自身免疫病相關蛋黃抗體製備方法及其應用的製作方法

2023-12-09 06:35:11 3

專利名稱：自身免疫病相關蛋黃抗體製備方法及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於生物技術領域，特別是涉及自身免疫病相關蛋黃抗體製備方法，另外還涉及該蛋黃抗體的用途。
上述單克隆抗體(簡稱單抗)或多單克隆抗體(簡稱多抗)作為自身免疫病的診斷劑或檢測劑，近年來已在生物醫學領域得到廣泛應用。該類方法的原理是基於單抗或多抗對相應自身免疫病相關抗原的高特異性識別能力而設計的，結合以相應的標記物(酶標、金標、硒標、螢光、發光和放射性標記等)而顯示自身免疫病相關抗原或抗體的存在與否及其量的多少。
單抗作為治療劑的研究也於近年獲得重要進展。單抗藥物(monoclonal antibody agents)可應用於治療腫瘤、病毒性感染、心血管病以及其它疾患，尤其是用於自身免疫病的治療，已顯示出良好的前景。
抗體藥物一般包括兩類，一是單抗或多抗；二是單抗或多抗偶聯物，或稱免疫偶聯物(immunoconjugate)。免疫偶聯物分子由單抗或多抗與「彈頭」藥物兩部分構成，故稱為導向藥物，又稱為生物飛彈或「魔彈」(magic bullets)，與之相對應的治療方法稱為導向治療。單抗或多抗所針對的靶標通常為致病性相關抗原或特定的受體。用作「彈頭」的物質主要有四類，即放射性核素、藥物和毒素，其與單抗或多抗連接分別構成放射免疫偶聯物、化學藥物免疫偶聯物、細胞因子免疫偶聯物和免疫毒素。自80年代以來對抗病原體尤其是抗腫瘤單抗藥物進行了大量研究，特別是自1997年以來，Rituxan、Herceptin在美國相繼獲批准用於臨床腫瘤治療，單抗藥物的研究與開發有了新的發展勢頭，成為生物技術藥物的新熱點(甄永蘇，單克隆抗體藥物治療腫瘤的研究現狀與展望，中國醫學科學院學報，2000，229-12)。針對於自身免疫病的單抗藥物可有效幹預病理性自身免疫過程，從而達到治療自身免疫病的目的(董志偉、王琰主編，抗體工程，北京醫科大學出版社，2002年6月第二版第254-258頁)。
儘管單抗藥物的臨床研究結果已為其應用於臨床治療展示出良好的前景，但仍有許多問題需要進一步研究解決(Nguyen DT，Amess JA，Doughty H，et al.IDEC-C2B8 anti-CD20(rituximab)immunotherapy in patients with low-grade non-Hodgkin′s lymphoma and lymphoproli ferative disordersevaluation ofresponse on 48 patients Eur J Haematol，1999，6276-82)。單抗藥物存在的問題主要涉及免疫學和藥理學兩方面。免疫學方面的問題關鍵是人抗鼠Ig抗體(HAMA)反應，因為多年來用於臨床研究的單抗藥物多數使用小鼠單抗製備，往往導致HAMA反應。此外，致病性相關抗原在抗原性方面的異質性及其抗原性調變等也能影響單抗藥物的療效。藥理學方面的問題主要是到達病變部位的藥量不足。單抗藥物在體內運送過程中受多種因素影響。由於它是異體蛋白，會被機體網狀內皮系統攝取，有相當數量將積聚於肝、脾和骨髓；再者就是機體對該異體蛋白產生抗體而降低其效力。單抗藥物是大分子物質，通過毛細血管內皮層以及穿透病變部位均受到限制。(甄永蘇，單克隆抗體藥物治療腫瘤的研究現狀與展望，中國醫學科學院學報，2000，229-12)。
自身免疫(autoimmunity)是指機體免疫系統對自身成分發生免疫應答，產生自身抗體和(或)自身致敏淋巴細胞的現象。自身免疫病(autoimmune diseases)是因機體免疫系統對自身成分發生免疫應答而導致的疾病狀態。該病多為慢性病，任何年齡、性別均可發病，女性多見。該病是危害人類健康的重要疾病。其發病機理是基於自身反應輔助性T細胞(CD4)的活化(mobilization of self-reactive helper T cell)所引起的一系列病理性免疫反應。輔助性T細胞依其分泌的細胞因子的類型分為二個亞群-TH1和TH2。TH1產生白介素-2(IL-2)和γ-幹擾素，參與對細胞內病原體的防禦。TH2以產生IL-4、IL-5及IL-10為特徵，主要作用在於通過促進抗體的產生而對細胞外的入侵者起抵禦作用。TH2造成的破壞作用相對較小。
TH1亞群促進細胞免疫的產生，為甲狀腺炎和胰島素依賴型糖尿病等器官特異性自身免疫病最為突出的發病特徵。其發病機制涉及巨噬細胞的激活，細胞毒性CD8淋巴細胞的生成，以及釋放可引起細胞損傷的介質如腫瘤壞死因子(TNF-α及TNF-β)。
TH2分泌的細胞因子促進體液免疫反應而致病，最常見於血液病和狼瘡。自身抗體與靶細胞結合，通過介導補體溶解細胞，或通過調理作用促進細胞吞噬，這是抗體對靶細胞的直接效應。也可形成免疫複合物沉積於血管床，激活補體系統並誘發炎症反應，引起狼瘡樣病。抗體依賴性細胞毒作用(antibody dependent cellular cytotoxicity，ADCC)，則是特異性抗體與非特異性細胞毒細胞合作的結果。此外，很重要的一部分自身免疫病是由細胞表面受體的抗體介導。這些自身抗體阻礙著受體功能，例如重症肌無力中的乙醯膽鹼受體。自身抗體還可以擬似自然激素並刺激受體，如抗TSH受體的抗體模擬TSH的作用，導致Graves病甲狀腺功能亢進症。
由此可見，自身免疫病的觸發途徑及效應方式多種多樣，但從觸發到致病效應階段有一共同通路。即抗原特異性自身反應輔助T細胞。儘管這些特異性T細胞在浸潤細胞群中佔很少比例，但對為數眾多的非特異性細胞卻有著舉足輕重的調控作用。因此，若要發展終止自身免疫反應的特異性療法，顯然T細胞是主要的靶細胞。
對於自身免疫病的治療，目前只能對症處理，尚無根治辦法。總的來說，免疫治療方法有三大類(1)全身性免疫抑制通過藥物抑制自身免疫反應的致病性而達到治療自身免疫病，主要有抗代謝藥、糖皮質激素及抗炎藥，這些藥物的副作用已是眾所周知。這是當前主要的治療方法，它在多個水平幹擾整個免疫系統。(2)選擇性免疫療法它被設計用來幹擾免疫系統的內在機制，對免疫過程的幹擾是不連續的，以恢復喪失的功能，如給胰島素依賴型糖尿病者補充胰島素以替代損傷的胰島素β-細胞功能，但這類治療需終身維持。(3)抗原特異性免疫療法這是一種理想的治療方法，該療法不是幹擾整個免疫系統，而是去活化或抑制抗原特異性T細胞，從而特異地抑制病理性自身免疫反應。
迄今，人們已能有效地利用很多藥物和手段上調或下調免疫系統的特定部分，但它們皆有明顯的缺點或是在免疫系統的多個水平上起幹擾作用，或有副作用，甚或兼具兩個缺點。對理想免疫療法的要求是特異、無毒及對病理性免疫反應長時期的去除。新的治療策略將更為精確地在特定的免疫機制水平上起阻遏作用，而最終的目的是只特異地攻擊那些參與自身免疫病病理過程的細胞。
近年來，針對自身反應性輔助T細胞的新療法正在形成，包括T細胞疫苗、MHC阻斷劑、輔助刺激阻斷劑(costimulating blockage)、調節TH1-TH2比例以及口服抗原誘導免疫耐受等。
T細胞疫苗(T Cell Vaccine，TCV)是指用化學或物理方法滅活的致病性T細胞。使其失去致病能力，但保持了活化致病性T細胞的免疫特徵。研究證明，把引起自身免疫性疾病的自身反應性T細胞或導致同種移植排斥反應的同種反應性T細胞製備成TCV，免疫動物後能夠誘導機體產生針對致病性T細胞的免疫應答。可以消除或減輕這些細胞的致病作用或反應能力，表現為對自身免疫性疾病的防治作用和誘導同種移植物質延長存活。早期動物實驗提示，用滅活自身反應T細胞克隆作「疫苗」，注射給尚未發生自身免疫反應的動物，可以出現針對該T細胞受體的免疫反應。更新的研究則分離此類T細胞受體或其主要結合序列，並用來誘導主動免疫。這就是所謂T細胞疫苗。
MHC阻斷劑T細胞發生反應不僅需接受被呈遞的抗原多肽刺激，同時需要MHC II類抗原參與，即所謂MHC限制。因此，若能阻斷自身抗原多肽與抗原呈遞細胞(如巨噬細胞)的MHC分子結合，就能防止T細胞被激活。MHC阻斷劑就是指競爭性與MHC結合但不觸發T細胞增殖的多肽，有阻止特異性免疫反應的作用，通過抑制特異性自身反應T細胞而達到治療目的。
輔助刺激阻斷劑(costimulating blockage)T細胞的激活，在通過受體識別抗原決定簇的同時，還要接受刺激信號。若未收到輔助刺激信號，T細胞就不會被激活。中斷輔助刺激信號為抑制自身免疫反應提供了另外一條途徑。該法優點是不需鑑定致病特定抗原，但有普遍抑制免疫和炎症反應的缺點。
調節TH1-TH2平衡治療自身免疫病的另一可能途徑，是調節TH1和TH2的平衡，使T細胞向破壞性較少的TH2分化。給予特定細胞因子或其抑制劑，將能取得這種效果。由於細胞因子網絡的複雜性，該領域的研究才剛剛起步。
口服抗原誘導免疫耐受針對自身抗原的免疫無反應狀態稱為自然耐受(naturaltolerance)或自身耐受(seif-tolerance)；針對外源性抗原的免疫無反應狀態稱為獲得性耐受(acquired tolerance)。自身耐受狀態的消失將導致自身免疫性疾病。口服免疫耐受，簡稱口服耐受(oral tolerance)，是指通過消化系統攝入外源性抗原誘導外周免疫系統產生抗原特異性無反應狀態。口服耐受為恢復和維持正常的自身耐受提供了一條自然途徑，具有簡便、有效、安全和無毒性等特點，近來已成功地用於某些自身免疫性疾病的實驗和臨床治療。用該法治療多發性硬化、類風溼關節炎、糖尿病及葡萄膜炎等幾種自身免疫病已進入臨床研究階段。
以上技術方案多採用鼠源性單抗或多抗，近年來，為了避免或減少HAMA反應，通常是使鼠源性單抗人源化或研製完全的人源抗體。單抗人源化主要是通過基因工程技術製備嵌合抗體(chimeric antibody)或改形抗體(reshaping antibody)。嵌合抗體是將Fc段置換為人源性，其它部分仍為鼠源性。改形抗體是指除互補決定區(CDR)為鼠源性外，其它部分均為人源性。另外使偶聯物分子小型化，以提高藥物對病變部位的滲透力，研製高效單抗藥物；局部注射以提高單抗藥物在病變部位的濃度；多種抗體混合應用以彌補單抗的異質性問題。其中鼠源性單抗人源化和研製完全的人源抗體具有較高的技術難度，難於普及應用。
禽類尤其是雞在系統發育上與哺乳動物有很大差異，雞的免疫球蛋白與哺乳動物免疫球蛋白在免疫學特性上也有很大不同。雞的免疫系統能識別更多的免疫反應位點和更多的抗原決定簇，因此雞免疫系統對哺乳動物的蛋白或生物分子能產生具有更高效價和親和力的特異性抗體。雞免疫系統針對於外源性蛋白所產生的IgY不僅具有更高的免疫特異性，更重要的是這種特異性IgY主要儲存在雞蛋黃中，因此可利用下蛋母雞作為免疫反應器來大量生產具有重要臨床應用價值的抗體藥物。
眾所周知雞蛋作為人類的常用食品和化妝品原料，無論內服和外用均對人體無任何生物毒性和不良作用。因此，利用禽類作為免疫反應器來大量生產抗體藥物，並應用於自身免疫病的診斷和免疫治療，將具有極廣闊的應用前景。以自身免疫病相關蛋黃抗體IgY為原料製備的免疫藥物和抗獨特型抗體疫苗(Ab2疫苗)可以很好地解決上述單抗偶聯物或上述T細胞疫苗所存在的HAMA反應和異質性問題。
發明目的本發明的目的在於克服上述缺點與不足，提供一種自身免疫病相關蛋黃抗體製備方法，包括針對於自身免疫病相關免疫原的蛋黃多克隆抗體IgY、抗獨特型抗體Ab2α、Ab2β、Ab2γ和Ab2ε和自身免疫病特異性表達抗原的製備方法，另外還涉及該蛋黃抗體的用途即採用該蛋黃抗體製備相關藥物、食品、飲料和保健品。技術方案本發明的技術方案是這樣實現的一種自身免疫病相關蛋黃抗體製備方法是利用禽類作為免疫反應器，通過將自身免疫病特異性免疫原(包括自身抗原、純化或重組抗原或疫苗、細胞因子靶向抗原、自身免疫病特異性DNA或mRNA及其與相應載體組成的重組體、針對於自身免疫病特異性抗原和細胞因子靶向抗原的單克隆或多克隆抗體)或其組合物單獨或聯合注射給產蛋禽類尤其是雞，使其產生針對於上述自身免疫病特異性免疫原的蛋黃抗體IgY、抗獨特型抗體(包括Ab2α、Ab2β、Ab2γ和Ab2ε)、自身免疫病特異性表達抗原中的任一種或其組合物而被大量地輸送到蛋黃中儲存，然後無創性地利用蛋黃提純所需要的抗體藥物(包括自身免疫病特異性蛋黃抗體IgY、自身免疫病特異性表達抗原和抗獨特型抗體Ab2α、Ab2β、Ab2γ和Ab2ε中的任一種或其組合物)。利用該蛋黃抗體中的IgY抗體為主要原料可製備針對於自身免疫病特異性抗原的免疫診斷藥劑和免疫治療藥劑，包括自身免疫病體外診斷試劑、體內導向診斷試劑和特異性蛋黃抗體免疫治療劑以及特異性蛋黃抗體偶聯藥物或毒素的導向藥物即生物飛彈；利用該蛋黃抗體中的自身免疫病特異性表達抗原可製備針對於自身免疫病的免疫診斷藥劑和免疫治療藥劑，包括自身免疫病體外診斷試劑和自身免疫病特異性T細胞疫苗；利用該蛋黃抗體中的抗獨特型抗體Ab2α、Ab2β、Ab2γ和Ab2ε為主要原料可製備針對於自身免疫病的免疫診斷藥劑和免疫治療藥劑，包括自身免疫病外診斷試劑、體內導向診斷試劑(主要採用Ab2α)、抗獨特型抗體Ab2α偶聯藥物或毒素的導向藥物即抗獨特型生物飛彈和抗獨特型抗體疫苗(主要採用Ab2β和Ab2γ)和自身免疫病雙特異性免疫治療劑(主要採用Ab2ε)；用於自身免疫病的診斷、免疫治療和導向治療。另外該蛋黃抗體還可作為添加劑添加於食品、飲料及保健品中，用於自身免疫病的預防及早期預防性治療。
由於採用本發明方法製備自身免疫病相關蛋黃抗體，利用雞免疫系統對異源性蛋白或生物分子能產生具有更高效價和親和力的特異性抗體，可誘導高滴度的特異性抗體，且具有成本低、產量高、特異性強、決定簇廣並能進行集約化大規模生產的優點，更重要的是該蛋黃抗體能夠很好地解決上述鼠源性單抗偶聯物或T細胞疫苗所存在的HAMA反應和異質性問題，且對人體無毒副作用，具有較好的安全性。另外，本發明所製備的自身免疫病相關蛋黃抗體或其組合物可用作自身免疫病相關診斷試劑的原料，尤其是自身免疫病相關生物晶片尤其是蛋白質晶片的原料；再者就是本發明所製備的自身免疫病相關蛋黃抗體或其組合物能夠在免疫抑制和免疫耐受兩方面共同發揮其免疫調節和治療作用。本發明適用於自身免疫病的免疫診斷、免疫治療和預防，尤其適用於對人類具有極大危害性自身免疫病如多發性硬化症、類風溼關節炎、強直性脊柱炎、系統性紅斑狼瘡、混合結締組織病、胰島素依賴性糖尿病、自身免疫性溶血性貧血、甲狀腺功能亢進症、橋本甲狀腺炎、乾燥症候群等疾病的免疫抑制和免疫耐受治療，將具有極其廣闊的應用前景。
為了進一步公開本發明，下就對本發明進行更進一步的詳細描述。
一種自身免疫病相關蛋黃抗體製備方法，其特徵在於以產蛋禽類尤其是雞作為免疫反應器，用一種或多種純化或通過基因工程技術重組的自身免疫病特異性抗原或疫苗、或細胞因子靶向抗原、或自身免疫病特異性DNA或mRNA及其與相應載體組成的重組體、或針對於自身免疫病特異性抗原或細胞因子靶向抗原的單克隆或多克隆抗體、或它們的脂質體或納米微粒複合物作為免疫原，分別單獨進行或多種聯合進行禽類尤其是雞的多次重複免疫注射，然後再以不完全佐劑進行追加強化反應，待5-20天後禽類尤其是雞的產蛋中即有針對於上述自身免疫病相關免疫原的多克隆抗體IgY、抗獨特型抗體Ab2α、Ab2β、Ab2γ和Ab2ε、自身免疫病特異性表達抗原中的任一種或其組合物存在和儲存。其具體步驟包括a)自身免疫病相關免疫原或其組合物進行多次免疫注射禽類優選為雞。在此所述的免疫原是採用純化的自身免疫病相關抗原或通過基因工程技術重組的自身免疫病特異性抗原或疫苗、細胞因子靶向抗原、通過提取純化的自身免疫病特異性裸DNA或mRNA及其與相應載體組成的重組體、自身免疫病特異性抗原和細胞因子靶向抗原的單克隆或多克隆抗體，另外還包括上述自身免疫病相關免疫原的脂質體微粒甚至是納米微粒的免疫注射，藉助於脂質體對組織和細胞的親和性以強化免疫效果；所述禽類包括雞、鴨、鵝、鵪鶉，首選是雞；注射部位包括肌肉、皮下、皮內、血管和生殖腔囊；注射方法包括將上述自身免疫病相關免疫原單獨進行注射和多種自身免疫病相關免疫原聯合進行多次重複免疫注射，其中所述的多種自身免疫病相關免疫原聯合進行免疫注射包括用不同種類和來源的自身免疫病相關抗原、基因重組自身免疫病特異性抗原或疫苗、細胞因子靶向抗原、自身免疫病特異性裸DNA或mRNA及其重組體中的任一種或其組合物；還包括不同種類和來源的自身免疫病相關抗原和細胞因子靶向抗原的特異性單克隆或多克隆抗體中的任一種或其組合物；所述的免疫原注射量為1-2ml(免疫原量10-500μg/ml+等量不完全福氏佐劑，其中抗體Ab1的用量為100～2000μg/ml+等量不完全福氏佐劑)；所述的自身免疫病相關抗原包括蛋白質、多肽、粘多糖、脂多糖、糖蛋自、細胞核、細胞質、細胞膜、細胞表面受體、核蛋白、DNA、RNA、線粒體、微粒體中的任一種或其組合；所述細胞因子靶向抗原包括人類白細胞分化抗原CD、粘附分子、補體、細胞因子及其受體、免疫球蛋白超家族中的任一種或其組合；所述細胞因子及其受體包括白細胞介素(IL)及其受體、集落刺激因子(CSF)及其受體、腫瘤壞死因子(TNF)及其受體、趨化因子及其受體中的任一種或其組合；所述自身免疫病包括多發性硬化症、類風溼關節炎、強直性脊柱炎、系統性紅斑狼瘡、混合結締組織病、胰島素依賴性糖尿病、自身免疫性溶血性貧血、甲狀腺功能亢進症、橋本甲狀腺炎、乾燥症候群等疾病中的任一種或其複合病。
b)上述自身免疫病相關免疫原用不完全佐劑進行追加免疫反應。
c)待5-20天後禽類尤其是雞的產蛋中即有針對於上述自身免疫病相關免疫原的蛋黃抗體存在和儲存。其中所述的蛋黃抗體包括針對於上述自身免疫病相關抗原、重組自身免疫病相關抗原或疫苗、細胞因子靶向抗原或其脂質體或納米微粒的蛋黃多克隆抗體IgY中的任一種或其組合物；針對於自身免疫病特異性裸DNA或mRNA及其重組體或其脂質體或納米微粒的自身免疫病特異性表達抗原中的任一種或其組合物；針對於自身免疫病相關抗原和細胞因子靶向抗原的特異性單克隆或多克隆抗體或上述蛋黃多克隆抗體IgY或其脂質體或納米微粒的抗獨特型抗體Ab2α、Ab2β、Ab2γ和Ab2ε中的任一種或其組合物。
本發明用上述自身免疫病相關免疫原注射免疫產蛋禽類尤其是雞，並以所產蛋黃作為針對於上述自身免疫病相關免疫原的抗體藥物的來源，該類方法具有很多優點如禽類尤其是雞易於飼養，費用低，收集產蛋方便，無需抽動物血，無損傷，符合現代動物保護規則；另外還具有產生有效免疫反應所需抗原量小的優點，高度保守的異源性蛋白質對種系發生學上距離較遠的禽類尤其是雞通常有較強的免疫原性。
一種自身免疫病相關蛋黃抗體製備方法，其特徵還在於該蛋黃抗體的提取純化方法是採用水稀釋法、反覆凍融法或硫酸銨、硫酸鈉、PEG、硫酸葡聚糖、藻酸鈉或辛酸沉澱或浸提、萃取、濃縮、膜過濾的方法從上述禽類蛋黃尤其是雞蛋黃中提取純化針對於上述自身免疫病相關免疫原的多克隆抗體IgY、抗獨特型抗體Ab2α、Ab2β、Ab2γ和Ab2ε、自身免疫病特異性表達抗原中的任一種或其組合物，然後將該純化的蛋黃抗體添加相應輔料包括海藻糖而製備成藥劑學上的任意劑型包括片劑、針劑、口服液和噴霧劑。其具體步驟包括a)取禽蛋尤其是雞蛋去殼取黃，除去粘附於蛋黃膜上的蛋白組分，然後將蛋黃置於滅菌蒸餾水中，反覆洗滌三次，進一步除去蛋黃膜上的蛋白組分，瀝乾後刺破蛋黃膜，收集蛋黃。
b)將上述收集蛋黃充分攪拌均勻後，加入蛋黃勻漿5倍體積的0.1mol/L PH7.2磷酸鹽-海藻糖稀釋液，製成稀釋蛋黃液。在該稀釋蛋黃液中海藻糖的重量百分比是5-30％。
c)將上述稀釋蛋黃液置於冰盒(-20℃)冰凍1-5小時，然後取出於室溫復融並低速離心(500-1000r/min)後瀝出收集上清液，然後再向沉澱物中加入2-5倍體積的0.1mol/L PH7.2磷酸鹽-海藻糖稀釋液，充分混勻溶解沉澱物，依上法再次凍融收集上清液，如此反覆凍融3-5次，合併收集各次得到的上清液備用。
d)向上述收集上清液中按比例加入硫酸銨、硫酸鈉、PEG、硫酸葡聚糖、藻酸鈉或辛酸沉澱劑中的任一種或其複合物，離心收集其沉澱物，該沉澱物中即含有針對於上述自身免疫病相關免疫原的多克隆抗體IgY、抗獨特型抗體Ab2α、Ab2β、Ab2γ和Ab2ε、自身免疫病特異性表達抗原中的任一種或其組合物。
e)將上述沉澱物用蒸餾水復溶後透析或超濾濃縮或凝膠層析，進一步純化針對於上述自身免疫病相關免疫原的多克隆抗體IgY、抗獨特型抗體Ab2α、Ab2β、Ab2γ和Ab2ε、自身免疫病特異性表達抗原中的任一種或其組合物。
f)向上述純化的蛋黃抗體中按比例添加相應輔料，將其製備成藥劑學上的任意劑型包括片劑、針劑、口服液和噴霧劑。在此所述的輔料包括海藻糖。
一種自身免疫病相關蛋黃抗體製備方法，其特徵還在於該蛋黃抗體IgY或抗獨特型抗體Ab2α、Ab2β、Ab2γ和Ab2ε的修飾處理方法是採用偶聯或共價結合放射性核素、藥物、細胞因子和毒素及其他細胞毒性物質的方法製備免疫導向藥物或生物飛彈；是採用偶聯或共價結合放射性核素、發光物質、膠體金或膠體硒或酶的方法製備體內免疫診斷藥劑和體外免疫診斷試劑包括免疫組化試劑和生物晶片尤其是蛋白質晶片試劑；是採用向上述蛋黃抗體尤其是抗獨特型抗體Ab2β和Ab2ε或自身免疫病相關表達抗原中添加不完全佐劑或其他組分的方法製備自身免疫病特異性疫苗(包括抗獨特型抗體疫苗和多肽疫苗)。
飛彈的主要部件一是能追蹤目標的導航系統，二是摧毀特定目標的炸彈。應用這一原理製備出一種能追蹤病變組織和細胞而又能專一性地殺傷病變細胞的「武器」，即生物飛彈，它的基本部件是能特異地識別病變細胞抗原目標的抗體以及在抗體的末端接上殺傷病變細胞的毒性藥物。這樣從理論上講，只要能研製出可識別病變細胞的抗體，並使它帶上毒性藥物就可大功告成。但事實上並不那麼簡單，首先是抗體問題，早期人們是用純度及特異性相對較高的相關抗原免疫小鼠後的完整抗體(即由識別抗原簇的Fab片段和Fc片段所組成的免疫球蛋白)，使它的「尾端」(Fc片段)攜帶上放射性核素碘(125I)；1975年雜交瘤技術的建立及單克隆抗體的問世，使單抗與放射性核素的結合，推動了導向治療的進展。然而，經過一段時間的實驗，單抗與多抗在體內治療的結果，並沒有明顯的差別，其主要原因是①單抗和多抗都是完整抗體，它們一旦進入機體，就會被正常組織交叉吸附，不能相對集中地到達靶標；而且不容易清除和排出體外；②由於完整抗體的分子量大，不易通過機體的生理屏障(如結締組織等)進入病變中心部位；③由於完整的抗體都來源於小鼠，對人體來說是一種異源性蛋白，所以可在體內產生抗抗體而被中和。由於存在以上問題，因此使完整抗體用於導向治療受到限制。
根據以上存在的問題，近幾年來研究人員已設法研究製備出應用小分子量的抗體片段，而且設法用人-人雜交瘤來製備人-人單克隆抗體，目前又用基因工程的方法來製備出基因工程抗體，這是一種不含Fc片段的Fab小分子多肽，並建立了雙功能抗體技術。後者有特異性識別的雙臂(即把兩個Fab片段結合在一起)，因此有雙重識別能力，即既可以與病原體結合，又可與藥物彈頭相連接。由於基因工程抗體不含Fc片段，因此減少了非特異吸附，並可將鼠源性成分減少到最低限度；小分子的基因工程產物，有利於殺傷物質進入病原體內部且不易被宿主識別為異物而產生抗抗體；這種雙功能抗體，使彈頭直接命中靶標，若將雙功能抗體與LAK、TIL細胞聯合應用，則可獲得更大的效應，從而有效地控制疾病的發展。但該類方法均有較高的技術難度，難於推廣。
本發明就是為了克服以上問題而利用自身免疫病相關蛋黃抗體IgY或抗獨特型抗體Ab2α、Ab2β、Ab2γ和Ab2ε的修飾處理即採用其偶聯或共價結合放射性核素、藥物、細胞因子和毒素及其他細胞毒性物質的方法製備免疫導向藥物或生物飛彈。其具體步驟包括a)自身免疫病相關蛋黃抗體IgY或抗獨特型抗體Ab2α、Ab2β、Ab2γ和Ab2ε的酶分解或偶聯活性基團預修飾處理，其中酶分解是利用胃蛋白酶或無花果蛋白酶將自身免疫病相關蛋黃抗體IgY或抗獨特型抗體Ab2α、Ab2β、Ab2γ和Ab2ε分解，再用二巰基蘇糖醇或β-巰基乙醇還原為Fab』小片斷，以使其具有更好的組織穿透力；或用不同的活化試劑將自身免疫病相關蛋黃抗體IgY或抗獨特型抗體Ab2α、Ab2β、Ab2γ和Ab2ε及其Fab』小片斷上的氨基或羧基或巰基或醛基活化，如用1-乙基-3-(3-二甲氨基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基硫代琥珀醯亞胺(NHS)將其變成活潑酯，然後再同各種不同的藥物分子偶聯。
b)偶聯藥物的預修飾處理包括將放射性核素、藥物、細胞因子和毒素分子用不同的活化試劑活化，如用1-乙基-3-(3-二甲氨基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基硫代琥珀醯亞胺(NHS)把其變成活潑酯，如此採用類似公知共用的方法，可以分別把含有羥基、氨基、醛基、肼基、巰基等基團的偶聯藥物活化，以使其能夠與自身免疫病相關蛋黃抗體IgY或抗獨特型抗體Ab2α、Ab2β、Ab2γ和Ab2ε及其Fab』小片斷髮生共價結合。
c)自身免疫病相關蛋黃抗體IgY或抗獨特型抗體Ab2α、Ab2β、Ab2γ和Ab2ε及其Fab』小片斷與已活化處理的偶聯藥物包括將放射性核素、藥物、細胞因子和毒素分子共價結合而成為自身免疫病特異性免疫導向藥物或生物飛彈。
本發明是採用自身免疫病相關蛋黃抗體IgY或抗獨特型抗體Ab2α、Ab2β、Ab2γ和Ab2ε的修飾處理即採用偶聯或共價結合放射性核素、發光物質、膠體金或膠體硒或酶的方法製備體內免疫診斷藥劑和體外免疫診斷試劑包括免疫組化試劑和生物晶片尤其是蛋白質晶片試劑。其具體步驟包括a)將自身免疫病相關蛋黃抗體IgY或抗獨特型抗體Ab2α、Ab2β、Ab2γ和Ab2ε採用公知共用的方法進行放射性核素、發光物質、膠體金或膠體硒或酶標記而製備其相應的標記物。
b)將自身免疫病相關蛋黃抗體IgY或抗獨特型抗體Ab2α、Ab2β、Ab2γ和Ab2ε的放射性核素、發光物質、膠體金或膠體硒或酶標記物中的任一種配合其他組分製備體內免疫診斷藥劑和體外免疫診斷試劑(包括免疫組化試劑和生物晶片尤其是蛋白質晶片試劑)。
本發明是採用自身免疫病相關蛋黃抗體中的蛋黃抗體IgY製備自身免疫病特異性免疫治療劑。其具體步驟包括向上述中蛋黃抗體IgY添加不完全佐劑及其他組分，然後再進行免疫注射，免疫禽類尤其是雞產生針對於自身免疫病相關蛋黃抗體IgY的抗獨特型抗體Ab2α、Ab2β、Ab2γ和Ab2ε，再用其誘導機體產生針對於自身抗原的免疫抑制和免疫耐受。
本發明是採用自身免疫病相關蛋黃抗體中的抗獨特型抗體Ab2α、Ab2β、Ab2γ和Ab2ε或自身免疫病特異性表達抗原製備特異性自身免疫病疫苗。其具體步驟包括向上述抗獨特型抗體Ab2α、Ab2β、Ab2γ和Ab2ε、自身免疫病特異性表達抗原中的任一種或其組合物中添加不完全佐劑及其他組分製備特異性自身免疫病疫苗。在此所述的抗獨特型抗體Ab2α、Ab2β、Ab2γ和Ab2ε疫苗是採用向禽類尤其是雞注射自身免疫病特異性單克隆或多克隆抗體尤其是注射蛋黃抗體中的自身免疫病相關抗體IgY而製備的。
針對外來抗原的抗體分子(Ab1)可變區上獨特型(Id)可刺激機體產生相應的抗Id抗體(Ab2)。其中Ab2α屬半抗原非抑制性Ab2，具有調節作用，可促進或抑制Ab1克隆；Ab2β具有與外來抗原相似的胺基酸排列順序或空間構型，它能夠在體內模擬始動抗原的作用，故被認為是外部抗原在機體免疫系統中的″內影像″(internal image)，可抑制Ab1與相應抗原的結合反應；Ab2γ屬半抗原非抑制性Ab2，能抑制抗原與Ab1的結合，具有調節作用，可促進或抑制帶有相應Id克隆細胞增殖；Ab2ε又稱Epibody，是一種雙特異性抗體，能識別Ab1骨架區上的抗原決定簇，同時又能識別自身或外來抗原上的表位，更有利於自身免疫病的免疫治療。應用上述特性，可有目的地製備Ab2α、Ab2β、Ab2γ和Ab2ε，將其作為抗原的替代物用於誘導機體產生針對於自身抗原的特異性免疫應答，即所謂抗獨特型疫苗(anti-idiotype vaccine)。該類疫苗是用抗Id型抗體(Ab2)代替抗原作為免疫原，在體內可起到阻斷和中和作用，更重要的是可重新調整機體的病理性免疫網絡狀態，使免疫網絡的平衡向有利於機體健康的方向發展。
一種自身免疫病相關蛋黃抗體製備方法，其特徵還在於將上述蛋黃抗體IgY或抗獨特型抗體Ab2α、Ab2β、Ab2γ和Ab2ε製備成脂質體微粒甚至是納米微粒然後再偶聯上述細胞毒性物質成免疫導向藥物的方法，以增加其對病灶的親和性和滲透性；將上述抗獨特型抗體Ab2α、Ab2β、Ab2γ和Ab2ε或自身免疫病特異性表達抗原製備成脂質體微粒甚至是納米微粒的特異性自身免疫病疫苗的方法。
脂質體技術是被喻為「生物飛彈」的第四代靶向給藥技術，脂質體屬於納米級藥物載體，該技術利用脂質體的獨有特性，將毒副作用大、在血液中穩定性差、降解快的藥物包裹在脂質體內，根據人體病灶部位血管內皮細胞間隙較大，脂質體藥物可透過此間隙到達病灶部位，在病灶部堆積釋放，從而達到定向給藥。脂質體主要輔料為磷脂，而磷脂在血液中消除極為緩慢，因此脂質體藥物在血循環系統保留時間長，使病灶部位得到充分治療的效果。利用該技術可將一大批已知高毒性活性藥物安全有效地應用於臨床治療，其中有抗癌藥、抗生素類藥、抗真菌類藥、抗寄生蟲類藥、蛋白質或多肽類藥物，極大地提高了臨床治療水平，減輕了患者的病痛。同時可將單克隆抗體連接到脂質體上，藉助於抗原與抗體的特異反應，將載藥脂質體定向送入。本發明就是利用上述自身免疫病相關蛋黃抗體包括蛋黃抗體IgY、抗獨特型抗體Ab2α、Ab2β、Ab2γ和Ab2ε和自身免疫病特異性表達抗原中的任一種或其組合物所製備的脂質體微粒甚至是納米微粒，能夠有效到達靶區，共同發揮其免疫治療作用。
一種自身免疫病相關蛋黃抗體製備方法，其特徵還在於將上述蛋黃抗體中的具有相同或相近作用的兩種或兩種以上組分同其他輔料按一定配比混合成組合物，使相應蛋黃抗體組分針對於自身免疫病發揮協同治療作用。
一種自身免疫病相關蛋黃抗體的用途，其特徵在於上述蛋黃抗體中的任一種或任意組合的任意劑型單獨或聯合用於自身免疫病的診斷、治療和預防。
對於自身免疫病的治療，目前只能對症處理，尚無根治辦法。總的來說，免疫治療方法有三大類(1)全身的免疫抑制通過藥物抑制自身免疫反應的致病性而達到治療自身免疫病，主要有抗代謝藥、糖皮質激素及抗炎藥，這些藥物的副作用已是眾所周知。這是當前主要的治療方法，它在多個水平幹擾整個免疫系統。(2)選擇性免疫療法它被設計用來幹擾免疫系統的內在機制，對免疫過程的幹擾是不連續的，以恢復喪失的功能，如給胰島素依賴型糖尿病者補充胰島素以替代損傷的胰島素β-細胞功能，但這類治療需終身維持。(3)抗原特異性免疫療法這是一種理想的治療方法，該療法不是幹擾整個免疫系統，而是去活化或抑制抗原特異性T細胞，從而特異地抑制病理性自身免疫反應。
迄今，人們已能有效地利用很多藥物和手段上調或下調免疫系統的特定部分，但它們皆有明顯的缺點或是在免疫系統的多個水平上起幹擾作用，或有副作用，甚或兼具兩個缺點。對理想免疫療法的要求是特異、無毒及對病原性免疫反應長時期的去除。新的治療策略將更為精確地在特定的免疫機制水平上起阻遏作用，而最終的目的是只特異地攻擊那些參與自身免疫病病理過程的細胞。
近年來，針對自身反應性輔助T細胞的新療法正在形成，包括T細胞疫苗、MHC阻斷劑、輔助刺激阻斷劑(costimulating blockage)、調節TH1-TH2比例以及口服抗原誘導免疫耐受等。
自身免疫病導向治療即利用高度特異性的單克隆抗體為載體，將細胞毒性的殺傷分子帶到病灶處，可特異地殺傷自身反應性輔助T細胞。目前根據所用的殺傷分子的性質不同，將自身免疫病的導向治療分為①放射免疫治療，將高能放射性核素與單克隆抗體連接，可將放射性核素帶至病灶殺死自身反應性輔助T細胞；②抗體導向化學療法，將藥物與單抗通過化學交聯組成的免疫偶聯物，可以將藥物導向病灶，殺傷自身反應性輔助T細胞，常用的有氨甲蝶呤(MTX)、阿黴素等；③免疫毒素療法(immunotoxintherapy)，將毒素與單克隆抗體相連，製備的免疫毒素對自身反應性輔助T細胞有特異性的強殺傷活性。常用的毒素有兩類一類是植物毒素，包括篦麻籽毒素(RT)、相思子毒素(Abrin)、苦瓜毒素(MD)、氧化苦參鹼(OXY)等。另一類是細胞毒素，包括白喉毒素(DT)、綠膿桿菌外毒素(PE)。但目前所用的單克隆抗體多為鼠源單克隆抗體，應用於人體後會產生抗鼠源單克隆抗體的抗體，使其不能反覆應用影響了其療效。用基因工程的方法，使鼠源抗體人源化可減少這個問題，但技術難度較高，廣泛推廣受限。本發明採用自身免疫病相關蛋黃抗體能夠很好地解決上述鼠源性單抗偶聯物或T細胞疫苗所存在的HAMA反應和異質性問題，且對人體無毒副作用，具有較好的安全性，適用於自身免疫病的免疫診斷、免疫治療和預防。
一種自身免疫病相關蛋黃抗體的用途，其特徵還在於上述蛋黃抗體中的多克隆抗體IgY或抗獨特型抗體Ab2α、Ab2β、Ab2γ和Ab2ε及其螢光、發光、酶、金屬標記物中的任一種用於配製體外用免疫診斷試劑；上述蛋黃抗體中的多克隆抗體IgY或抗獨特型抗體Ab2α、Ab2β、Ab2γ和Ab2ε及其脂質體甚至納米微粒的放射性核素標記物用於配製體內免疫導向診斷試劑。上述所述的免疫診斷試劑包括免疫組化試劑和生物晶片尤其是蛋白質晶片試劑。
一種自身免疫病相關蛋黃抗體的用途，其特徵還在於上述蛋黃抗體中的多克隆抗體IgY或抗獨特型抗體Ab2α、Ab2β、Ab2γ和Ab2ε及其脂質體甚至納米微粒用於製備治療性免疫製劑；上述蛋黃抗體中的多克隆抗體IgY或抗獨特型抗體Ab2α、Ab2β、Ab2γ和Ab2ε及其脂質體甚至納米微粒與放射性核素、藥物、細胞因子和毒素的偶聯物用於製備免疫導向藥物或生物飛彈。
一種自身免疫病相關蛋黃抗體的用途，其特徵還在於上述蛋黃抗體中的病原體特異性表達抗原用於製備多肽疫苗；上述蛋黃抗體中的抗獨特型抗體Ab2α、Ab2β、Ab2γ和Ab2ε用於製備抗獨特型抗體疫苗，其中Ab2ε用於製備雙特異性抗獨特型抗體疫苗。
特異性主動免疫治療是通過激活特定的免疫系統，達到消滅病原體的目的，這種治療並不影響周圍正常組織。從理論上講，由疫苗介導的特異性免疫治療，能夠激活特定的淋巴細胞〔B細胞和(或)T細胞〕反應，產生即刻的抗病原體作用，並對將來的病原體產生記憶反應。最初，利用病原體製備疫苗；後來，病原體抗原成為製備疫苗的材料。隨著分子生物學方法的進展，利用可表達抗原的基因修飾病原體抗原來增強免疫原性或利用修飾基因以分泌細胞因子等技術用於疫苗製備。同時，也可利用提純的病原體相關抗原、DNA編碼蛋白抗原和(或)蛋白衍生肽製備疫苗。疫苗接種的最終目的是激活免疫系統的某一部分，如抗體或淋巴細胞，來殺滅病原體。目前，特異性主動免疫治療有很多方法，如完整病原體與卡介苗等佐劑的混合物；用遺傳學方法改變病原體。另外，亦可用肽、黏蛋白和碳水化合物等單個抗原製備疫苗。許多重組疫苗可表達各種抗原如B肝表面抗原。利用重組疫苗，其他基因(例如編碼協同刺激因子分子的基因)，亦可以病原體相關基因轉導。針對特異性抗體還可採用抗獨特型抗體，因為病原體抗原的抗原性不同，且病原體宿主經常處於免疫抑制狀態，難以激發有效的抗病原體反應。80年代以來，許多學者通過動物實驗證明用抗原內影像型Ab2(又稱抗獨特型疫苗)能夠克服免疫抑制，誘導機體產生特異性免疫應答和免疫耐受。免疫網絡理論認為，抗體(Ab1)分子上存在的獨特型(Id)抗原決定簇可以刺激機體產生A-Id抗體(Ab2)及Ab3等一系列抗體的產生，從而構成一個複雜的免疫網絡。根據抗獨特型抗體與抗體獨特位反應的特點和抗獨特型抗體的功能，可將A-Id分為Ab2α、Ab2β、Ab2γ、Ab2ε。其中Ab2β可識別Ab1上與抗原互補的決定簇，能完全抑制抗原與Id的結合。它具有類似抗原的結構，可以″模擬″抗原，產生與抗原相同的生物學效應，被認為是外部抗原在機體免疫系統中的「內影像」(intemal image)。Ab2β具有下列特點a)能特異性與不同種屬個體產生的抗體(Ab1)反應；b)能特異性與不同類抗體(Ab1)反應；c)Ab2β與抗原能競爭性地結合Ab1，二者之間存在競爭性抑制作用；d)能誘導不同種屬個體產生特異性免疫應答。其中Ab2α屬半抗原非抑制性Ab2，具有調節作用，可促進或抑制Ab1克隆；Ab2γ屬半抗原非抑制性Ab2，能抑制抗原與Ab1的結合，具有調節作用，可促進或抑制帶有相應Id克隆細胞增殖；Ab2ε又稱Epibody，是一種雙特異性抗體，能識別Ab1骨架區上的抗原決定簇，同時又能識別自身或外來抗原上的表位，更有利於自身免疫病的免疫治療。
具有內影像特點的抗獨特型抗體能模擬病原體相關抗原誘導機體產生主動免疫應答，其應答過程極其複雜，但主要涉及體液免疫和細胞免疫兩方面。Ab2β作為胸腺依賴抗原(TD)激活輔助T淋巴細胞亞群(Th1和Th2)，分泌一系列細胞因子，如Th1細胞產生INF-γ、IL-10、TNF和IL-2；Th2細胞產生IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等。Th2細胞產生的細胞因子影響和促進B淋巴細胞分化和增殖，產生特異性抗體Ab3，Ab3一部分能與Ab1互相模擬，即具有與抗原結合性，稱之為抗病原體抗體(Ab1』)。總Ab3的產生已被證實與微小病原體病灶消退和/或病人病情好轉呈正相關。被激活的Th1細胞釋放細胞因子，如INF-γ可通過影響NK細胞及T細胞功能而發揮抗病原體效應，IL-2可促進T細胞生長、克隆性擴增而增強機體的免疫功能，亦可誘導或促進多種細胞毒性細胞活性，如NK、CTL、LAK及TIL等，發揮免疫監視及抗病原體效應。同時IL-2還可協同刺激B細胞增殖及分泌抗體，與補體及效應細胞相作用，發揮ADCC及CDC抗病原體作用(龔非力等，醫學免疫學，第二版，武漢科學出版社，2000)。人體內免疫系統是一個處於自身動態平衡中的系統。在自身免疫病患者體內的免疫系統中，抗獨特型抗體是一個較關鍵的系統要素，用人為的方法改變抗獨特型抗體的質量和數量，必然會使系統發生變化，再在更高的層次上達到新的平衡。使機體免疫的系統平衡按照理論上預測的有利於患者的方向發展變化，在某種意義上這正是抗獨特型抗體應用的關鍵所在。
本發明就是採用上述方法所製備的自身免疫病特異性表達抗原和抗獨特型抗體Ab2α、Ab2β、Ab2γ和Ab2ε作為自身免疫病特異性疫苗而用於自身免疫病的特異性免疫治療，能夠激活或抑制特定的淋巴細胞〔B細胞和(或)T細胞〕反應，產生相應的抗自身免疫病作用，並對將來的病原體產生記憶反應，激活機體免疫系統甚至重新調節機體免疫的系統平衡，調動體液免疫和細胞免疫作用，產生或滅活特異性抗體或殺傷性淋巴細胞，重新調整機體的病理性免疫網絡狀態，使免疫網絡的平衡向有利於機體健康的方向發展，達到免疫性治療自身免疫病的目的。
一種自身免疫病相關蛋黃抗體的用途，其特徵還在於上述蛋黃抗體中的多克隆抗體IgY、自身免疫病特異性表達抗原、抗獨特型抗體Ab2α、Ab2β、Ab2γ和Ab2ε的任一種或任意組合用於製備預防自身免疫病的食品、飲料和保健品。即採用將本發明中的多克隆抗體IgY、自身免疫病特異性表達抗原、抗獨特型抗體Ab2α、Ab2β、Ab2γ和Ab2ε中的任一種或任意組合按一定配比添加於食品、飲料及保健品中，用於自身免疫病的預防及早期預防性治療。技術效果本發明就是針對以上問題利用自身免疫病相關蛋黃抗體中的IgY抗體為主要原料製備成針對於自身免疫病特異性抗原的免疫診斷藥劑和免疫治療藥劑，包括體外診斷試劑、體內導向診斷試劑和特異性蛋黃抗體免疫治療劑以及特異性蛋黃抗體偶聯藥物或毒素的導向藥物即生物飛彈；利用該蛋黃抗體中的自身免疫病特異性表達抗原可製備成針對於自身免疫病的免疫診斷藥劑和免疫治療藥劑，包括體外診斷試劑和特異性疫苗、瘤苗和核酸疫苗；利用該蛋黃抗體中的抗獨特型抗體Ab2α、Ab2β、Ab2γ和Ab2ε為主要原料可製備成針對於自身免疫病的免疫診斷藥劑和免疫治療藥劑，包括體外診斷試劑、體內導向診斷試劑(主要採用Ab2α)和抗獨特型抗體Ab2α偶聯藥物或毒素的導向藥物即抗獨特型生物飛彈和抗獨特型抗體疫苗(主要採用Ab2β和Ab2γ)和自身免疫病雙特異性免疫治療劑(主要採用Ab2ε)；用於自身免疫病的診斷、免疫治療和導向治療。另外該蛋黃抗體IgY和抗獨特型抗體還可作為添加劑添加於食品、飲料及保健品中，用於自身免疫病的預防及早期預防性治療。
由於採用本發明方法製備自身免疫病相關蛋黃抗體，利用雞免疫系統對異源性蛋白或生物分子能產生具有更高效價和親和力的特異性抗體，可誘導高滴度的特異性抗體，且具有成本低、產量高、特異性強、決定簇廣並能進行集約化大規模生產的優點，更重要的是該蛋黃抗體能夠很好地解決上述鼠源性單抗偶聯物或T細胞疫苗所存在的HAMA反應和異質性問題，且對人體無毒副作用，具有較好的安全性。另外，本發明所製備的自身免疫病相關蛋黃抗體或其組合物可用作自身免疫病相關診斷試劑的原料，尤其是自身免疫病相關生物晶片的原料；再者就是本發明所製備的自身免疫病相關蛋黃抗體或其組合物能夠在免疫抑制和免疫耐受兩方面共同發揮其免疫調節和治療作用。本發明適用於自身免疫病的免疫診斷、免疫治療和預防，尤其適用於對人類具有極大危害性的自身免疫病如多發性硬化症、類風溼關節炎、強直性脊柱炎、系統性紅斑狼瘡、混合結締組織病、胰島素依賴性糖尿病、自身免疫性溶血性貧血、甲狀腺功能亢進症、橋本甲狀腺炎、乾燥症候群等疾病的免疫抑制和免疫耐受治療，將具有極其廣闊的應用前景。
實施方案下面結合實施例進一步說明本發明。
實施例1用具有免疫活性的自身免疫病特異性免疫原包括自身免疫病特異性抗原、疫苗瘤苗、DNA或mRNA和抗體或其脂質體複合物中的任一種或其複合物免疫產蛋禽類尤其是雞，然後再以不完全佐劑進行追加強化反應，待5-20天後禽類尤其是雞的產蛋中即有針對於上述自身免疫病免疫原的多克隆抗體IgY或抗獨特型抗體或自身免疫病特異性表達抗原中的任一種或其組合物存在和儲存，其具體步驟包括取6月齡SPF純系萊航產蛋母雞於標準II級清潔級動物房飼養，每隻雞於胸腹部多點注射上述自身免疫病免疫原1-2ml(免疫原量10-500μg/ml+等量不完全福氏佐劑，其中抗體Ab1的用量為100～2000μg+等量不完全福氏佐劑)，2～4周後加強免疫注射3-5次，待5-20天後免疫母雞所產的免疫蛋中即含有自身免疫病相關蛋黃抗體。
實施例2自身免疫病相關蛋黃抗體的製備將上述免疫雞蛋去蛋清後的卵黃充分攪拌均勻後，加入蛋黃勻漿5倍體積的0.1mol/L PH7.2磷酸鹽-海藻糖稀釋液，然後置於冰盒(-20℃)冰凍1-5小時，取出於室溫復融並低速離心(500-1000r/min)後瀝出收集上清液，再向沉澱物中加入2-5倍體積的0.1mol/L PH7.2磷酸鹽-海藻糖稀釋液，充分混勻溶解沉澱物，依上法再次凍融收集上清液，如此反覆凍融3-5次，合併收集各次得到的上清液加入硫酸鈉，使硫酸鈉的終濃度達10-30％，離心收集其沉澱物，並將該沉澱物用蒸餾水復溶後對鹽透析後超濾濃縮、凝膠過濾、冷凍乾燥即得到純化的自身免疫病相關蛋黃抗體包括蛋黃多克隆抗體IgY或抗獨特型抗體或自身免疫病特異性表達抗原中的任一種或其組合物。實驗結果表明批量製備的自身免疫病相關蛋黃抗體，每隻雞蛋大約可提取57～171mg的自身免疫病特異性蛋黃抗體，平均每隻雞蛋可提取89mg。
實施例3自身免疫病相關蛋黃抗體的檢測抗CD20特異性蛋黃抗體IgY的檢測採用ELISA間接法檢測，以CD20抗原液包被酶標板孔，採用辣根過氧化物酶標記的鼠抗雞IgY單抗作為二抗；特異性表達CD20的檢測採用ELISA雙抗體夾心法，以CD20抗體包被酶標板孔，採用辣根過氧化物酶標記的CD20抗體作為標記抗體；抗CD20特異性蛋黃抗獨特型抗體的檢測採用ELISA間接法，以抗CD20特異性蛋黃抗體IgY包被酶標板孔，採用辣根過氧化物酶標記的鼠抗雞IgY單抗作為二抗；上述ELISA檢測依常規操作進行。實驗結果表明CD20特異性蛋黃抗體的效價在1∶640-1∶5120之間，其中抗CD20特異性蛋黃抗體IgY的平均效價在1∶5120左右；特異性表達CD20抗原的平均效價在1∶2560左右；抗CD20特異性蛋黃抗獨特型抗體的平均效價在1∶2560左右。
實施例4自身免疫病相關蛋黃抗體的穩定性試驗 自身免疫病相關蛋黃抗體經過濾除菌，以10mg/ml分裝小試管中，分別於-20℃冰凍、4℃和室溫保存，定期進行其效價檢測。實驗結果表明自身免疫病相關蛋黃抗體於-20℃冰凍保存，其穩定性至少可保持12個月以上；於4℃保存，其穩定性至少可保持6個月以上；於室溫保存，其穩定性至少可保持2個月以上。
實施例5CD20特異性蛋黃抗體IgY與氧化苦參鹼的偶聯試驗首先取葡聚糖1.0g，加入200mL蒸餾水後加高碘酸鈉0.3g，室溫下避光反應過夜，使葡聚糖充分氧化為多醛基葡聚糖，蒸餾水充分透析後凍幹；注射治療前2小時內取多醛基葡聚糖10mg加入0.15mol/L(pH7.2)的磷酸緩衝液2mL中，加氧化苦參鹼10mg，室溫下反應24小時後，再加入已純化的CD20特異性蛋黃抗體IgY10mg，4℃攪拌反應24小時；然後在上述反應混合物中加硼氫化鈉0.2mg，在4℃下還原2小時，離心後經Sephadex G-150層析柱過柱，收集第一峰即可用於治療。
實施例6治療效果觀察 通過對32例類風溼性關節炎患者分別給予單獨藥物(甲氨蝶呤)、CD20特異性蛋黃抗體IgY-氧化苦參鹼導向治療、CD20特異性蛋黃抗體IgY-氧化苦參鹼和CD20抗體特異性蛋黃抗獨特型抗體Ab2β聯合治療並進行療效觀察和比較。實驗結果表明類風溼性關節炎患者的關節損傷率聯合治療組(11.5％)明顯低於導向治療組(27.3％)和單獨藥物組(56.9％)；類風溼性關節炎患者的臨床症狀、炎症程度和關節活動度聯合治療組和導向治療組明顯優於單獨藥物組。表明CD20特異性蛋黃抗體IgY-氧化苦參鹼導向治療、CD20特異性蛋黃抗體IgY-氧化苦參鹼和CD20抗體特異性蛋黃抗獨特型抗體Ab2β聯合治療對類風溼性關節炎患者具有特異性強、毒副作用小等優點；CD20特異性蛋黃抗體可有效去除自身反應性B細胞，從而消除自身免疫反應，有效避免了類風溼性關節炎患者的關節損傷。另外CD20抗體特異性蛋黃抗獨特型抗體Ab2β可有效模擬自身反應性B細胞表面的CD20抗原，使機體產生免疫抑制和免疫耐受，避免了自身免疫反應對骨關節的損傷，從而達到緩解和治療類風溼性關節炎的目的。
權利要求
1.一種自身免疫病相關蛋黃抗體製備方法，其特徵在於以產蛋禽類尤其是雞作為免疫反應器，用一種或多種純化或通過基因工程技術重組的自身免疫病特異性抗原或疫苗、或細胞因子靶向抗原、或自身免疫病特異性DNA或mRNA及其與相應載體組成的重組體、或針對於自身免疫病特異性抗原或細胞因子靶向抗原的單克隆或多克隆抗體、或它們的脂質體或納米微粒複合物作為免疫原，分別單獨進行或多種聯合進行禽類尤其是雞的多次重複免疫注射，然後再以不完全佐劑進行追加強化反應，待5-20天後禽類尤其是雞的產蛋中即有針對於上述自身免疫病相關免疫原的多克隆抗體IgY、抗獨特型抗體Ab2α、Ab2β、Ab2γ和Ab2ε、自身免疫病特異性表達抗原中的任一種或其組合物存在和儲存。其具體步驟包括a)自身免疫病相關免疫原或其組合物進行多次免疫注射禽類優選為雞。在此所述的免疫原是採用純化的自身免疫病相關抗原或通過基因工程技術重組的自身免疫病特異性抗原或疫苗、細胞因子靶向抗原、通過提取純化的自身免疫病特異性裸DNA或mRNA及其與相應載體組成的重組體、自身免疫病特異性抗原和細胞因子靶向抗原的單克隆或多克隆抗體，另外還包括上述自身免疫病相關免疫原的脂質體微粒甚至是納米微粒的免疫注射，藉助於脂質體對組織和細胞的親和性以強化免疫效果；所述禽類包括雞、鴨、鵝、鵪鶉，首選是雞；注射部位包括肌肉、皮下、皮內、血管和生殖腔囊；注射方法包括將上述自身免疫病相關免疫原單獨進行注射和多種自身免疫病相關免疫原聯合進行多次重複免疫注射，其中所述的多種自身免疫病相關免疫原聯合進行免疫注射包括用不同種類和來源的自身免疫病相關抗原、基因重組自身免疫病特異性抗原或疫苗、細胞因子靶向抗原、自身免疫病特異性裸DNA或mRNA及其重組體中的任一種或其組合物；還包括不同種類和來源的自身免疫病相關抗原和細胞因子靶向抗原的特異性單克隆或多克隆抗體中的任一種或其組合物；所述的免疫原注射量為1-2ml(免疫原量10-500μg/ml+等量不完全福氏佐劑，其中抗體Ab1的用量為100～2000μg/ml+等量不完全福氏佐劑)；所述的自身免疫病相關抗原包括蛋白質、多肽、粘多糖、脂多糖、糖蛋白、細胞核、細胞質、細胞膜、細胞表面受體、核蛋白、DNA、RNA、線粒體、微粒體中的任一種或其組合；所述細胞因子靶向抗原包括人類白細胞分化抗原CD、粘附分子、補體、細胞因子及其受體、免疫球蛋白超家族中的任一種或其組合；所述細胞因子及其受體包括白細胞介素(IL)及其受體、集落刺激因子(CSF)及其受體、腫瘤壞死因子(TNF)及其受體、趨化因子及其受體中的任一種或其組合；所述自身免疫病包括多發性硬化症、類風溼關節炎、系統性紅斑狼瘡、混合結締組織病、胰島素依賴性糖尿病、自身免疫性溶血性貧血、甲狀腺功能亢進症、橋本甲狀腺炎、乾燥症候群等疾病中的任一種或其複合病。b)上述自身免疫病相關免疫原用不完全佐劑進行追加免疫反應。c)待5-20天後禽類尤其是雞的產蛋中即有針對於上述自身免疫病相關免疫原的蛋黃抗體存在和儲存。其中所述的蛋黃抗體包括針對於上述自身免疫病相關抗原、重組自身免疫病相關抗原或疫苗、細胞因子靶向抗原或其脂質體或納米微粒的蛋黃多克隆抗體IgY中的任一種或其組合物；針對於自身免疫病特異性裸DNA或mRNA及其重組體或其脂質體或納米微粒的自身免疫病特異性表達抗原中的任一種或其組合物；針對於自身免疫病相關抗原和細胞因子靶向抗原的特異性單克隆或多克隆抗體或上述蛋黃多克隆抗體IgY或其脂質體或納米微粒的抗獨特型抗體Ab2α、Ab2β、Ab2γ和Ab2ε中的任一種或其組合物。
2.根據權利要求1所述的一種自身免疫病相關蛋黃抗體製備方法，其特徵還在於該蛋黃抗體的提取純化方法是採用水稀釋法、反覆凍融法或硫酸銨、硫酸鈉、PEG、硫酸葡聚糖、藻酸鈉或辛酸沉澱或浸提、萃取、濃縮、膜過濾的方法從上述禽類蛋黃尤其是雞蛋黃中提取純化針對於上述自身免疫病相關免疫原的多克隆抗體IgY、抗獨特型抗體Ab2α、Ab2β、Ab2γ和Ab2ε、自身免疫病特異性表達抗原中的任一種或其組合物，然後將該純化的蛋黃抗體添加相應輔料包括海藻糖而製備成藥劑學上的任意劑型包括片劑、針劑、口服液和噴霧劑。其具體步驟包括a)取禽蛋尤其是雞蛋去殼取黃，除去粘附於蛋黃膜上的蛋白組分，然後將蛋黃置於滅菌蒸餾水中，反覆洗滌三次，進一步除去蛋黃膜上的蛋白組分，瀝乾後刺破蛋黃膜，收集蛋黃。b)將上述收集蛋黃充分攪拌均勻後，加入蛋黃勻漿5倍體積的01mol/L PH72磷酸鹽-海藻糖稀釋液，製成稀釋蛋黃液。在該稀釋蛋黃液中海藻糖的重量百分比是5-30％。c)將上述稀釋蛋黃液置於冰盒(-20℃)冰凍1-5小時，然後取出於室溫復融並低速離心(500-1000r/min)後瀝出收集上清液，然後再向沉澱物中加入2-5倍體積的0.1mol/LPH7.2磷酸鹽-海藻糖稀釋液，充分混勻溶解沉澱物，依上法再次凍融收集上清液，如此反覆凍融3-5次，合併收集各次得到的上清液備用。d)向上述收集上清液中按比例加入硫酸銨、硫酸鈉、PEG、硫酸葡聚糖、藻酸鈉或辛酸沉澱劑中的任一種或其複合物，離心收集其沉澱物，該沉澱物中即含有針對於上述自身免疫病相關免疫原的多克隆抗體IgY、抗獨特型抗體Ab2α、Ab2β、Ab2γ和Ab2ε、自身免疫病特異性表達抗原中的任一種或其組合物。e)將上述沉澱物用蒸餾水復溶後透析或超濾濃縮或凝膠層析，進一步純化針對於上述自身免疫病相關免疫原的多克隆抗體IgY、抗獨特型抗體Ab2α、Ab2β、Ab2γ和Ab2ε、自身免疫病特異性表達抗原中的任一種或其組合物。f)向上述純化的蛋黃抗體中按比例添加相應輔料，將其製備成藥劑學上的任意劑型包括片劑、針劑、口服液和噴霧劑。在此所述的輔料包括海藻糖。
3.根據權利要求1或2所述的一種自身免疫病相關蛋黃抗體製備方法，其特徵還在於上述自身免疫病相關蛋黃抗體IgY或抗獨特型抗體Ab2α、Ab2β、Ab2γ和Ab2ε的修飾處理方法是偶聯或共價結合放射性核素、藥物、細胞因子和毒素製備免疫導向藥物或生物飛彈；是偶聯或共價結合放射性核素、發光物質、膠體金或膠體硒或酶製備體內免疫診斷藥劑和體外免疫診斷試劑包括免疫組化試劑和生物晶片尤其是蛋白質晶片試劑；是向上述自身免疫病相關蛋黃抗體IgY中添加不完全佐劑製備自身免疫病特異性免疫治療劑；是向上述自身免疫病相關蛋黃抗體尤其是抗獨特型抗體Ab2α、Ab2β、Ab2γ和Ab2ε或自身免疫病特異性表達抗原中添加不完全佐劑及其他組分製備自身免疫病特異性疫苗(包括抗獨特型抗體疫苗和多肽疫苗)。其具體步驟包括a)自身免疫病相關蛋黃抗體IgY或抗獨特型抗體Ab2α、Ab2β、Ab2γ和Ab2ε的酶分解或偶聯活性基團預修飾處理，其中酶分解是利用胃蛋白酶或無花果蛋白酶將自身免疫病相關蛋黃抗體IgY或抗獨特型抗體Ab2α、Ab2β、Ab2γ和Ab2ε分解，再用二巰基蘇糖醇或β-巰基乙醇還原為Fab』小片斷，以使其具有更好的組織穿透力；或用不同的活化試劑將自身免疫病相關蛋黃抗體IgY或抗獨特型抗體Ab2α、Ab2β、Ab2γ和Ab2ε及其Fab』小片斷上的氨基或羧基或巰基或醛基活化，如用1-乙基-3-(3-二甲氨基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基硫代琥珀醯亞胺(NHS)將其變成活潑酯，然後再同各種不同的藥物分子偶聯。b)偶聯藥物的預修飾處理包括將放射性核素、藥物、細胞因子和毒素分子用不同的活化試劑活化，如用1-乙基-3-(3-二甲氨基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和N-羥基硫代琥珀醯亞胺(NHS)把其變成活潑酯，如此採用類似公知共用的方法，可以分別把含有羥基、氨基、醛基、肼基、巰基等基團的偶聯藥物活化，以使其能夠與自身免疫病相關蛋黃抗體IgY或抗獨特型抗體Ab2α、Ab2β、Ab2γ和Ab2ε及其Fab』小片斷髮生共價結合。c)自身免疫病相關蛋黃抗體IgY或抗獨特型抗體Ab2α、Ab2β、Ab2γ和Ab2ε及其Fab』小片斷與已活化處理的偶聯藥物包括將放射性核索、藥物、細胞因子和毒素分子共價結合而成為自身免疫病特異性免疫導向藥物或生物飛彈。d)將自身免疫病相關蛋黃抗體IgY或抗獨特型抗體Ab2α、Ab2β、Ab2γ和Ab2ε進行放射性核素、發光物質、膠體金或膠體硒或酶標記而製備其相應的標記物。e)將自身免疫病相關蛋黃抗體IgY或抗獨特型抗體Ab2α、Ab2β、Ab2γ和Ab2ε的放射性核素、發光物質、膠體金或膠體硒或酶標記物中的任一種配合其他組分製備體內免疫診斷藥劑和體外免疫診斷試劑(包括免疫組化試劑和生物晶片尤其是蛋白質晶片試劑)。f)向上述自身免疫病相關蛋黃抗體IgY中添加不完全佐劑及其他組分，然後再進行免疫注射，免疫機體產生針對於自身免疫病相關蛋黃抗體IgY的抗獨特型抗體Ab2α、Ab2β、Ab2γ和Ab2ε，從而誘導機體產生抗自身免疫病的特異性免疫應答。g)向上述抗獨特型抗體Ab2α、Ab2β、Ab2γ和Ab2ε、自身免疫病特異性表達抗原中的任一種或其組合物中添加不完全佐劑及其他組分製備自身免疫病特異性疫苗(包括抗獨特型抗體疫苗和多肽疫苗)。h)向禽類尤其是雞注射自身免疫病特異性單克隆或多克隆抗體尤其是注射自身免疫病相關蛋黃抗體中的IgY抗體，製備所述的抗獨特型抗體Ab2α、Ab2β、Ab2γ和Ab2ε疫苗。
4.根據權利要求1-3所述的一種自身免疫病相關蛋黃抗體製備方法，其特徵還在於將上述蛋黃抗體IgY或抗獨特型抗體Ab2α、Ab2β、Ab2γ和Ab2ε製備成脂質體微粒甚至是納米微粒然後再偶聯上述細胞毒性物質而製備免疫導向藥物的方法；將上述抗獨特型抗體Ab2α、Ab2β、Ab2γ和Ab2ε或自身免疫病特異性表達抗原製備成脂質體微粒甚至是納米微粒的自身免疫病特異性疫苗的方法。
5.根據權利要求1-4所述的一種自身免疫病相關蛋黃抗體製備方法，其特徵還在於將上述蛋黃抗體中的具有相同或相近作用的兩種或兩種以上組分同其他輔料按一定配比混合成組合物，使相應自身免疫病相關蛋黃抗體組分針對於自身免疫病發揮協同作用。
6.一種自身免疫病相關蛋黃抗體的用途，其特徵在於；上述蛋黃抗體中的任一種或任意組合的任意劑型單獨或聯合用於自身免疫病的診斷、治療和預防。
7.根據權利要求6所述的一種自身免疫病相關蛋黃抗體的用途，其特徵還在於上述自身免疫病相關蛋黃抗體中的多克隆抗體IgY或抗獨特型抗體Ab2α、Ab2β、Ab2γ和Ab2ε及其螢光、發光、酶、金屬標記物中的任一種用於配製體外用免疫診斷試劑；上述自身免疫病相關蛋黃抗體中的多克隆抗體IgY或抗獨特型抗體Ab2α、Ab2β、Ab2γ和Ab2ε及其脂質體甚至納米微粒的放射性核素標記物用於配製體內免疫導向診斷試劑。上述所述的免疫診斷試劑包括免疫組化試劑和生物晶片尤其是蛋白質晶片試劑。
8.根據權利要求6所述的一種自身免疫病相關蛋黃抗體的用途，其特徵還在於上述自身免疫病相關蛋黃抗體中的多克隆抗體IgY或抗獨特型抗體Ab2α、Ab2β、Ab2γ和Ab2ε及其脂質體甚至納米微粒用於製備治療性免疫製劑；上述自身免疫病相關蛋黃抗體中的多克隆抗體IgY或抗獨特型抗體Ab2α、Ab2β、Ab2γ和Ab2ε及其脂質體甚至納米微粒與放射性核素、藥物、細胞因子和毒素的偶聯物用於製備免疫導向藥物或生物飛彈。
9.根據權利要求6所述的一種自身免疫病相關蛋黃抗體的用途，其特徵還在於上述自身免疫病相關蛋黃抗體中的IgY抗體用於製備自身免疫病免疫治療劑；上述自身免疫病相關蛋黃抗體中的自身免疫病特異性表達抗原用於製備自身免疫病多肽疫苗；上述自身免疫病相關蛋黃抗體中的抗獨特型抗體Ab2β、Ab2γ和Ab2ε用於製備自身免疫病抗獨特型抗體疫苗，其中Ab2ε用於製備自身免疫病雙特異性抗獨特型抗體疫苗。
10.根據權利要求6所述的一種自身免疫病相關蛋黃抗體的用途，其特徵還在於上述自身免疫病相關蛋黃抗體中的多克隆抗體IgY、自身免疫病特異性表達抗原、抗獨特型抗體Ab2α、Ab2β、Ab2γ和Ab2ε的任一種或其組合物用於製備預防自身免疫病的食品、飲料和保健品。
全文摘要
本發明涉及一種自身免疫病相關蛋黃抗體尤其是針對於自身免疫病免疫原的蛋黃多克隆抗體IgY、抗獨特型抗體和自身免疫病特異性表達抗原的製備方法，另外還涉及該蛋黃抗體的用途。本發明以產蛋禽類尤其是雞作為免疫反應器，用一種或多種自身免疫病免疫原進行免疫注射，特點是多種自身免疫病免疫原單獨或多種聯合進行免疫注射，其產蛋中即有針對於上述自身免疫病免疫原的多克隆抗體IgY或抗獨特型抗體或自身免疫病特異性表達抗原中的任一種或其組合物存在和儲存。具有成本低、產量高、特異性強、決定簇廣並能進行集約化大規模生產的優點，尤其是能避免HAMA反應和異質性問題。適用於自身免疫病的免疫診斷、治療和預防。
文檔編號A61P7/06GK1438244SQ0215833
公開日2003年8月27日 申請日期2002年12月21日 優先權日2002年12月21日
發明者郭佔軍, 趙華, 楊巧芝, 金維良, 郭愛芹, 楊煥雲, 張慧 申請人:郭佔軍