一種用於海洋灰綠麴黴生產新型抗腫瘤活性化合物的新型培養基及其製備方法

2023-12-09 03:58:41 1

專利名稱：一種用於海洋灰綠麴黴生產新型抗腫瘤活性化合物的新型培養基及其製備方法
技術領域：
本發明涉及培養基技術領域，更具體地，涉及用於培養海洋灰綠麴黴的培養基技術 領域，特別是指一種用於海洋灰綠麴黴生產新型抗腫瘤活性化合物的新型培養基及其制 備方法。
背景技術：
現在從陸地生物中發現新化合物越來越難，相反海洋是目前開發極少的巨大生物資 源寶庫。最近幾年從海洋生物特別是無脊推動物、微生物中分離出了大量新型生物活性 物質，統計表明2003年報導了656種新化合物，2004年報導了716種新化合物。其中部分 處於I-III期臨床實驗。海洋微生物，包括海洋放線菌、真菌等是新活性物質的重要來源。
灰綠黴素A ( aspergiolide A )是中國海洋大學從海洋真菌灰綠麴黴HB1-19 (J印wg/〃M g/awc^ HB1-19)中分離出來的一種具有自主知識產^5l的、結構全新的具 有抗癌活性新蒽酮內酯化合物。灰綠黴素A以9-蒽酮為母核，利用SciFinder資料庫進行 相似化合物檢索，未搜到該類9-蒽酮內酯衍生物，這說明灰綠黴素A結構骨架較為新穎。 經中科院上海藥物所評價，其對人肺癌A549細胞、人白血病HL60細胞有較強的增殖抑 製作用，其ICso分別為0.13和0.28 nM。此外該化合物在10"M濃度下，對人臍靜脈內皮細 胞具有明顯的增殖抑制作用和遷移抑制活性，具有良好的開發價值。
新藥開發的歷史證明，有些天然活性產物如青黴素等不僅本身可直接被開發成新藥 產品，而且還成為研製後續系列新藥產品的重要先導物；即使是本身不宜直接開發的新 天然活性產物，往往也會為創新藥物研究提供新的活性先導結構，供進一步結構改造和 優化。由於灰綠黴素A結構具有新穎性並且展示很好的抗癌活性，所以非常有必要對其 進行深入研究。
然而灰綠黴素A在原始菌抹中含量極低(< 15mg/L)，制約了對其進行進一步的體 內外活性評價及構效研究，因此通過規模化發酵及代謝調控研究，進行高效發酵生產是 必須加以解決的首要問題。而要進行大規模高效發酵生產和代謝調控研究，繼而進行後 續的醫藥學研究，首要解決的就是產量問題，所以開發一種促進海洋灰綠麴黴生產灰氯 黴素A的培養基就成為後續研究的 一 個非常重要的前提條件。

發明內容
本發明的主要目的就是針對以上存在的問題與不足，提供一種用於海洋灰綠麴黴生 產新型抗腫瘤活性化合物的新型培養基及其製備方法，該新型培養基原料易得、成本低、 製備方法簡單、能顯著促進海洋灰綠麴黴HB1-19發酵生產灰綠黴素A的產量，有利於大 規模工業化生產，對海洋灰綠麴黴發酵研究及灰綠黴素A醫藥學研究具有重要意義。
為了實現上述目的，本發明採用的技術方案如下
一種用於海洋灰綠麴黴生產新型抗腫瘤活性化合物的新型培養基，其特點是，每升 所述新型培養基包括可溶性澱粉20 100g,蔗糖10 100g,麥芽糖20 100g,蛋白腖0.5-6g, 酵母膏0.3-6g,黃豆粉0.2-4g,穀氨酸鈉0.5-10g，七水硫酸鎂0.01-lg,磷酸二氳鉀0.01-2g， 其餘為人工海水。
較佳地，所述可溶性澱粉40g,蔗糖40g,麥芽糖30g，蛋白腖2g，酵母膏1.07g,黃 豆粉lg,穀氨酸鈉2g,七水石克酸鎂0.03g，磷酸二氯鉀0.05g。
較佳地，每升所述人工海水包括氯化鈉24.5g,無水硫酸鈉3.92g，無水氯化鉤0.91g, 六水氯化鎂4.98g，硼酸0.026g，氯化鉀0.664g，溴化鉀0.096g，碳酸氫鈉0.192g,其餘為
去離子水。
一種用於製備上述的新型培養基的方法，其特點是，包括步驟
a. 所述可溶性澱粉用部分所述人工海水進行糊化，冷卻；
b. 所述蔗糖，所述麥芽糖，所述蛋白腖，所述酵母膏，所述黃豆粉，所述穀氨酸 鈉，所述七水碌u酸鎂和所述磷酸二氬鉀溶於部分所述人工海水；
c. 將上述兩步驟得到的溶液混合均勻，用所述人工海水定容。
上述步驟a中，所述可溶性澱粉需先用人工海水糊化，目的是防止滅菌過程中結塊的問題。
較佳地，在步驟a中，所述糊化為用部分所述人工海水將所述可溶性澱粉製成懸濁液， 然後緩慢倒入90-10(TC的人工海水中並不斷攪拌，至成半透明狀液體。 較佳地，步驟c進一步包括在121。C，滅菌20 40min。
一種使用上述的新型培養基培養海洋灰綠麴黴HB1-19生產灰綠黴素A的發酵方法， 其特點是，包括步驟取海洋灰綠麴黴HB1-19孢子接種所述新型培養基進行培養，獲得 新鮮接種液，取所述新鮮接種液按10~15%的接種量接入新鮮的所述新型培養基進行發酵 培養6-9天，獲得發酵液。
較佳地，按終濃度約1 10*107個所述海洋灰綠麴黴HBl-19孢子/ml進行接種；所述 培養是在28。C, 170r/min搖床培養30 60h。
一種上述發酵方法生產的灰綠黴素A的檢測方法，其特點是，包括步驟待所述發酵液pH變至7.0左右或所述發酵液變紫黑色後約30h,停止培養；取適量所述發酵液，加入 乙酸乙酯和玻璃珠進行萃取，離心，取適量有機相進行旋轉蒸餾；餾乾物用無水曱醇溶 解，離心；取適量上層液，用無水甲醇稀釋若干倍後，用HPLC測定灰綠黴素A含量,'進 而換算成所述發酵液中灰綠黴素含量。
較佳地，所述發酵液取10ml，所述乙酸乙酯20ml，所述玻璃珠20粒；所述萃取在20。C 和200r/min條件下進行。
本發明的有益效果具體如下
1. 由於本發明的新型培養基成分主要是澱粉、蔗糖、麥芽糖、蛋白腖、酵母膏、黃 豆粉、穀氨酸鈉、七水硫酸鎂、磷酸二氫鉀等常見物質，原料易得，成本低；
2. 製備本發明的新型培養基時，先將澱粉用人工海水製成懸浮液，煮沸糊化，再冷 卻，將其餘組分溶解於人工海水，兩者混合定容即可，製備簡單；
3. 釆用本發明的新型培養基培養目的菌林海洋灰綠麴黴HB1-19，該菌抹在該新型 培養基中可以很好的生長，最終產量可達到71mg/L,是原始水平的4.73倍，顯著促進海 洋灰綠麴黴HB1-19發酵生產灰綠黴素A的產量，有利於大規模(>500L)工業化生產，對 海洋灰綠麴黴發酵研究及灰綠黴素A醫藥學研究具有重要意義。
具體實施例方式
為更好的理解本發明的內容，下面結合具體實施例作進 一 步說明。 實施例l
1.1製備人工海水
稱取氯化鈉24.5g,無水硫酸鈉3.92g,無水氯化鈣0.91g，六水氯化鎂(MgCl2.6H20) 4.98g，硼酸0.026g,氯化鉀0.664g，溴化鉀0.096g,碳酸氫鈉0.192g,用去離子水充分溶 解並定容至IOOO ml。 1.2可溶性澱粉糊化
將40g可溶性澱粉用150ml人工海水製成懸濁液，然後緩慢倒入剛煮沸的人工海水中 並不斷攪拌，至成半透明狀均勻的粘稠狀液體，冷卻。 1.3培養基配製
稱取蔗糖40g,麥芽糖30g，蛋白腖2g,酵母膏1.07g,黃豆粉lg，穀氨酸鈉2g,七水 硫酸鎂(MgS04.7H20) 0.03g,磷酸二氫鉀0.05g,倒入適量人工海水將可溶性成分充分 溶解，再倒入步驟1.2製備的冷卻的澱粉糊化液，再用人工海水定容至1000ml。 1.4發酵生產灰綠黴素A:
海洋灰綠麴黴HB1-19(中國典型培養物保藏中心，保藏編號是CCTCCM 206022),用無菌水從斜面洗下海洋灰綠麴黴HB1-19孢子，按終濃度約(1-10) "0 個/ml接入種 子培養基，於28。C, 170r/min搖床培養30-60 h,按10-15%的接種量接入發酵培養基，培 養6-9天，待發酵液pH變至7.0左右(發酵液變紫黑色後約30h)，停止培養。 1.5灰綠黴素A產量的測定
取上一步驟製備的發酵液10ml，加入20ml乙酸乙酯和20粒玻璃珠，於20。C, 200r/min 萃取10-20h。 12000r/min離心5-10min,取有機相10ml進行旋轉蒸餾，餾千物用2.5ml無水 曱醇溶解，保存於-20。C，取曱醇溶解液lml, 12000r/min離心3min,取上層液250pl，用 無水曱醇稀釋4倍後，用HPLC測定灰綠黴素A含量，進而換算成發酵液中灰綠黴素A含量， 測得灰綠黴素A含量為71 mg/L 。
實施例2
2.1製備人工海水
同實施例l的步驟l.l。 2.2可溶性澱粉糊化
將20g可溶性澱粉用150ml人工海水製成懸濁液，然後緩慢倒入剛煮沐的人工海水中 並不斷攪拌，至成半透明狀均勻的粘稠狀液體，冷卻。 2.3培養基配製
稱取蔗糖100g，麥芽糖20g，蛋白腖6g,酵母膏0.3g,黃豆粉4g，穀氨酸鈉0.5g,七 水硫酸鎂(MgS04'7H20) lg,磷酸二氫鉀0.01g，倒入適量人工海水將可溶性成分充分 溶解，再倒入步驟2.2製備的冷卻的澱粉糊化液，再用人工海水定容至1000ml。 2.4發酵生產灰綠黴素A:
同實施例1的步驟1.4。 2.5灰綠黴素A產量的測定
同實施例1的步驟1.5，測得灰綠黴素A含量為42mg/L。
實施例3
3.1製備人工海水
同實施例l的步驟l.l。 3.2可溶性澱粉糊化
將100g可溶性澱粉用150ml人工海水製成懸濁液，然後緩慢倒入剛煮沸的人工海水中 並不斷攪拌，至成半透明狀均勻的粘稠狀液體，冷卻。 3.3培養基配製稱取蔗糖10g,麥芽糖100g,蛋白腖0.5g,酵母膏6g,黃豆粉0.2g,穀氨酸鈉10g,七 水硫酸鎂(MgS04.7H20) O.Olg，磷酸二氫鉀2g,倒入適量人工海水將可溶性成分充分 溶解，再倒入步驟3.2製備的冷卻的澱粉糊化液，再用人工海水定容至1000ml。 3.4發酵生產灰綠黴素A:
同實施例1的步驟1.4。 3.5灰綠黴素A產量的測定
同實施例1的步驟1.5,測得灰綠黴素A含量為34mg/L。
實施例4
4.1製備人工海水
同實施例l的步驟l.l。 4.2可溶性澱粉糊化
將40g可溶性澱粉用15Oml人工海水製成懸濁液，然後緩慢倒入剛煮沐的人工海水中 並不斷攪拌，至成半透明狀均勻的粘稠狀液體，冷卻。 4.3培養基配製
稱取蔗糖40g,麥芽糖30g,蛋白腖2g，酵母膏lg,黃豆粉0.5g,穀氨酸鈉8g，七水 硫酸鎂(MgS04.7H20) 0.03g,磷酸二氫鉀0.05g，倒入適量人工海水將可溶性成分充分 溶解，再倒入步驟4.2製備的冷卻的澱粉糊化液，再用人工海水定容至1000ml。 4.4發酵生產灰綠黴素A:
同實施例1的步驟1.4。 4.5灰綠黴素A產量的測定
同實施例1的步驟1.5，測得灰綠黴素A含量為21mg/L。
實施例5
5.1製備人工海水
同實施例l的步驟l.l。 5.2可溶性澱粉糊化
將60g可溶性澱粉用150ml人工海水製成懸濁液，然後緩慢倒入剛煮沸的人工海水中 並不斷攪拌，至成半透明狀均勻的粘稠狀液體，冷卻。 5.3培養基配製
稱取蔗糖30g,麥芽糖30g，蛋白腖2g,酵母膏1.5g,黃豆粉lg，穀氨酸鈉4g,七水 硫酸鎂(MgS04.7H20) 0.03g，磷酸二氫鉀0.05g,倒入適量人工海水將可溶性成分充分溶解，再倒入步驟5.2製備的冷卻的澱粉糊化液，再用人工海水定容至1000ml。 5.4發酵生產灰綠黴素A:
同實施例1的步驟1.4。 5.5灰綠黴素A產量的測定
同實施例1的步驟1.5 ，測得灰綠黴素A含量為58mg/L。
對比例l
除培養基採用常用培養基(麥芽糖2%,甘露醇2%，葡萄糖1%,穀氨酸鈉1%, KH2P04 0.05%， MgS04.7H20 0.03%,酵母膏0.3%，玉米漿0.1%,人工海水)(參考文獻DuL,ZhuTJ, Fang YC, Liu HB, Gu QQ, Zhu WM. Aspergiolide A, a novel anthraquinone derivative with naphtho[l，2,3-de] chromene-2，7-dione skeleton isolated from a marine- derived fungus j，rg/〃w51 g/做c^[J]. Tetrahedron 2007， 63:1085-8 )夕卜，其餘發酵生產灰綠黴素A及產量測定條件方法同 實施例1的步驟1.4和1.5,測得灰綠黴素A含量為15mg/L。
通過以上實施例1 ~ 5的實施，本發明的新型培養基原料均為市場上隨處可以買到的普 通產品，價格比較低，製備也非常簡單，與對比例l相比較，本發明的新型培養基能顯著 促進海洋灰綠麴黴HB1-19發酵生產灰綠黴素A,灰綠黴素A的產量得到顯著提高。
綜上所述，本發明的新型培養基原料易得、成本低、製備方法簡單、能顯著促進海 洋灰綠麴黴HB1-19發酵生產灰綠黴素A的產量，有利於大規模工業化生產，對海洋灰綠 麴黴發酵研究及灰綠黴素A醫藥學研究具有重要意義。
需要說明的是，在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一 篇文獻被單獨引用作為參考那樣。應理解，以上所述的是本發明的具體實施例及所運用 的技術原理，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各 種改動或修改而不背離本發明的精神與範圍，這些等價形式同樣落在本發明的範圍內。
權利要求
1. 一種用於海洋灰綠麴黴生產新型抗腫瘤活性化合物的新型培養基，其特徵在於，每升所述新型培養基包括可溶性澱粉20～100g，蔗糖10～100g，麥芽糖20～100g，蛋白腖0.5-6g，酵母膏0.3-6g，黃豆粉0.2-4g，穀氨酸鈉0.5-10g，七水硫酸鎂0.01-1g，磷酸二氫鉀0.01-2g，其餘為人工海水。
全文摘要
本發明提供了一種用於海洋灰綠麴黴生產新型抗腫瘤活性化合物的新型培養基，每升所述新型培養基包括可溶性澱粉20～100g，蔗糖10～100g，麥芽糖20～100g，蛋白腖0.5-6g，酵母膏0.3-6g，黃豆粉0.2-4g，穀氨酸鈉0.5-10g，七水硫酸鎂0.01-1g，磷酸二氫鉀0.01-2g，其餘為人工海水，還提供了其製備方法。本發明的原料易得、成本低、製備方法簡單、能顯著促進海洋灰綠麴黴HB1-19發酵生產灰綠黴素A的產量，灰綠黴素A產量從原始的15mg/L提高到71mg/L，有利於大規模工業化生產，對海洋灰綠麴黴HB1-19發酵研究及灰綠黴素A醫藥學研究具有重要意義。
文檔編號G01N30/00GK101285038SQ200810038598
公開日2008年10月15日 申請日期2008年6月5日 優先權日2008年6月5日
發明者周祥山, 孫學謙, 張元興, 朱天驕, 範衛民, 蔡孟浩, 健 陸, 陶可敬, 顧謙群 申請人:華東理工大學