活的減毒的細小病毒的製作方法

2023-12-09 03:22:26 2

專利名稱：活的減毒的細小病毒的製作方法
活的減毒的細小病毒 本發明涉及活的減毒的細小病毒，它們的用途，包含這種活的減毒的細小病毒的疫苗以及它們的生產方法。細小病毒屬於單鏈DNA病毒科。在各種動物如貓、狗和豬中，細小病毒可引起疾病。因為病毒需要活躍分裂的細胞以便複製，感染的組織的類型隨動物的年齡而變化。在任何年齡都可以影響胃腸道和淋巴系統，導致嘔吐、腹瀉和免疫抑制，但是在子宮內或在小於兩周齡時被感染的貓中僅看到小腦發育不全，在3周和8周齡之間被感染的小狗中看到心肌疾病。犬細小病毒(CPV)是在小狗中尤其致命的疾病，約80%致死，在非常年幼的小狗中引起胃腸道損傷和脫水以及心臟綜合症。它是通過與被感染的狗的糞便接觸而傳播的。症狀包括嗜睡、嚴重腹瀉、發燒、嘔吐、食欲不振和脫水。豬細小病毒在豬中引起被稱為SMEDI的生殖疾病，其代表為死胎、木乃伊化、胚胎死亡和不孕。貓泛白細胞減少症，通常被 稱為貓瘟熱，是一種影響貓的病毒感染，由犬細小病毒的近親貓細小病毒(FPV)引起。貓泛白細胞減少症在小貓中常見，並引起發燒、低白細胞數、腹瀉和死亡。小於兩周的貓胎兒和小貓的感染引起小腦發育不全。水貂腸炎病毒在對貓泛白細胞減少症的作用中是相似的，除了它不會引起小腦發育不全。不同的細小病毒在水貂和其它鼬科動物中引起阿留申病(Aleutian Disease)，其特徵在於淋巴結病、脾腫大、腎小球性腎炎、貧血和死亡。細小病毒的最準確的診斷方法是通過ELISA。通常對貓、狗和豬進行針對細小病毒的免疫。在DNA水平上，已知犬、貓和豬細小病毒具有高度同源的基因組。犬細小病毒CPV2是一種在狗中引起急性、且有時是致命的腸炎的病毒(Kelly，Aust. Vet. J. 54 ；593,1978;Appel等，Vet. Rec. 105 ；156-159, 1979)。1977年左右首先出現的該病毒可能通過單個衣殼蛋白中少數突變而從在貓中非常密切相關的病毒(即貓泛白細胞減少症病毒(FPLV))產生的；物種跳躍可能涉及在其它食肉動物(如水貂或浣熊)的中間傳遞(Truyen等，Virology 215，186-189，1996)。早在1979年，出現了 CPV2的第一種變異體，被稱為CPV2a，隨後很快在1984年出現了 CPV2b (Parrish 等，Science 230，1046-1048, 1985，和 J. Virol. 65 ;6544_6552，1991)。最初的2型病毒現在已經從野外(field)消失，被2a和2b型所替代，儘管這兩種類型的相對比例在國與國間有變化(前面的Truyen等；Chinchkar等，Arch. Virol. 151,1881-1887，2006 ;Pereira 等，Infect. Genet. Evol. 3，399-409，2007)。在衣殼蛋白(VP2)中的胺基酸變化，其特徵為從2至2a以及至2b的轉變，是非常有限的。在87 (Met至 Leu) >300 (Ala 至 Gly) >305 (Asp 至 Tyr)和 555 (Val 至 He)位的替換發生在 2 至 2a的進化中，在426 (Asn至Asp)和555 (lie至Val)的替換發生在從2a出現2b中(前面的Parrish 等；Truyen 等，J. Virol. 69，4702-4710, 1995)。最近，報導了在 555 位缺乏Val 至 Ile 替換的 2a株(Wang 等，Virus Genes 31, 171-174，2005 ;Martella 等，VirusGenes 33，11-13，2006)。似乎單一的胺基酸改變可以區分CPV2a和CPV2b VP2序列。新近，在義大利出現了病毒株，其中426位的胺基酸(2a中為Asn，2b中為Asp)已經變為穀氨酸(Glu)殘基(Buonavoglia 等，J. Gen. Virol. 82，3021-3025，2001 ；Martella 等，J. Clin. Microbiol. 42，1333-1336，2004)。這些被稱為 CPV2c 病毒的Glu 426變異體是在義大利和其他歐洲國家傳播的(circulating)並與其它CPV類型共存(Decaro 等，J. Vet. Med. B. Infect. Dis. Vet. Public Health 53, 468-472，2006),並且也已經在地理上多樣的國家如越南和蘇格蘭分離得到(Nakamura等，ArchVirol. 149, 2261-2269，2004，Spibey 等，Vet. Microbiol 128，48-55，2008)，這些事實表明它們在至少一定比例的狗群體中具有優勢。犬細小病毒的相對快速進化已經導致貓宿主範圍的丟失以及然後重新獲得(前面的Truyen等，1996)，這種重新獲得的在貓中複製的能力可以很好地解釋2a、2b和2c變異體對最初的2型病毒的替代。在二十世紀七十年代末期和二十世紀八十年代早期，由於刺激交叉保護的共享抗原，活的和滅活的FPL疫苗用於保護狗免於CPV疾病，然而它們提供的保護水平較差，免疫持續時間較短。這些疫苗被活的減毒CPV疫苗所替代，其提供了良好的保護和更長的免疫持續時間。目前活的減毒疫苗來自CPV2b分離物或最初的2型病毒。 由於2型病毒已經在該野外中被2a、2b以及現在的2c病毒完全替代，已經考慮到對於減毒的 2 型疫苗提供的保護水平(Pratelli 等，Clin. Diag. Lab. Immunol. 8, 612-615，2001 ；Truyen, Vet. Microbiol. 69, 47-50，1999)。然而，基於現有的單克隆抗體的研究，與以前的變異體相比，每種新的抗原變異體已經失去至少一個中和表位(Strassheim等，Virology 198, 175-184，1994 ;前面的Pereira等)。以前已經表明，即使用針對各種抗原類型產生的血清在體外進行的交叉中和研究的確顯示出顯著差異(前面的Pratelli等)，活的減毒的CPV2疫苗能夠保護狗免於2a 和 2b 野外攻擊(Greenwood 等，Vet. Record. 136, 63-67，1995)。最近顯示，活的減毒的2型疫苗(Nobivac-Intervet)能夠保護狗免於用最近的CPV 變異體 CPV2C 的攻擊(Spibey 等，Vet. Microbiol 128，48-55，2008)。儘管如此，在疫苗領域中存在著誘導動物、尤其是貓、狗和豬中足夠水平的免疫以免於感染和具有高度減毒行為的細小病毒的疫苗相組合的需求。高水平的減毒與安全性是同義的，尤其在年幼和年老的動物中。本發明的一個目的是提供減毒的同時仍然免疫原性的新的活細小病毒。這種病毒提供了用於安全的疫苗的基礎。在這個方面，本發明的一個實施方案涉及活的減毒的細小病毒(PV)，其包括在衣殼蛋白的219位胺基酸處除了異亮氨酸以外的胺基酸和/或在衣殼蛋白的386位胺基酸處除了穀氨醯胺以外的胺基酸(條件是，PV不是犬細小病毒疫苗Nobivac Parvo C中存在的CPV0在這種CPV(犬細小病毒疫苗Nobivac Parvo C的CPV)中包含的序列如SEQ ID NO: I中所示。令人驚訝地發現，在衣殼基因的219和386位胺基酸這兩個位點，在病毒的減毒中起著重要作用。直到現在，假設衣殼區域之外的胺基酸主要參與病毒的毒力/減毒。在犬和貓細小病毒中，無論血清型，衣殼蛋白的219位胺基酸處的異亮氨酸和衣殼蛋白的386位胺基酸處的穀氨醯胺的位置是相同的。這意味著，本發明可以至少普遍地適用於貓細小病毒和犬細小病毒。本發明也可以應用於例如豬細小病毒，所述豬細小病毒具有衣殼蛋白的219位胺基酸處的異亮氨酸和衣殼蛋白的386位胺基酸處的穀氨醯胺。
具體而言，從本發明排除要求保護的是，犬細小病毒疫苗Nobivac ParvoC(Intervet Schering-Plough Animal Health)中存在的 CPV,其包含如 SEQ ID NO: I 所不的序列。因此，本發明的第一個實施方案涉及活的減毒的細小病毒(PV)，其包括編碼在衣殼蛋白的219位胺基酸處除了異亮氨酸以外的胺基酸和/或在衣殼蛋白的386位胺基酸處除了穀氨醯胺以外的胺基酸的衣殼基因，條件是，PV不包含SEQ ID N0:1所示的序列。僅僅是為了表示219位胺基酸處的異亮氨酸和386位胺基酸處的穀氨醯胺的位置，下面顯示了在大多數CPV和FPV毒株中發現的序列背景的例子中這兩個胺基酸(以粗體字符表示)。
權利要求
1.活的減毒的細小病毒(PV)，特徵在於其包含編碼在衣殼蛋白的219位胺基酸處除了異亮氨酸以外的胺基酸和/或在衣殼蛋白的386位胺基酸處除了穀氨醯胺以外的胺基酸的衣殼基因，條件是，所述活的減毒的細小病毒不包含SEQ ID N0:1所示的序列。
2.權利要求I的活的減毒的細小病毒，特徵在於其包含編碼在衣殼蛋白的219位胺基酸處除了異亮氨酸以外的胺基酸和在衣殼蛋白的386位胺基酸處除了穀氨醯胺以外的胺基酸的衣殼基因。
3.權利要求I或2的活的減毒的細小病毒(PV)，特徵在於其包含編碼在衣殼蛋白的219位胺基酸處的纈氨酸和/或在衣殼蛋白的386位胺基酸處的賴氨酸的衣殼基因。
4.權利要求1-3中任一項的活的減毒的細小病毒，其特徵在於所述細小病毒是重組細小病毒，其中所述細小病毒的非衣殼區域的一部分的DNA片段被源自第二細小病毒的非衣殼區域的一部分的同源DNA片段所替代，其中所述第二細小病毒的所述同源DNA片段攜帶減毒突變。
5.權利要求4的活的減毒的細小病毒，其特徵在於所述第二細小病毒的所述同源DNA片段在非結構區中從2061位至2070位的區域中攜帶減毒突變。
6.權利要求1-5中任一項的活的減毒的細小病毒，其特徵在於所述細小病毒是犬細小病毒或貓細小病毒。
7.權利要求1-6中任一項的活的減毒的細小病毒，其特徵在於所述細小病毒編碼CPV血清型2a、2b或2c的衣殼蛋白或貓細小病毒的衣殼蛋白。
8.用於保護動物免於細小病毒感染的疫苗，其特徵在於所述疫苗包含權利要求1-7中任一項的活的減毒的細小病毒和藥學上可接受的載體。
9.用於保護動物免於病原體的組合疫苗，其特徵在於所述組合疫苗包含權利要求8的疫苗和對動物致病的病毒或微生物的額外的抗原或編碼所述病毒或微生物的免疫原性蛋白的遺傳信息。
10.權利要求9的組合疫苗，其特徵在於所述對動物致病的病毒或微生物選自犬埃立克體(Bkrlichiacanis)、吉氏巴貝斯蟲(Babesiagibsonf)、vogeli、rossi、杜氏利什曼原蟲-複合體Heishmania dono vani -comp lex)、犬腺病毒、犬冠狀病毒、犬d i s t emperv i ru s、犬鉤端螺旋體血清型腎臟鉤端螺旋體{Lep tospira in terrogansserovar canicola)、黃痕出血鉤端螺旋體(icterohaemorrhagiae)、pomona、流感傷寒型鉤端螺旋體igrippotyphosa)、犬肝炎病毒、犬副流感病毒、狂犬病毒、犬肝簇蟲Qlepa tozoon canis)、伯氏疏螺旋體iBorroliet burgdorferi)、波氏支氣管敗血ijiordetella、貓皰疫病毒、貓杯狀病毒、貓白細胞減少症(felinepanleucopenia)和貓衣原體{Chlamydophila felis)。
11.用於製備權利要求8的疫苗或權利要求9或10的組合疫苗的方法，其特徵在於所述方法包括混合權利要求1-7中任一項的活的減毒的細小病毒和藥學上可接受的載體。
12.權利要求1-7中任一項的活的減毒的細小病毒，其用作藥物。
13.權利要求1-7中任一項的活的減毒的細小病毒，其用於細小病毒感染的治療中。
14.用於製備權利要求1-7中任一項的細小病毒突變體的方法，其特徵在於所述方法包括通過重組DNA技術將在219位胺基酸處編碼異亮氨酸的密碼子和/或在386位胺基酸處編碼穀氨醯胺的密碼子改變為在219位胺基酸處編碼除了異亮氨酸以外的胺基酸的密碼子和/或在386位胺基酸處編碼除了穀氨醯胺以外的胺基酸的密碼子的步驟。
15.用於製備權利要求1-7中任一項的細小病毒突變體的方法，其特徵在於所述方法包括編碼至少部分細小病毒衣殼蛋白的DNA片段，所述DNA片段在219位胺基酸處具有編碼異亮氨酸的密碼子和/或在386位胺基酸處具有編碼穀氨醯胺的密碼子，被編碼細小病毒衣殼蛋白的相同部分的DNA片段所替代，所述DNA片段現在在219位胺基酸處具有編碼除了異亮氨酸以外的胺基酸的密碼子和/或在386位胺基酸處具有編碼除了穀氨醯胺以外的胺基酸的密碼子。
全文摘要
本發明涉及活的減毒的細小病毒，它們的用途，包含這種活的減毒的細小病毒的疫苗以及它們的生產方法。
文檔編號C12N7/04GK102985108SQ201180034991
公開日2013年3月20日 申請日期2011年7月18日 優先權日2010年7月16日
發明者N.施皮貝 申請人:英特維特國際股份有限公司