/N≤2.1為陰性，其中P為待測標本OD值，N為陰性對照OD值。
5)結果判斷以P/N≥2.1為陽性的最大稀釋度作為其效價。
6)檢測結果按照上述間接法ELISA檢測操作對實施例1中第六條所製備的B肝特異性免疫原性組合物中各組成成分的效價進行測定，其檢測結果見表1。
二、重組質粒拷貝值(copy/ml)的檢測用螢光定量PCR(試劑由上海復星公司提供)方法。用本法對實施例1第六條中所製備的B肝特異性免疫原性組合物I中重組DNA質粒的效價進行測定，其檢測結果見表1。
表1B肝特異性免疫原性組合物I中各組分效價檢測結果

實驗結果表明B肝表面抗原的效價為1∶512，B型肝炎表面抗原特異性蛋黃抗體IgY的效價為1∶256，B肝特異性蛋黃抗獨特型抗體的效價為1∶128；B肝特異性重組DNA質粒3.8×107copy/ml。
二、免疫原性組合物中重組DNA的鑑定(以B肝表面抗原重組DNA質粒為例)重組質粒體外表達產物的鑑定重組質粒轉染293T細胞將生長期293T細胞鋪於100mm培養皿，分別取提純的pJW4303/HBV-S2.S及pJW4303(空載對照質粒)約20μg，用磷酸鈣沉澱法轉染293T細胞(一種用於瞬間轉染的人胚腎細胞系)，培養72h(37℃，5％CO2)。
表達產物的回收將培養皿中的細胞培養液以800r/min，離心5min後收集上清待測。同時收集細胞，用裂解劑裂解，4℃條件下12000r/min，離心1h後取上清待測。
表達產物的檢測用ELISA法檢測細胞培養液上清和細胞裂解產物上清中的HBsAg和preS2，測定值以450nm的吸光度A值表示。
實驗結果表明細胞培養液上清中HBsAg的效價為1∶32、preS2的效價為1∶16；細胞裂解產物上清中的HBsAg的效價為1∶2048、preS2的效價為1∶512。
三、蛋黃抗體IgY和蛋黃抗獨特型抗體的鑑定(以B肝蛋黃抗體IgY和蛋黃抗獨特型抗體為例)用聚丙烯醯胺凝膠(PADE)電泳(濃縮膠濃度為5％)對B型肝炎表面抗原特異性蛋黃抗體IgY和B型肝炎表面抗體特異性蛋黃抗獨特型抗體進行純度鑑定，電泳中均出現一條電泳帶，其純度≥95％。
用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠(SDS-PADE)電泳，分離膠長度為8％，濃縮膠濃度為5％，穩流10mA電泳5小時；測得B型肝炎表面抗原特異性蛋黃抗體IgY和B型肝炎表面抗體特異性蛋黃抗獨特型抗體的分子量均為180KD。
四、免疫原性組合物的穩定性試驗(以B肝特異性免疫原性組合物I為例)取上述實施例1第六條中所製備的B肝特異性免疫原性組合物I，以10mg/管分裝小試管中，分別於-20℃冰凍、4℃、室溫和37℃保存，其中37℃保存屬於熱破壞性試驗。再定期進行其效價檢測。實驗結果表明B肝特異性免疫原性組合物於4℃保存，其穩定性至少可保持12個月以上；於-20℃冰凍保存，其穩定性至少可保持6個月以上；於室溫(20℃)保存，其穩定性至少可保持2個月以上。該免疫原性組合物I以4℃保存穩定性最好。
五、免疫原性組合物中特異性複合物的檢測(以B肝特異性免疫原性組合物I為例)用4％的聚乙二醇6000(PEG6000)檢測上述實施例1中第六條所製備的B肝特異性免疫原性組合物I中特異性複合物的含量將4％PEG6000溶液與1∶100稀釋的待檢免疫原性組合物溶液混合，置4℃冰箱過夜後離心，將沉澱物用4％PEG6000溶液充分洗滌，重新溶解於0.01mol/L的NaOH中，在波長280nm下測量溶液的吸光度；也可利用散射比濁法直接測定PEG沉澱的免疫複合物；以不同濃度的熱聚合IgG作為參考標準來計算免疫複合物的含量。結果表明B肝特異性免疫原性組合物I中的免疫複合物佔45％另取上述B肝特異性免疫原性組合物I經瓊脂擴散和免疫印跡鑑定含有B型肝炎表面抗原-蛋黃抗體IgY-蛋黃抗獨特型抗體的特異性免疫結合複合物和B型肝炎表面抗原特異性蛋黃抗體IgY-蛋黃抗獨特型抗體的特異性免疫結合複合物。
六、免疫原性組合物生物安全性試驗(以B肝特異性免疫原性組合物I為例)毒性實驗用體重18-20g小白鼠10隻，每腹腔注射上述實施例1中第六條所製備的B肝特異性免疫原性組合物I0.5ml(6.0mg/ml)，連續觀察7天，小白鼠的體重無一例減輕，無一例死亡，亦未發現任何不良反應。B肝特異性免疫原性組合物的毒性實驗表明該免疫原性組合物具有較高的生物安全性。
實驗例2鴨B型肝炎病毒感染模型的製備用B型肝炎病毒DNA陽性血清150μl對15日齡雛鴨進行腹腔注射，每隔15天對鴨血清進行B型肝炎病毒表面抗原(用雙抗體夾心ELISA法)和B型肝炎病毒DNA(用聚合酶鏈反應法)檢測，以持續3個月鴨B型肝炎病毒表面抗原和B型肝炎病毒DNA均為陽性作為鴨B型肝炎病毒感染模型成功建立的標誌。
實驗例3B肝特異性免疫原性組合物I的動物試驗用上述實施例1中第六條所製備的B肝特異性免疫原性組合物I對鴨B型肝炎病毒感染模型進行動物實驗，其中鴨血清B肝表面抗原滴度(IU/ml)和鴨血清B肝表面抗體滴度(IU/ml)的檢測用雙夾心ELISA法(試劑均由上海榮盛生物技術試劑有限公司提供)，鴨血清B肝DNA拷貝值(copy/ml)的檢測用螢光定量PCR(試劑由上海復星公司提供)方法；其實驗結果見表2。
表2實施例1製備的B肝特異性免疫原性組合物的動物試驗結果

實驗結果表明實驗組用皮下注射B肝特異性免疫原性組合物I的B型肝炎病毒感染鴨，在經過三周的免疫注射後，用ELISA檢測感染鴨血清中的B型肝炎表面抗原，其轉陰率為50％；用聚合酶鏈反應(PCR)檢測感染鴨血清中的B型肝炎病毒DNA，其轉陰率為50％；用ELISA檢測感染鴨血清中的B型肝炎表面抗體，其轉陽率為40％。而對照組(對感染鴨皮下注射人用重組B肝疫苗)感染鴨血清中B型肝炎表面抗原的轉陰率僅為10％、B型肝炎病毒DNA的轉陰率僅為20％、B型肝炎表面抗體的轉陽率僅為10％。
上述實驗結果證明本B肝特異性免疫原性組合物I的治療作用具有特異性強、毒副作用小等優點；該B肝特異性免疫原性組合物I中的B肝表面抗原、蛋黃抗體IgY和蛋黃抗獨特型抗體及其免疫複合物更有利於抗獨特型抗體模擬「內影像」抗原性的提呈，並且上述B肝特異性免疫原性組合物I及其免疫複合物比單純採用B肝疫苗可誘生更高滴度的抗體產生和淋巴細胞增殖反應，從而更有效地誘生體液和細胞免疫反應，以達到對抗B肝病毒保護肝臟組織細胞的目的。
實驗例4B肝特異性免疫原性組合物的臨床初步應用結果通過對31例B肝患者(其中慢性B肝23例，活動性B肝10例，B肝病毒攜帶者8例)分別給予單獨藥物(幹擾素300萬單位)、實施例1中第六條所製備B肝特異性免疫原性組合物I(稱組合物I)和實施例1中第八條所製備B肝特異性免疫原性組合物II(稱組合物II)，並進行療效觀察和比較。實驗結果表明B肝病毒表面抗原HBsAg轉陰率組合物8(58.1％)明顯高於組合物6)(38.7％)和單獨藥物組(9.7％)；B肝病毒HBeAg轉陰率後兩組(54.8％)明顯優於單獨藥物組(12.9％)；B肝病毒HBVDNA轉陰率後兩組(51.6％)明顯優於單獨藥物組(6.5％)；後兩組患者血清ALT、DBIL及TNF-α水平明顯低於單獨藥物組。表明B肝表面抗原特異性蛋黃抗體IgY-氧化苦參鹼導向治療具有特異性強、毒副作用小等優點；本B肝特異性免疫原性組合物II不僅具有免疫原性組合物I所具備的免疫協調和治療作用，能夠產生激活機體細胞及體液免疫的雙重作用，而且該免疫原性組合物II還具有針對於B肝病毒的生物飛彈功能，因此對於B肝病毒具有更強的特異性靶向殺傷能力，從而達到對抗B肝病毒保護肝臟組織細胞的目的。
權利要求
1.一種預防和治療疾病的免疫原性組合物，主要是由抗原、抗體和重組DNA組成，其特徵在於由有效量的抗原、抗體、抗獨特型抗體、重組DNA和藥用敷料組成，其中抗原、抗體、抗獨特型抗體是純化或重組的特異性抗原、抗體、抗獨特型抗體；重組DNA是能夠表達所述特異性抗原、抗體和抗獨特型抗體中的任一種或其多種的重組DNA質粒；其中各組分重量比分別為抗原 0.001～99％抗體 0.001～99％抗獨特型抗體 0.001～99％重組DNA0.01～99％藥用敷料 0.01～99％
2.根據權利要求1所述的免疫原性組合物，其特徵在於；在該免疫原性組合物中還含有特異性抗原Ag、抗體Ab和抗獨特型抗體Ab2特異性結合後所形成的免疫複合物；所述抗獨特型抗體包括Ab2α、Ab2β、Ab2γ、Ab2ε中的任一種或其組合；所述免疫複合物包括抗原-抗體複合物Ag-Ab、抗原-抗體-抗獨特型抗體複合物Ag-Ab-Ab2α、Ag-Ab-Ab2β、Ag-Ab-Ab2γ、Ag-Ab-Ab2ε和抗體-抗獨特型抗體複合物Ab-Ab2α、Ab-Ab2β、Ab-Ab2γAb-Ab2ε中的任一種或其組合。
3.根據權利要求1或2所述的免疫原性組合物，其特徵在於所述抗原、抗體、抗獨特型抗體和重組DNA是分別針對於同一種或同一類疾病相應免疫原的動物源性或人源性特異性抗原、抗體、抗獨特型抗體和重組DNA；所述抗原、抗體、抗獨特型抗體是通過分離、純化和基因工程技術包括噬菌體展示多肽、細菌表面展示多肽和人工合成多肽中的任一種或其組合途徑獲得的；所述抗原、抗體、抗獨特型抗體和重組DNA是針對於腫瘤免疫原、傳染性疾病病原體免疫原、自身免疫病免疫原、過敏性疾病變應原、移植器官免疫原和畜禽傳染病病原體免疫原的動物源性或人源性抗原、抗體、抗獨特型抗體和重組DNA；所述抗獨特型抗體是針對於上述免疫原所對應的特異性抗體包括蛋黃抗體IgY的抗獨特型抗體Ab2α、Ab2β、Ab2γ和Ab2ε中的任一種或其組合物；所述重組DNA是能夠表達上述疾病特異性抗原、抗體、抗獨特型抗體的重組DNA；所述免疫原包括惡性腫瘤、傳染性疾病、自身免疫病、過敏性疾病、器官移植排斥和畜禽傳染病病原體特異性的純化或重組抗原、抗體、抗獨特型抗體、重組DNA、組織細胞和細胞因子及其受體；所述免疫原是蛋白質、多肽、粘多糖、脂多糖、糖蛋白、細胞核、細胞質、細胞膜、細胞表面受體、核蛋白、DNA、RNA、線粒體、微粒體中的任一種或其組合。
4.根據權利要求1或2所述的免疫原性組合物，其特徵在於所述免疫原性組合物包括腫瘤特異性免疫原性組合物、傳染性疾病病原體特異性免疫原性組合物、自身免疫病特異性免疫原性組合物、過敏性疾病變應原特異性免疫原性組合物、移植器官特異性免疫原性組合物中的任一種或其組合；所述免疫原性組合物包括畜禽傳染病病原體特異性免疫原性組合物；所述免疫原性組合物是其納米微粒或脂質體複合物。
5.根據權利要求1或2所述的免疫原性組合物，其特徵在於在該免疫原性組合物中還含有藥用輔料；所述藥用輔料包括包衣材料、蛋白穩定劑、藥用佐劑、免疫增強劑，其中包衣材料為丙烯酸樹脂、羥丙基甲基纖維素及其衍生物；蛋白穩定劑為聚乙二醇、蔗糖、海藻糖；藥用佐劑為氫氧化鋁、表面活性劑、福氏佐劑；免疫增強劑為多聚糖、糖肽、糖脂和磷脂，其中脂類包括三棕櫚醯絲氨醯甘油基半胱氨酸、單棕櫚脂酸、雙棕櫚脂酸、三棕櫚脂酸、棕櫚醯賴氨酸、α-氨基十六烷酸、月桂醯肽脂中的任一種；所述脂類是以分子內佐劑的形式與上述免疫原性組合物中的特異性抗原、抗體、抗獨特型抗體和重組DNA結合成複合物。
6.根據權利要求1或2所述的免疫原性組合物，其特徵在於在該免疫原性組合物中還含有免疫偶聯物；所述免疫偶聯物包括上述疾病病原體特異性抗體與放射性核素、藥物和毒素以及細胞因子的偶聯物中的任一種或其組合；其中所述放射性核素包括碘131I、磷32P、鍶89Sr、釔90Y、釤153Sm、錸188Re中的任一種或其組合；所述藥物包括抗癌藥物、抗病毒藥物、抗菌素、免疫調節藥物和免疫抑制劑中的任一種或其組合；所述毒素包括包括篦麻籽毒素、相思子毒素、苦瓜毒素、氧化苦參鹼、去甲斑蝥素、白喉毒素、假單胞菌內毒素以及綠膿桿菌外毒素中的任一種或其組合；所述細胞因子包括白細胞介素、集落刺激因子、腫瘤壞死因子、趨化因子中的任一種或其組合。
7.根據權利要求1或2所述的免疫原性組合物，其特徵在於該免疫原性組合物是任一種藥劑學上所述的劑型；所述劑型包括注射劑、膠囊、口服液、氣霧劑、貼劑中的任一種劑型。
8.一種預防和治療疾病的免疫原性組合物的製備方法，其特徵在於包括以下步驟1)採用蛋白質鹽析、柱層析純化疾病特異性抗原或通過基因重組的辦法製備疾病病原體特異性抗原；所述疾病病原體特異性抗原包括人類腫瘤、傳染性疾病、自身免疫病、器官移植排斥及畜禽傳染病病原體的純化或重組特異性抗原；即得到該免疫原性組合物組分之一抗原；2)通過免疫動物製備針對於上述抗原的單克隆或多克隆抗體；或通過基因重組的辦法製備上述疾病相關病原體抗原的特異性抗體；即得到該免疫原性組合物組分之一抗體；3)以步驟1)製備的疾病相關病原體特異性抗原為免疫原，多次重複免疫注射給禽類優選是雞，待5-20天後禽類尤其是雞的產蛋中即含有針對於上述疾病相關病原體特異性免疫原的蛋黃抗體IgY；所述的免疫原注射量為1-2ml，免疫原量10-500μg/ml+等量完全弗氏佐劑；4)禽蛋尤其是雞蛋去殼取黃，經滅菌處理後，先用5倍體積的0.1mol/L PH7.2磷酸鹽-海藻糖稀釋液稀釋蛋黃；然後自-20℃到室溫反覆凍融，每分鐘500-1000轉低速離心後合併上清液備用；再向上清液中加入乙醇至終濃度為30-50％，靜置沉澱後，取沉澱備用；最後取沉澱通過進一步浸提、萃取、濃縮、純化、冷凍或噴霧乾燥，即得到該免疫原性組合物組分之一蛋黃抗體IgY；5)取步驟2)製備的針對於上述病原體抗原的抗體或步驟4)製備的蛋黃抗體IgY為免疫原，多次重複免疫注射給禽類優選是雞，待5-20天後禽類尤其是雞的產蛋中即含有針對於上述相應抗體包括蛋黃抗體IgY的蛋黃抗獨特型抗體；所述的免疫原抗體Ab1的注射量為1-2ml，免疫原抗體Ab1的用量為10-2000μg/ml+等量完全弗氏佐劑；6)重複步驟4)的過程，即得到該免疫原性組合物組分之一蛋黃抗獨特型抗體；7)取特異性基因片段經過聚合酶鏈反應後，提取和純化表達上述疾病特異性抗原、抗體和抗獨特型抗體的DNA片段，通過酶切後，與相應分子克隆載體重組，構建成上述疾病特異性抗原、抗體和抗獨特型抗體的真核表達質粒，即得到該免疫原性組合物組分之一重組DNA；8)根據實際需要按重量配比調製步驟1)所得的抗原、步驟2)所得的抗體或步驟4)所得的蛋黃抗體IgY、步驟6)所得的蛋黃抗獨特型抗體和步驟7)所得的重組DNA，再輔以可接受量的藥用輔料即得到所述的免疫原性組合物，其中各組分重量比分別為抗原0.001～99％抗體0.001 ～99％抗獨特型抗體0.001～99％重組DNA 0.01～99％藥用敷料0.01～99％9)取步驟8)製備的免疫原性組合物經過無菌、安全及毒性試驗合格後，再通過相應的製劑工藝製備成藥劑學上相應的劑型；所述劑型包括注射劑、膠囊、口服液、氣霧劑、貼劑中的任一種劑型。
9.根據權利要求8所述的方法，其特徵在於包括以下步驟1)提取純化或重組疾病相關病原體特異性抗原；2)提取純化或重組疾病相關病原體特異性抗體；3)分別取上述抗原和抗體包括蛋黃抗體IgY作為免疫原，分別連續或同時多次重複免疫注射給禽類優選是雞；還可將上述抗原和抗體包括蛋黃抗體IgY按1∶1比例混合後作為免疫原進行免疫注射；待5-20天後禽類尤其是雞的產蛋中即同時含有針對於上述抗原的蛋黃抗體IgY和針對於上述抗體包括蛋黃抗體IgY的特異性蛋黃抗獨特型抗體；4)取上一步驟所得的禽蛋或雞蛋，經滅菌處理後，先用5倍體積的0.1mol/L PH7.2磷酸鹽-海藻糖稀釋液稀釋蛋黃；然後自-20℃到室溫反覆凍融，每分鐘500-1000轉低速離心後合併上清液備用；再向上清液中加入乙醇至終濃度為30-50％，靜置沉澱後，取沉澱備用；最後取沉澱通過進一步浸提、萃取、濃縮、純化、冷凍或噴霧乾燥；如此一次性提取純化，可同時得到蛋黃抗體IgY和蛋黃抗獨特型抗體組合物；5)取特異性基因片段經過聚合酶鏈反應後，提取和純化表達上述疾病特異性抗原、抗體和抗獨特型抗體的DNA片段，通過酶切後，與相應分子克隆載體重組，構建成上述疾病特異性抗原、抗體和抗獨特型抗體的真核表達質粒，即得到該免疫原性組合物組分之一重組DNA；6)根據實際需要按重量配比調製步驟1)所得的抗原、步驟2)所得的抗體、步驟4)所得的蛋黃抗體IgY和蛋黃抗獨特型抗體組合物和步驟5)所得的重組DNA，再輔以可接受量的藥用輔料即得到所述的免疫原性組合物，其中各組分重量比分別為抗原 0.001～99％抗體 0.001～99％抗獨特型抗體 0.001～99％重組DNA0.01～99％藥用敷料 0.01～99％7)取步驟6)製備的免疫原性組合物經過無菌、安全及毒性試驗合格後，再根據實際需要，通過相應的製劑工藝製備成藥劑學上相應的劑型；所述劑型包括注射劑、膠囊、口服液、氣霧劑、貼劑中的任一種劑型。
10.根據權利要求1-2或8-9所述的免疫原性組合物的用途，其特徵在於應用於製備疾病生物預防和治療劑以及食品、保健品添加劑，特別是應用於製備人類惡性腫瘤、傳染性疾病、自身免疫病、過敏性疾病和器官移植排斥的治療性疫苗以及食品、保健品添加劑；應用於製備畜禽傳染病的治療性疫苗以及畜禽飼料添加劑。
全文摘要
本發明涉及一種預防和治療疾病的免疫原性組合物及其製備方法，主要是由特異性抗原、抗體、抗獨特型抗體、重組DNA和藥用敷料組成。本發明具有療效確切、特異性強、決定簇廣並能進行集約化大規模生產的優點，尤其是能避免HAMA反應和異質性問題，且無毒副作用、安全性好。適用於作為人類惡性腫瘤、傳染性疾病、自身免疫病、過敏性疾病和器官移植排斥的治療性疫苗以及食品、保健品添加劑；還適用於作為畜禽傳染病的治療性疫苗以及畜禽飼料添加劑。
文檔編號A61K9/48GK1557487SQ20041000117
公開日2004年12月29日 申請日期2004年1月29日 優先權日2004年1月29日
發明者郭佔軍, 趙華, 郭愛芹, 楊煥雲, 趙歧剛, 關濤, 吳軍英, 趙清秀 申請人:郭佔軍