抗病毒性出血性敗血症病毒g蛋白的單克隆抗體及其應用的製作方法

2023-12-09 03:31:56

專利名稱：抗病毒性出血性敗血症病毒g蛋白的單克隆抗體及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於免疫學領域，具體涉及一種抗病毒性出血性敗血症病毒G蛋白的單克隆抗體,雜交瘤細胞株及建立一種檢測病毒性出血性敗血症病毒的夾心ELISA方法。
背景技術：
病毒性出血性敗血症是感染虹鱒魚類的一種嚴重的致死性傳染性疾病。感染該病魚類的死亡率可達90-100%。它的病原是病毒性出血性敗血症病毒(VHSV)。除了在傳統的宿主一虹鱒魚發現VHSV引起疾病的嚴重暴發外，養殖大菱鮃、養殖或野生牙鮃、白鮭和大西洋鱈魚等也會發現VHSV。VHSV不僅宿主範圍大，而且在不同宿主的致病性具有顯著差異，因而使得控制VHS較為困難。目前，在國際動物衛生組織(OIE)和我國進境動物一、二 類傳染病名錄中均被列為必報疫病(世界動物衛生組織，2000)。該病毒屬於彈狀病毒科Novirhabdovirus屬。病毒的基因組為一段單鏈負鏈RNA,其線性基因組編碼5個蛋白，包括核衣殼蛋白(N蛋白)，兩個結構蛋白(Ml和M2蛋白)，糖蛋白(G蛋白)和RNA聚合酶(L蛋白)。VHSV粒子長約180nm，寬約70nm。其基因組長度為12k 個喊基(Schotze H et al, virus genes, 1999 ;悅穗等，海洋與湖沼，2009)。近年來，我國一些地方，特別是北方地區，為了加快發展，大規模發展了冷水魚類(如虹鱒)養殖，且取得了巨大的經濟效益。過去VHS主要流行於北美洲和歐洲一些國家(MEIER W et al, Fish Diseases, 1980; NISHIZAffA T. et al, Appl. Environ.Microbiol. 2006 ; SCHLOTFELDT H. J. et al, Appl. Ichthyol, 1988; SKALL H.F, Aquat.Org，2005)。可是隨著水生動物及其產品進出口貿易的急劇增加，VHS已經傳入我國，並在我國局部地區流行(牛魯祺等，水產學報，1988)。VHS的有效預報或者診斷是我們必須解決的問題。對其檢測或者鑑定的方法有細胞培養方法、傳統血清學方法和分子生物學方法，他們都受限於各自的特點，細胞培養方法和傳統血清學方法檢測時，費時費力；分子生物學方法存在著假陽性，可信度比較低。單克隆抗體技術的引進，為建立一種簡單快速的檢測方法提供原料基礎。根據VHSV有多種的血清型和基因組具有地域性差異的兩個特點，我們依據中國地區養殖環境和養殖魚類的種類的具體情況，製備出抗VHSV的單克隆抗體，建立一種適合中國地區的簡單、快速和準確的診斷技術。

發明內容
本發明所要解決的第一個技術問題是提供一種抗病毒性出血性敗血症病毒G蛋白的單克隆抗體。本發明所要解決的第二個技術問題是提供一種檢測病毒性出血性敗血症病毒的ELISA試劑盒。本發明所要解決的第三個技術問題是提供了一種體外檢測病毒性出血性敗血症病毒G蛋白的方法。本發明所要解決的第四個技術問題是提供了一種抗病毒性出血性敗血症病毒G蛋白的單克隆抗體在檢測病毒性出血性敗血症病毒和製備檢測病毒性出血性敗血症病毒試劑盒中的應用。—種病毒含有多種抗原,一種抗原又可能含有多個抗原位點。因此針對一種抗原可以獲得不止一種抗體，但是這些抗體對抗原的結合特性可能是不同的。為了找到能與抗原特異性結合的單克隆抗體，需要進行大量反覆比較、篩選和鑑定工作。本發明通過大量的工作，獲得了能分泌特異性結合病毒性出血性敗血症病毒G蛋白的雜交瘤細胞株；並在此的基礎上首次建立了檢測病毒性出血性敗血症病毒的夾心ELISA檢測方法，並製備了檢測病毒性出血性敗血症病毒的ELISA試劑盒，可用於大規模病毒性出血性敗血症病毒的檢測，具有很廣闊的應用前景。為解決上述技術問題，本發明所提供的技術方案如下
本發明所提供的抗病毒性出血性敗血症病毒G蛋白的單克隆抗體，是由保藏編號為CGMCC No. 5797的小鼠雜交瘤細胞株分泌產生。該小鼠雜交瘤細胞株已於2012年2月27 日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址是中國北京市朝陽區北辰西路I號院3號)，其保藏編號為CGMCC No. 5797，其分類命名為抗病毒性出血性敗血症病毒雜交瘤細胞株。保藏編號為CGMCC No. 5797的小鼠雜交瘤細胞株也屬於本發明的保護範圍。本發明還提供了一種檢測病毒性出血性敗血症病毒的ELISA試劑盒，該試劑盒包括本發明所述的單克隆抗體。進一步地，該試劑盒中還包括已包被抗病毒性出血性敗血症病毒的多克隆抗體的固相載體，酶標抗鼠的抗體。所述酶優選為辣根過氧化酶。採用商業化購買的酶標抗鼠的抗體，是因為一方面，若標記本發明中表述的單克隆抗體或者是多克隆抗體，過程比較複雜。即使成功，都可能影響抗體的效價或者抗體的其他方面，使整個試劑盒研發更加繁瑣，耗力，耗時。而應用商業化酶標抗鼠的抗體，則不存在這個問題；另一方面，若標記本發明中的單克隆抗體或者是多克隆抗體，整個試劑盒的成本費用就很高，對於試劑盒推廣應用是不可行的。應用商業化酶標抗鼠的抗體(sigma)，每Iml費用是2000元左右，降低了試劑盒的成本。進一步地，為了便於檢測，本發明試劑盒還包括陽性對照和陰性對照，以及ELISA反應所需的酶聯免疫檢測試劑。其中，所述陽性對照為病毒性出血性敗血症病毒溶液，陰性對照為魚類細胞懸液或者是正常組織勻漿液。所述酶聯免疫檢測試劑，均為常規的酶聯免疫檢測試劑，包括但不限於，酶的底物反應液、洗滌液和反應終止液。本發明所述的抗病毒性出血性敗血症病毒的多克隆抗體的製備過程如下用梯度離心純化的病毒性出血性敗血症病毒作為抗原，多點注射免疫山羊，分別是每I周免疫一次,共免疫4次；取血清純化即為抗病毒性出血性敗血症病毒的多克隆抗體；在經過飽和硫酸銨純化法提取IgG，作為檢測方法中的第一抗體。本發明還提供了一種體外檢測病毒性出血性敗血症病毒的方法，該方法包括以下步驟
(I)將待測樣品加樣於包被有第一抗體的固相載體，從而使待測樣品中的病毒性出血性敗血症病毒與固相載體上的第一抗結合，形成帶有「第一抗體-病毒」二元複合物的固相載體；所述的第一抗體是抗病毒性出血性敗血症病毒的多克隆抗體。(2)將第二抗體加樣於(I)獲得的固相載體，從而形成帶有「第一抗-病毒-第二抗體」三元度和無的固相載體；所述的第二抗體是本發明所述的單克隆抗體。(3)將酶標抗鼠的抗體加樣於(2)獲得的固相載體，從而形成帶有「第一抗體-病毒-第二抗體-酶標抗鼠的抗體」四元複合物。(4)檢測四元複合物中的酶標記物，確定待測樣品中病毒性出血性敗血症病毒的存在與否或存在的量，從而確定病毒性出血性敗血症病毒的存在與否。本發明具有以下優點和效果
I.獲得抗病毒性出血性敗血症病毒G蛋白的單克隆抗體及分泌該單克隆抗體雜交瘤細胞株。該雜交瘤細胞增殖後可製備大量所需的特異抗體；雜交瘤細胞注射小鼠後，產生的腹水單抗ELISA效價為I :1X105 ;雜交瘤細胞株活性高，液氮中凍存8-10個月後，仍能快速復甦並保持良好活性。在所述的單克隆抗體的製備中，細胞融合率為97. 4%，陽性率為98%。2. VHSV對比其他病毒，其免疫原性比較強，所以簡單採用差速離心方法就可以獲 得抗原。製備抗原簡單方便。 3.在篩選過程中，應用了間接ELISA方法，在這種方法中包埋板子採取兩方面的措施，一方面是一次性包埋了大量ELISA板子，保證整個實驗的統一性；另一方面，在包埋樣品中，除了正常的陰性對照(細胞懸液)、病毒性出血性敗血症病毒、空白對照外，也包埋了人工表達的VHSV重組蛋白(N蛋白)。這樣目的雙重保證了獲得製備抗病毒性出血性敗血症病毒G蛋白的準確性，G蛋白是病毒的表面抗原，更適合應用於ELISA方法建立。4.建立的檢測病毒性出血性敗血症病毒的夾心ELISA方法，能夠準確的檢測出細胞懸液中的病毒及組織中病毒存在與否。該檢測方法，預防和診斷中國地區的VHSV提供了有利的條件。


圖I.單克隆抗體的特異性分析M :蛋白分子量1、VHSV的SDS-PAGE 2、單抗與病
毒反應結果。
具體實施例方式下述實施例中所用方法如無特別說明均為常規方法。實施例I抗病毒性出血性敗血症病毒G蛋白的單克隆抗體的製備 I.抗原的製備
將病毒性出血性敗血症病毒懸液先經過8000r/min，離心30min ;取上清在經過24000r/min，離心5h，沉澱是由200微升0. Olmol/LPBS重懸。經過分光光度計測濃度後，用於免疫小鼠。2.免疫小鼠
免疫用的小鼠為SPF級5周齡雌性BALB/c小鼠。每隻小鼠以上述純化後的病毒性出血性敗血症病毒作為抗原進行腹腔注射基礎免疫，人工表達重組蛋白(30微克)與弗氏完全佐劑I :1混合，腹腔注射；2周後加強免疫，病毒性出血性敗血症病毒(30微克)與弗氏不完全佐劑I :1混合，腹腔注射；之後每隔I周加強免疫I次，腹腔注射，人工表達重組蛋白注射120微克/只；第4次免疫後第3天，將小鼠脫頸椎處死，無菌取脾臟用於細胞融合。3.細胞融合常規的細胞融合技術取免疫小鼠的脾臟和SP2/0骨髓瘤細胞進行融合後,加入小鼠的胸腺細胞與融合細胞在HAT培養系中共培養。所述技術中應用的HAT培養基的配製將50倍濃縮的HAT (2ml, GIBCO公司)及特級胎牛血清(20ml，杭州四季青生物工程材料有限公司)加入到改良型RPMI1640培養基(80ml, hyclone公司)中混勻。4.雜交瘤細胞的篩選與克隆
融合細胞培養10天後，收取細胞培養上清，以梯度離心純化的病毒性出血性敗血症病毒和人工表達的病毒性出血性敗血症病毒的N蛋白作為抗原進行間接ELISA檢測。篩選出的陽性雜交瘤細胞株(與病毒反應，不與VHSV的N蛋白反應)有限稀釋法進行克隆。其中陽性的小鼠雜交瘤細胞株已於2012年2月27日保藏於中國微生物菌種保藏管理委員會普通 微生物中心(簡稱CGMCC，地址是中國北京市朝陽區北辰西路I號院3號)，保藏編號為CGMCCNo.5797。5.腹水的誘生
取6 8周齡雌性Balb/C小鼠，腹腔內注射無菌的液體石蠟0. 5 ml /只；1周後，腹腔內注射陽性雜交瘤細胞；接種雜交瘤細胞後7 10天，見小鼠腹部明顯膨大，抽腹水，離心後收集上清，_80°C凍存備用。實施例2 :抗病毒性出血性敗血症病毒G蛋白的單克隆抗體的特性鑑定；
I.單克隆抗體的腹水效價鑑定方法採用間接ELISA法對單克隆抗體的腹水效價進行鑑定。結果本發明所述的單克隆抗體腹水效價為I :1X105，表明雜交瘤細胞株具有分泌高滴度抗體的能力。2.單克隆抗體的亞型鑑定
方法應用用美國的SouthernBiotech的分型試劑盒(SBA Clonotyping System/HRP)，依照其說明書對本發明所述單克隆抗體的Ig亞型進行鑑定。結果本發明所述單克隆抗體的亞型為IgG3型k鏈。3.單克隆抗體的特異性分析 免疫印跡法(western blotting)
以純化病毒性出血性敗血症病毒為檢測組，設正常的EPC細胞裂解物為陰性對照，免疫小鼠血清為陽性對照，經十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，用電轉法將凝膠上的蛋白分別轉移到硝酸纖維素膜(NC膜，孔徑0. 20 u m)上，經含質量體積為10%的脫脂奶粉的0. OlMPBS溶液中4°C封閉過夜；PBS-T (含體積百分比為0. 05%的Tween-20的PBS溶液中)洗滌後，加入小鼠的腹水(單克隆抗體I :1000稀釋於PBS)，37°C孵育Ih ;再次PBS-T (含體積百分比為0. 05%的Tween-20的PBS溶液中)洗滌後，以辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗小鼠IgG為二抗，37°C孵育Ih ;洗滌後，用底物混合液DAB顯色觀察。結果見圖1，本發明製備的抗病毒性出血性敗血症病毒G蛋白的單克隆抗體，能特異的與病毒蛋白帶發生反應，反應處蛋白帶分子量為70kDa。經過文獻證實其為病毒性出血性敗血症病毒G蛋白。實施例3檢測病毒性出血性敗血症病毒的ELISA試劑盒的組成檢測病毒性出血性敗血症病毒的ELISA試劑盒的組成為實施例I製備的單克隆抗體；包被抗病毒性出血性敗血症病毒的多克隆抗體的固相載體；辣根過氧化酶標記的羊抗鼠抗體(購自sigma公司)；酶的底物反應液；陽性對照；陰性對照；洗滌液；反應終止液。其中，羊抗VHSV的多克隆抗體的製備和包埋ELISA條板用梯度離心純化的病毒性出血性敗血症病毒作為抗原，多點注射免疫山羊，分別是每I周免疫一次，共免疫4次；取血清純化即為抗病毒性出血性敗血症病毒的多克隆抗體；採用飽和硫酸銨沉澱方法,沉澱2次，飽和硫酸銨濃度分別為50%和33%，最終的沉澱用PBS溶解，裝入透析袋，於4°C下透析72h,期間換液至少4次/天。用包被緩衝液(0. 05mol/L碳酸鹽緩衝液，pH 值9. 6)將純化羊多克隆抗體稀釋至濃度g/ml，包被96孔ELISA酶標板(美國Corning公司)，100iil/孔，4°C過夜。取出後用PBST洗板3次，每次5min，甩幹。用0. Olmol/LPBS稀釋1%的明膠封閉，每孔150iil，37°C封閉lh。取出後用PBST洗板3次，每次3min，甩幹，乾燥後_80°C保存。10 X PBST 的配製NaCl :80 g，Na2HPO4 I 2H20 : 29 g，KH2PO4 :2 g, KCl :2g，吐溫-20 5 ml，蒸餾水加至 1000 ml, 4 °C保存。酶的底物反應液是10%硫酸鹽(TMB，sigma，用二甲基甲醯胺配置):150 iil，H202 4u l,pH 5.0檸檬酸-磷酸緩衝液10ml。現用現配。陽性對照為病毒性出血性敗血症病毒溶液，陰性對照為魚類細胞懸液或者是正常組織勻漿液。洗滌液為如前述PBST配製。反應終止液用蒸餾水配製2mol/LH2S04。實施例4 :檢測病毒性出血性敗血症病毒的夾心ELISA檢測方法 夾心ELISA方法步驟
I.向包被有羊抗VHSV的IgG的ELISA酶標板加入分別用兩種方法稀釋的擴增的病毒(病毒的滴度為IO6 TCID50)，一種方法是應用0. 01mol/l的PBS以10倍比進行稀釋；另一種方法是應用正常的虹鱒組織進行稀釋。2.將第二抗體，即實施例I製備的抗病毒性出血性敗血症病毒G蛋白的單克隆抗體，稀釋400倍，加入到酶標板上。3.將辣根過氧化酶標記的羊抗鼠抗體按商品說明進行稀釋，然後加入到酶標板上。4.洗滌酶標板
5.加入酶的底物反應液
6.終止反應
結果如表2所示，建立的夾心ELISA法能夠特異的檢測出病毒性出血性敗血症病毒，且滴度能夠達到IO5 TCID50。表2檢測病毒性出血性敗血症病毒的夾心ELISA法的檢測結果
P/NI 病毒 10。 jlO—1 |10_2 |10_3
0. Olmol/LPBS 稀釋病毒4. 123. 01 I. 73 I. 24
正常虹鱒組織稀釋病毒丨5. 01丨3. 81 |l. 73 |l.24
顯然，本發明的上述實施例僅僅是為清楚地說明本發明所作的舉例，而並非是對本發
明的實施方式的限定。對於所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這裡無法對所有的實施方式予以窮舉。凡是屬於本發明的技術方案所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處於本發明的保護範圍之列 。
權利要求
1.抗病毒性出血性敗血症病毒G蛋白的單克隆抗體，是由保藏編號為CGMCCNo. 5797的雜交瘤細胞株分泌產生。
2.分泌產生抗病毒性出血性敗血症病毒G蛋白的單克隆抗體的雜交瘤細胞株，其保藏編號為 CGMCC No. 5797。
3.一種檢測病毒性出血性敗血症病毒的ELISA試劑盒，其特徵在於，所述的試劑盒包括權利要求I所述的單克隆抗體。
4.根據權利要求3所述的試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒還包括已包被抗病毒性出血性敗血症病毒的多克隆抗體的固相載體，酶標抗鼠的抗體。
5.根據權利要求4所述的試劑盒，其特徵在於，所述酶為辣根過氧化酶。
6.根據權利要求4或5所述的試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒還包括陽性對照和陰性對照。
7.根據權利要求6所述的試劑盒，其特徵在於，所述陽性對照為病毒性出血性敗血症病毒的病毒溶液，陰性對照為魚類細胞懸液或者是正常魚類組織勻漿液。
8.ー種體外檢測病毒性出血性敗血症病毒的方法，其特徵在於，包括以下步驟 (1)將待測樣品加樣於包被有第一抗體的固相載體，從而使待測樣品中的病毒性出血性敗血症病毒與固相載體上的第一抗結合，形成帶有「第一抗體-病毒」 ニ元複合物的固相載體；所述的第一抗體是抗病毒性出血性敗血症病毒的多克隆抗體； (2)將第二抗體加樣於(I)獲得的固相載體，從而形成帶有「第一杭-病毒-第二抗體」三元複合物的固相載體；所述的第二抗體是權利要求I所述的單克隆抗體； (3)將酶標抗鼠的抗體加樣於(2)獲得的固相載體，從而形成帶有「第一抗體-病毒-第ニ抗體-酶標抗鼠的抗體」四元複合物； (4)檢測四元複合物中的酶標記物，確定待測樣品中病毒性出血性敗血症病毒的存在與否或存在的量，從而確定病毒性出血性敗血症病毒的存在與否。
9.權利要求I所述的單克隆抗體在檢測病毒性出血性敗血症病毒中的應用。
10.權利要求I所述的單克隆抗體在製備檢測病毒性出血性敗血症病毒試劑盒中的應用。
全文摘要
本發明公開了一種抗病毒性出血性敗血症病毒G蛋白的單克隆抗體及其應用。該抗病毒性出血性敗血症病毒G蛋白的單克隆抗體是由保藏編號為CGMCC No.5797的小鼠雜交瘤細胞株分泌產生的。該抗病毒性出血性敗血症病毒G蛋白的單克隆抗體可用於檢測病毒性出血性敗血症病毒。本發明還公開了一種檢測病毒性出血性敗血症病毒的ELISA試劑盒。
文檔編號G01N33/577GK102702350SQ20121015427
公開日2012年10月3日 申請日期2012年5月17日 優先權日2012年5月17日
發明者張旻, 景宏麗, 江育林 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院