新的腫瘤阻抑基因的製作方法

2023-12-09 04:47:21

專利名稱：新的腫瘤阻抑基因的製作方法
本申請是1993年12月20日遞交的序號為U.S.08/170,586的申請的部分續申請，該申請的內容作為本發明的參考。
背景技術：
本發明屬於腫瘤阻抑基因(抗—癌基因)領域，並且總的來說涉及實施針對各種人癌症的廣譜腫瘤阻抑基因治療法所用的產品和方法。特別是本發明涉及治療腫瘤細胞的方法，該方法包括(1)以含有為本文中稱作為H-NUC的新的蛋白質編碼的核酸序列的載體給藥或者(2)以有效量的由該核酸序列編碼的蛋白質給藥。
在美國癌症和腫瘤是第二大最流行的死亡原因，每年導致450,000人死亡。在三個美國人中將有一人得癌症並且五個人中有一個將死於癌症(Scientific American Medicine，第12部分，I，1，章節，1987年)。在鑑別引發癌症的某些類似環境和遺傳原因方面取得了實質性進步，而癌症死亡率統計學數字表明對癌症和其它相關疾病和紊亂的治療有待實質性的改善。
已有人識別出許多與癌症的遺傳方式相關的所謂癌症基因，即癌症病因學中涉及的基因，並存在於許多的經過充分研究的腫瘤細胞中。對癌症基因進行研究可幫助我們弄懂腫瘤發生過程。而有關癌症基因仍遺留許多問題有待研究，目前已知的癌症基因可用作為理解腫瘤發生的有效的模型。
從廣義上說可將癌基因劃分為「癌基因」，和「腫瘤阻抑基因」，當將「癌基因」活化時，可促進腫瘤發生，而將「腫瘤阻抑基因」破壞時，不能阻抑腫瘤發生。這些分類方式提供了用於將腫瘤發生概念化的有效方法，而依據某個基因的特定的等位基因形式，其調節元件，遺傳背景以及其起作用的組織環境不同，一個特定的基因可以產生不同的作用。
一種普遍認為的假設的癌症活動方式如下(1)大多數各種類型的人癌症是遺傳疾病並且(2)癌症是由特定基因(即正常細胞生長調節基因的突變形式或病毒或其它外源基因)在哺乳動物細胞中進行不恰當，不定時的表達或表達失敗或其它各類重要的生長調節基因的異位表達引起的。
對瘤形成的生物基礎的較簡單看法是存在兩個大類的癌基因。第一種類是由正常細胞基因的徑突變的或另外的異常的等位基因組成的，它們參與對細胞生長或複製的控制。這些基因是細胞的原癌基因。被突變時，它們可以編碼破壞正常細胞生長和複製的新的細胞功能。這些變化的結果是產生了顯性表達的腫瘤表現型。在該顯性表達癌基因的模型中，由於出現了瘤形成的遺傳和突異基礎的概念，形成了一種居支配地位的觀點，假設在細胞的發育進程或生長特性中單個野生型某位基因的存在不足於阻止瘤形成的變化。因此對這些癌基因的活化起作用的遺傳因素被想像的「單擊」事件。在伯基特氏淋巴瘤中mye癌基因的腫瘤發生活動的活化，和在患有慢性骨髓性的白血病的患者中表達bcr-ab1嵌合基因產物，以及其它腫瘤中H-ras和K-ras癌基因的活化代表了在臨床人癌症中有所述轉化癌基因參與的某些證據。針對顯性表達瘤形成疾病的基因治療的方法可能要求負責基因的表達特定地關閉或失活。腫瘤阻抑基因最新發現的癌相關基因族是所謂的腫瘤阻抑基因，有時稱作為抗癌基因，生長阻抑或癌阻抑基因。最近研究強烈地暗示在該類基因中喪失了功能突變，所述基因可能參與高百分數的人癌症的發生；在幾種人癌症中已經鑑別出許多個人腫瘤阻抑基因的合適的候選物。已經鑑別並克隆了參與成視網膜細胞瘤(rb)，乳腺，結腸和其它癌(p53)，wilm腫瘤(wt)以及結腸癌(dcc)的發病機制的腫瘤阻抑基因。已經闡明了它們在人腫瘤形成的作用的某些方面。
成視網膜細胞病(RB)是原養型腫瘤阻抑基因。在各種各樣的人腫瘤中已經發現了該基因的突變(Bookstein andLee，Crit.Rev.Oncog.，2211-227(1991)；Goodrich andLee，Biochim.Biophys.Acta.，115543-61(1993)；Riley etal.，Annu.Rev.Cell Biol.，101-29(1994))。在裸鼠中將單拷貝的正常RB重導入到腫瘤細胞中抑制了其形成腫瘤的能力(Huang et al.，Science，2421563-1566(1988)；Sumegiet al.，Cell Growth Differ.，1247-250(1990)；Bookstein efal.，Science，247712-715(1990)Chen et al.，Cell GrowthDiffer.，3119-125(1992)；Goodrich et al.，Proc.Natl.A-cad.Sci.USA，885257-5261(1991)。另外，在細胞周期的G1期早期將未磷酸化的Rb蛋白質微注射到細胞中阻止其發育到S期，表明Rb蛋白根本上參與了細胞生長的調節過程(Goodrich et al.，Cell，67293-302(1991))。通過最近在基因工程鼠系中觀察結果進一步證實了這些結果。從一個人Rb轉基因過量表達的Rb蛋白結果導致生物體水平上的生長延滯(Bignon et al.，Genes Del.，71654-1662(1993))。此外，在由於RB基因的純合失活而導致功能性Rb表達完全消除的鼠胚胎中，未成熟時停止發育並且胚胎死於子宮內(Lee et al.Nature，359288-294(1992)；Jacks等人，Nature，359295-300(1992)；Clarke et al.，Nature，359328-330(1992))。這些實驗為確定Rb蛋白在細胞生長和體內分化中的重要性提供了基本資料。
Rb基因編碼一種核蛋白，該蛋白質的絲氨酸和蘇氨酸殘基以依賴細胞周期的方式被磷酸化(Lee et al.，Nature，329642-645(1987)；Buchkovich et al.，Cell，581097-105(1989)；Chen ef al.，Cell，581193-1198(1989)；De Caprioet al.，Cell，581085-1095(1989)。在細胞周期的G1階段，按照微注射試驗，蛋白質是活化時，Rb以低磷酸化狀態存在(Goodrich et al.，Cell，67293-302(1991)；Goodrich andLee，Nature，360177-179(1992))，低磷酸化的Rb也存在於G0階段。在該靜止期，該Rb似乎是有維持細胞的關鍵作用，而在該階段，Rb等待著對外部信號作出應答並作出進入細胞周期或者進行分化的決定(Goodrich and Lee，Biochim.Biophys.Acta.，115543-61(1993)；Pardee，A.B.，Science，246603-608(1989)。
在晚G1，S，和M期，可能由CDK激酶族成員將Rb高磷酸化(Lees et al.，EMBO J.，104729-4290(1991)；Lin etal.，EMBO J.，10857-864(1991)；Hu et al.，Mol Cell.Bi-ol.，12971-980(1992))。Rb上某些殘基發生磷酸化可能允許細胞進行增殖。Rb蛋白質的磷酸化方式與其生長抑制功能有關，因此目前可接受的假設是磷酸化作用對該蛋白質的生長阻抑功能具有負調節作用(Hollingsworth et al.，Cu-ur.Opin.Genet.Dev.，355-62(1993)；Sherr，C.J.，TrendCell Biol.，415-18(1994))。在中M期出現了Rb蛋白的去磷酸化作用，並導致在下一細胞周期之前使該蛋白質被重活化。有證據強力地表明1型蛋白磷酸酶是該脫磷酸化作用的關鍵(Alberts et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，90388-392(1993)；Durfee et al.，Genes Dev.，7555-569(1993))。
目前尚未完全闡明Rb參與這些細胞活動的分子機理。一種通用的模式認為Rb與許多不同的細胞蛋白質相互作用，並且藉助這些複合物發揮其功能。如果Rb蛋白質的功能是將細胞保持在G0/G1階段，Rb必須將是活性的並且是進入G1期必要的其它蛋白質圍在一起並使之失活(Lee etal.，CSHSOB，LVI211-217(1991))。這種「圍捕」假設與最近觀察結果相一致，最近實驗結果認為一種重要的生長加強轉錄因子，E2F-1以負方式嚴格地受Rb調節(Helin et al.，Cell，70337-350(1992)；Kaelin et al.，Cell 70351-364(1992)；Shan et al.，Mol.Cell.Biol.，125620-5631(1992)；Helin et al.，Mol.Cell.Biol.136501-6508(1993)Shen ef al.，Mol.Cell.Biol.，14229-309(1994)。本文公開的蛋白質，H-NUC與Rb蛋白質相結合，並因此參與調節有絲分裂。
採用連鎖分析方法分析某一家簇的乳腺癌基因BRCA-1在染色體17q21-22上的定位圖。尚不清楚的是該基因起著腫瘤阻抑基因的作用或者起著顯性癌基因的作用。但是，在人家簇癌綜合症例如Li-Fraumeni綜合症中涉及的基因p53明顯地具有傳統的腫瘤阻抑基因的作用；同樣，RB基因的丟失與遺傳性成視網膜細胞瘤有關(Knudson，1993，見上文)。多個步驟以及癌基因的合作在轉化癌基因和純隱性腫瘤阻抑基因的這兩個最大的圖譜之間存在許多明顯地與許多人腫瘤的瘤形成變化特性演化相關的其它原理。許多年來已經確信許多人癌可能是由多種相互影響的遺傳缺陷症引發的，任何一種缺陷症單獨存在不足於使腫瘤演化，腫瘤的發育要求所有遺傳缺陷症出現。在哺乳動物的瘤形成中細胞原癌基因和生長調節腫瘤阻抑基因的真實作用被認為相當於這兩類基因之間的系列複合的相互作用。
發明概述本發明基於發現了一種編碼具有腫瘤阻抑能力的新蛋白質(H-NUC)的核酸分子。已將該核酸分子定位於染色體17的q21-22區。H-NUC(從全長CDNA得到的胺基酸序列；能夠與DNA結合併激活轉錄；在某些乳腺腫瘤細胞系中將該編碼序列進行重排或丟失)的特性與H-NUC作為一種核蛋白和腫瘤阻抑蛋白的特性相符合。新近公開的全長cDNA編碼了一種新824胺基酸蛋白質。該新的蛋白質含有TPR(34個胺基酸的肽)蛋白質族的十個34胺基酸重複區特性。
本文公開了利用核酸和蛋白質H-NUC的診斷方法。本發明還涉及在不具有內源性野生型H-NUC蛋白質的已建立的癌細胞中施用野生型H-NUC腫瘤阻抑基因或蛋白質用於阻抑，根除或逆轉瘤形成表現型。本發明第一次證實了將野生型H-NUC基因施用到已建立的癌細胞中可以阻抑或逆轉丟失了野生型H-NUC蛋白質的已建立的人癌細胞中瘤形成表現型或特性。這種對瘤形成表現型的阻抑作用繼而阻抑或根除類似癌細胞的不正常群體即腫瘤，這種阻抑作用繼而可能降低動物體對這種腫瘤的負擔，繼而可以增強被治療動物的存活率。被監測和逆轉的瘤形成特性包括喪失了正常H-NUC蛋白質的癌細胞的形態學，生長情況，以及最令人驚奇的是腫瘤發生性。因此，動物「腫瘤細胞負擔降低」是在以野生型H-NUC腫瘤阻抑基因給藥之後「阻抑了瘤形成表現型」的結果。「瘤形成表現型」可理解為是指細胞特性方面表現型的變化例如形態學，生長速率(例如加倍所需時間)，飽和密度，軟瓊脂菌落形成以及腫瘤性質(tumorici-ty)。
因此，本發明提供了編碼H-NUC的載體和用於治療腫瘤或癌症的H-NUC蛋白質，以及製備適用於治療方法中的H-NUC蛋白質和載體的方法。
本發明還提供了治療哺乳動物例如人的方法，以及治療異常增殖細胞例如癌症或腫瘤細胞的方法或者阻抑瘤形成表型的方法。廣義上說，本發明關注用任何合適方式治療異常增殖細胞或者治療以具有異常增殖細胞為特點的疾病的哺乳動物，已知所適用的方法允許與宿主細胞相容的H-NUC編碼載體或一種H-NUC蛋白質進入待治療的細胞，從而達到阻抑增殖的目的。
在一個實施方案中，本發明包括通過給具有以異常增殖細胞為特性的疾病的哺乳動物施用一種編碼H-NUC的表達載體，將表達載體插入到異常增殖細胞，並在異常增殖細胞中表達其量能有效地抑制那些細胞增殖的H-NUC，從而對具有以異常增殖細胞的特性的疾病的哺乳動物進行治療的方法。所述表達載體通過病毒感染或轉導，脂質體介導的轉染，聚凝胺—介導的轉染，CaPO4介導的轉染和電擊穿，插入到異常增殖的細胞中。按照需要重複治療。
在另一個實施方案中，本發明包括通過將一個編碼H-NUC的表達載體插入到異常增殖的細胞中並在其中表達能有效抑制所述細胞增殖的量的H-NUC，而對一種哺乳動物的異常增殖細胞進行治療的方法。如果需要治療可重複進行。
在另一種可選擇的實施方案中，本發明提供了一種能夠阻抑異常增殖細胞生長的DNA分子。該DNA分子編碼一種Rb結合蛋白，該分子包括一個具有至少與C-末端的9個四三共肽重複區有60％同源性的一個亞序列，條件是該DNA分子不再為S.pombe母NUC 2，構巢麴黴bimA和CDC27編碼。這樣一種Rb結合蛋白的實例是基本上具有SEQ ID NO.-的胺基酸序列的H-NUC蛋白質。在一個更優選的實施方案中，該DNA分子具有SEQ ID NO.1的DNA序列，並且由一種表達載體所表達。該表達載體可以是與任何宿主細胞相容性載體。優選地是該載體選自於由反轉錄病毒載體，腺病毒載體和皰疹病毒載體組成的組。
在另一個可選擇方案中，本發明提供了基本上具有SEQID NO.-的胺基酸序列的H-NUC蛋白質及其生物學活性片段。
在另一個可選擇方案中，本發明提供了採用下列步驟生產H-NUC蛋白質的方法將含有H-NUC編碼基因的相容性表達載體插入到宿主細胞中並使該宿主細胞表達H-NUC蛋白質。
在另一個可選擇方案中，本發明包括按下列步驟給患有異常增殖細胞的哺乳動物體外治療的方法從哺乳動物中取出需要治療的組織樣品，該組織樣品包括異常增殖細胞；將需要治療的組織樣本與有效劑量的編碼H-NUC的表達載體相接觸；在異常增殖細胞中表達能有效地抑制異常增殖細胞的增殖所需量的H-NUC。按照需要進行重複治療；將待治療的組織樣品返回到原始或其它哺乳動物中。優選的是，體外治療的組織是血或骨髓組織。
在另一個可選擇的實施方案中，本發明包括給哺乳動物治療特徵在於異常細胞增殖的疾病的方法，該包括下列步驟給患有以異常細胞增殖為特徵在疾病的哺乳動物施用H-NUC蛋白質，結果是H-NUC蛋白質以有效地抑制細胞的異常增殖的量插入到異常增殖細胞中。在一個優選的實施方案中，H-NUC蛋白質是為了插入到待治療細胞而用膠囊包被的脂質體中。按照需要可重複治療。
在另一個可選擇實施方案中，提供了能夠與H-NUC基因雜交的寡核苷酸片段以及利用這些片段的檢測方法。這些寡核苷酸至少含5個核苷酸，而由約20-約30個寡核苷酸組成的寡核苷酸是優選的。這些寡核苷酸非強制性地用放射性同位素(例如氚，32P和35S酶(例如鹼性磷酸酶和辣根過氧化物氧化酶)，螢光化合物(例如，螢光素，錠，鋱絡合物)或化學發光化合物(例如吖啶鎓酯，異魯末諾等等)進行標記。這些。這些以及其它標記物，例如在「Non-isotopic DNAProbe Techmrques」，L，J.Kricka，Ed.，Academic Press，NewYork，1992，(引入本文作參考)討論的，可與本文的寡苷酸一起使用。可將它們用於常規形式的DNA探針檢測中，例如Southern和northern印跡分析。這種常規形式檢測方法的描述可參見例如「Nacleic Acid Hybridization-A Practical Ap-proach」，B.D.Hames and S.J.Higgins，Eds.，IRL Press，Wash-ington，D.C.，1985，引入本文作參考，優選的是這些探針能在嚴謹條件下與H-NUC基因進行雜交。也可將這些寡核苷酸用作為聚合鏈反應技術的引物，如在例如「PCR Technol-ogy」，H.A.Ehrlich，Ed.，Stockton Press，New York，1989以及類似的參考資料描述的技術。
附圖描述

圖1A和1B顯示為了與H-NUC和T-抗原結合需要的RB的類似區域。圖1A是用於確定結合區的Gal4-RB融合體的圖解。將Gal4 DNA結合區(1-147位胺基酸)與各種RB突變體融合。影線框顯示RB的T/EIA結合區。打點框描述了受突變影響的區域。圖1B顯示在體內檢測到的H-NUC和RB突變體之間的相互作用。用指定的一組Gal4-RB突變體成員識及Gal4-CH-NUC)表達克隆(Gal4-(C-49))或YIpPIG10共轉化Y153。根據Durfee等人，GenesDevel.7555-569(1993)(引入本文作參考)描述，採用氯苯-紅-β一半乳糖苷比色檢測法(CPRG)對β-半乳糖苷酶活性進行定量檢測，每種轉化設置三個同樣的實驗組。
圖2A和2B顯示H-NUC與未磷酸化的RB的結合。圖2A顯示GST以及框架內GST與編碼H-NUC的cDNA的融合(GST-491)以及大腸桿菌中表達的SV40 T抗原(GST-T)的氨基末端273胺基酸。GST和GST-融合體與穀胱肽-瓊脂糖珠結合併充分地洗滌。通過對SDS-聚丙烯醯胺凝膠進行考馬斯亮藍染色而對樣品定量檢測，並且每一泳道中使用等同的蛋白質量。圖2B顯示的是從WR2E3細胞製備的提取物，所述細胞在室溫下與結合樣品混合30分鐘。在經過廣泛洗滌之後，採用SDS-聚丙烯醯胺凝膠分離複合物並轉移進行免疫吸印。通過用抗-Rb mAb 11D7抗體進行免疫沉澱(泳道1)而確定WR2E3細胞中存在的Rb蛋白質的量以及其磷酸化程度。用抗Rb mAb 11D7探查該印跡並採用螢光X線照相術進行觀察。
圖3是全長H-NUC cDNA和蛋白質的核苷酸(SEQ.I.D.NO1)和推測的胺基酸(SEQ.I.D.NO2)序列。
圖4A和4B顯示全長H-NUC編碼蛋白質的34個胺基酸的肽重複(TPR)族的成員。圖4A顯示十個34-殘基多肽重複單元在H-NUC，裂殖酵母S.pombe nuc2+和構巢麴黴bim A蛋白質中的定位。示意圖顯示了此十個(0～9)34-殘基多肽重複單元(TPR)在nuc2+、H-NUC、和bim A蛋白質中的位置。稱作34v-重複的該三個多肽中的重複單元3(斜線框所示)缺乏保守基元。圖4B是這9個TPR重複單元(1-9)胺基酸序列在nuc2+、-H-NUC和bim A蛋白質中的線性排列。框線內的保守殘基。所有三個蛋白質的TPR重複單元6在第6位為甘氨酸。nuc2的重複6的甘氨酸6被認為是必要的。
圖5A和5B顯示H-NUC的C末端TPR重複與RB蛋白質結合。圖5A是用來測定結合域的Gal4-H-NUC融合體的圖解。Gal4反式活化正被融合到各種H-NUC缺失突變體。-H-NUC的TPR重複單元示於斜線影線框。圖5B顯示在活體內RB和H-NUC缺失突變體之間相互作用的測試結果。所示泳道的Gal4-H-NUC突變體或者與Gal4-RB2或者與Gal4-H209一起共轉化Y153。每次轉化重複三次b-半乳糖苷酶活性的CPRG定量。
圖6A和6B顯示出640位胺基酸殘基的必要甘氨酸的突變產生了溫度敏感H-NUC突變體，該突變體在不許可溫度下與RB的結合能力降低。圖6A詳細示出了在H-NUC(640D)中的胺基酸取代。muc2的必要甘氨酸(G)(540位的胺基酸)在溫度敏感突變體中被精氨酸(D)所取代。因此，H-NUC的640位胺基酸殘基的甘氨酸變成了天冬氨酸(D)。圖6B顯示在37℃RB和H-NUC(640D)突變體間的相互作用。Gal4-RB2或者和Gal4-H-NUC或者和Gal4-H-NUC(640D)一起共轉化Y153。轉化子在液體培養基中於28℃培養24小時。用新鮮培養基稀釋過夜酵母培養物，並將其培養於37℃。在不同的時間點取等分的酵母培養物來測定酵母的生長(OD660)和β-半乳糖苷酶活性。每次轉化β-半乳糖苷酶活性的CPRG定量做三個重複。
圖7A和7B顯示抗H-NUC抗血清的產生及在人細胞系中H-NUC的檢測。圖7A中，用Gst-491融合蛋白來免疫小鼠。免前血清(泳道1)、免疫血清(泳道2)、與Gst蛋白預保溫的免疫血清(泳道3)和與Gst-491蛋白質預保溫的免疫血清用來進行免疫沉澱。從K-562細胞中製備S35-標記的細胞溶胞產物。等量的細胞溶胞產物用於免疫沉澱。所得的免疫沉澱物在SDS-聚丙烯醯胺凝膠上電泳分離。圖7B中，從CV-1細胞中製備S35-標記的細胞溶胞產物。等量的細胞溶胞產物被用於免前血清(泳道1)、或免疫血清(泳道2和3)的免疫沉澱。將所得的免疫沉澱物在200μl含溶液(泳道3)的2％SDS中煮沸變性，用200μl的NETN緩衝液稀釋之。在SDS-聚丙烯凝膠電泳上分離該免疫沉澱物。如箭頭所指，免疫血清特異地識別出90KD的蛋白質。
圖8顯示H-NUC蛋白具有DNA-結合活性。S35-甲硫氨酸代謝標記的K562蛋白溶胞產物通過雙鏈小牛胸腺DNA-纖維素柱，並用增高濃度的NaCl洗脫。洗脫物或者用(A)mAb 11D7免疫沉澱來定位RB蛋白，或者用(B)免疫血清識別H-NUC來定位H-NUC。(C)等量的洗脫物不用來與穀胱甘肽瓊脂糖珠一起溫育。
圖9顯示編碼H-NUC的基因定位於染色體17q21-22。
圖10A和10B是用H-NUC做探針時，乳腺瘤細胞DNA的Southern印跡分析的結果。從細胞系中抽提DNA，用EcoRI消化之。圖10A中探針標記的細胞系印跡均是正常的。圖10B中，細胞系TA47D和MB157K中H-NUC基因的純合缺失很明顯。14Kbp EcoRI片段的雜交的減少揭示在細胞系MB231、BT0578-7和BT549中出現了該基因的雜合缺失。
圖11顯示在活體外AC-H-NUC抑制T-47D乳腺瘤細胞的細胞生長。左上方顯示用ACN(MOI10)感染3天的並用結晶紫染色的MDA-BAB-231細胞。右上方顯示由ACN(MOI10)感染的T-47D細胞。左下方顯示由AC-H-NUC(MOI10)感染的MDA-MB-231細胞。右下方顯示由AC-H-NUC感染的T-47D細胞。(+/-)表示MDA-MB-231細胞對H-NUC來說是雜合的。(-/-)表示T-47D細胞含有H-NUC的純合缺失(ref.Lee，W.H.)。AC-H-NUC是重組的人腺病毒，其含有在人CMV啟動子控制下的H-NUC腫瘤阻抑基因。ACN是不含H-NUC腫瘤阻抑基因的同樣的重組人腺病毒載體。
圖12顯示AC-H-NUC在活體外阻抑T-47D腫瘤細胞的生長。將T47-D(H-NUC缺失的)和MDA-MB-231(H-NUC雜合的)乳腺癌細胞鋪96孔板，並用AC-H-NUC或ACN從10和100倍複數感染之(重複四次)。細胞生長5天，用摻入到細胞核酸中的3H-胸苷來測量增殖。AC-H-NUC數據(平均數±SD)對ACN對照的平均增殖的百分數在相應的MOI做圖。
圖13顯示AC-H-NUC抑制裸鼠中T-47D腫瘤生長。在體外用ACN或AC-H-NUC以30感染複數(N＝4/組)處理T-47D人乳腺癌細胞。將大約107細胞皮下注射到裸鼠的脅腹，每隻動物在一側脅腹接受ACN處理的細胞，對照側接受AC-H-NUC細胞。用測經器測量腫瘤大小，用球體幾何學計算估測來源於ACN和AC-CBTSG細胞所得的腫瘤做圖。來源於未處理細胞的雙側腫瘤的平均體積(±SD)做的圖用作對照。
本發明的詳細描述本發明提供了新型的定名為H-NUC的哺乳動物蛋白質。H-NUC由824個胺基酸組成(圖3)，具有大約95KD的分子量，並已經發現它與非磷酸化的全長的成視網膜細胞瘤(RB)蛋白相互作用。還發現H-NUC的衍生物，為H-NUC蛋白的截短型，在其C-末端含有最後6個「TPR」區(34個胺基酸的肽，34-胺基酸重複)，換名話說，含有從559到770位的胺基酸，與野生型Rb蛋白質結合。對該蛋白質的突變破壞其成視網膜細胞瘤—結合的功能可引起超增殖病理學，即RB阻性細胞的特徵，如乳腺癌細胞。
H-NUC蛋白質是人蛋白，因此能從人組織中純化之。「純化」當用來描述H-NUC蛋白質或核酸序列的狀態時，指的是該蛋白質或編碼H-NUC的DNA不含在天然環境中與H-NUC蛋白質或編碼H-NUC的DNA正常結合的其它蛋白質或分子。在此所用的術語「天然」指的是DNA、蛋白質、多肽、抗體或其片段是從自然界中分離出來的形式或者是沒有有意的胺基酸變化，即取代、缺失或增加的那些形式。用本領域普通技術人員所知的方法可從SDS凝膠中收穫純化95kd H-NUC蛋白質，例如按下面更詳細的描述將含H-NUC的細胞抽提物首先與抗-H-NUC抗體反應進行沉澱。分離蛋白抗體複合物，並用在此引作文獻的Fisher等，Techniques in Protein Chemistry，ed.T.E.Hugli，AcademicPress，Inc.，PP.36～41(1989)中所描述的方法的SDS凝膠中洗脫收穫該95kd H-NUC蛋白質。
在此所用的術語「超增殖細胞」包括但不限於具有自主生長，即不依賴於正常調控機制存活和再生能力的細胞。超增殖疾病可分成病理學類，即源於正常細胞的特徵化或組成性疾病，或者可分成非—病理學類，即源於正常但與疾病的狀態無關。病理學超增殖細胞是下列疾病狀態的特徵甲狀腺增生—格雷夫斯氏病、銀屑病、良性前列腺肥大、Li-Frau-meni綜合症、癌包括乳腺癌、肉瘤和其它贅生物、膀胱癌、結腸癌、肺癌、各種白血病及淋巴瘤。非病理學超增殖細胞的例子也被發現了，例如，在哺乳動物泌乳發育過程的導管上皮細胞中和與傷口恢復相關的細胞中。病理學超增殖細胞特徵性地表現出接觸性抑制的喪失和選擇性粘附的下降，該選擇性粘附揭示細胞表面性質的變化和細胞間連結的進一步打破。這些變化包括分裂的剌激及蛋白水解酶的分泌能力。而且，將該蛋白質或編碼該蛋白質的核酸導入細胞使失去的H—NUC功能從導入或補充能使該細胞恢復到非—超增殖狀態。然後細胞的惡性增殖能被阻止了。
如本領域的技術人員所知，術語「蛋白質」指由肽鍵連接的特定順序的線性胺基酸聚合體。除非特別指出在此所用的術語「胺基酸」指胺基酸的D或L立體異構型。H-NUC衍生物或等同物，如具有純化的H-NUC蛋白質的生物活性H-NUC截短的蛋白、多肽或H-NUC肽也被包含在本發明的範圍之內。H-NUC衍生物是指遠離天然存在的蛋白質或多肽的線性序列，但具有胺基酸改變，即取代、缺失或插入以致所得的H-NUC衍生物保留H-NUC生物學活性。「生物學活性或生物活性」將意味著一方面具有能同非磷酸化成視網膜細胞瘤蛋白P110RB結合的能力。如果，例如高度保守的甘氨酸(640位氨其酸)被變成精氨酸時，H-NUC結合Rbd37℃喪失。這些H-NUC衍生物可由於一個或多個相關胺基酸的胺基酸缺失、取代或插入而同天然序列區別開來，例如，相似的帶電胺基酸或側鏈或官能團的取代或修飾。
進一步認識到在不破壞其功能的情況下，可對H-NUC的初級序列進行限制性修飾，而且為影響活性只需整個初級序列的一部分，所影響的一個方面即為與p110RB結合的活性。編碼p110RB的核酸序列已由Lee，W.H.等在Science 2351394-1399(1987)公開發表，將其在此引為參考文獻。它的生物學功能的另一方面是H-NUC與DNA結合的能力。本領域的技術人員可用Lee，W.-H.等在Nature(London)329642～645(1987)中描述的方法來測定其結合DNA的能力，該篇文獻在此引作參考。一種生物學活性的H-NUC衍生物是在H-NUC的C-未端的含有最後6個TPR區蛋白質和融合蛋白-Gal4-C49，下面將詳述之。Gal4-C49衍生物具有如圖3所示的從559位胺基酸到該序列末端的序列。含有衍生物的TPR為圖3所示具有559位到770位的胺基酸序列。而且，除了前面所述的Gal4-C49融合蛋白或TPR衍生物外，那些保留了整個蛋白功能的具有圖3所示胺基酸序列的片段也被包括在H-NUC衍生物的定義之內。這些H-NUC衍生的可通過限制性酶消化圖3的核酸分子並將所得的片段重組表達而產生。認識到對初級胺基酸序列的較小修飾能得到與圖3所列的序列相比，其具有實質上等同的或增強的功能的蛋白質。這些突變可以是很精細的，如通過定點突變，或者是隨機的，如通過H-NUC產物的受體的突變。只要保留H-NUC的生物活性，所有這些修飾都將被包括在內。
「抑制性活性」將意味著H-NUC蛋白突變體或片段(突變蛋白)，該突變蛋白以顯隱性形式抑制蛋白質的正常功能，即抑制H-NUC的生物學作用—介導受體細胞分裂和/或受體細胞增殖的作用。這些蛋白質和片段可通過本領域的技術人員所熟知的那些化學方法得到。這些突變蛋白和抑制性活性片段在促進細胞的超增殖的治療中十分有用，並可用於生產如抗體的診斷試劑。
用下述的方法在活體外或活體內將細胞與該試劑接觸，這些試劑將有利於促進或抑制細胞的生長或增殖。相應地，本發明了提供了一種通過將細胞與試劑接觸，抑制例如象乳腺癌細胞的超增殖細胞的生長或增殖的方法還提供了治療，如乳腺癌，由超增殖細胞生長特徵化的病理學的方法，即通過對適當的主體施給有效量濃度的這些試劑使細胞增殖得以抑制。該方法適當的主體包括但不限於脊椎動物、猿猴、鼠類和人類患者。
本發明也提供了含有上面所述的任一組分和一種或多種藥物學可接受的載體的藥物組合物。藥物學可接受的載體是本領域所熟知的包括水溶液如生理緩衝的水或其它溶劑或載體如乙二醇、甘油、植物油(如橄欖油)或可注射的有機酯。藥物學可接受的載體可用於在活體外對細胞或在活體內對主體給藥H-NUC或其衍生物。
藥物學可接受的載體可含有生理學上可接受的化合物，這些化合物起作用，例如穩定蛋白質或多肽或增加或減少該試劑的吸收。生理學上可接受的化合物包括，例如，碳水化合物如葡萄糖、蔗糖、葡聚糖，抗氧化劑如抗壞血酸、谷光甘肽，螯合劑，低分子量的蛋白質或其它穩定劑或賦形劑。其它生理可接受的化合物包括增溼劑、乳化劑、分散劑或對防止微生物生長或作用特別有用的防腐劑。各種防腐劑均是熟知的，包括，例如，石炭酸和抗壞血酸。本領域的技術人員知道依據，例如，多肽給藥的途徑和該特定多肽的特殊的生理—生化特性來選擇藥物學可接受的載體，包括生理學可接受的化合物。例如，象單硬脂酸鋁或明膠的生理學可接受的化合物作為延遲劑是十分有用的。它們能延長施給主體的藥物組合物的吸收速率。載體、穩定劑或佐劑的進一步的例子可在Martin，Remington′s Pharm.Sci.15th Ed.(Mack Publ.Co.，Easton，1975)中找到，這篇文獻的此引作參考。如果需要，也可將藥物組合物摻入到脂質體、微球體或其它多聚體基質中(Gregoriadis，Liposome Technology，Vol.1(CRC Press，BocaRaton，Florida 1984，該文獻在此引作參考)。脂質體，例如，由磷脂或其它類脂組成，相對來說較容易製得和施給，是無毒性的生理可接受的和可代謝的載體。
純化的H-NUC(蛋白質)或H-NUC(核酸)藥物組合物對抑制細胞，如乳腺癌細胞的生長很有用，即通過使細胞與純化的H-NUC或活性片段或含這些多肽或蛋白質的組合物接觸。
為實現本發明的目的，所述的接觸效果可在活體外、離體或活體內取得。當在活體外抑制細胞時，通過將本發明的核酸或蛋白質組合物與細胞培養基混合，然後以之飼餵細胞達到接觸的效果或者通過直接將核酸組合物或蛋白質加到培養基中達到接觸的效果。測量有效量的方法對本領域的技術人員來說都是熟知的。
本方法也可用於治療和預防與主體活體內的異常增殖細胞相關的病理學。因此，當在活體內取得接觸的效果時，以抑制該主體細胞增殖的有效量給藥有效量的本發明組合物。為本發發明的目的，「主體」指任何脊椎動物，如動物，哺乳動物、人或大鼠。本方法對治療和預防具有無功能H-NUC蛋白產物的患者的乳腺癌患者是特別有用的。
藥物給藥的方法在本領域是熟知的，包括但不限於口服、靜脈內、肌肉內或腹膜內給藥。可連續地或間斷地實現給藥，如同用其它治療重組蛋白質一樣，給藥方式隨著主體的不同而異。(Landman等，J.Interferon Res.12(2)103-111(1992)；Aulitzky等，Eur.J.Cancer 27(4)462-467(1991)；Lantz等，Cytokine 2(6)402-406(1990)；Supersaxo等，Pharm.Res.5(8)472-476(1988)；Demetri等，J.Clin.On-col.7(101545-1553(1989)；和LeMaistre等Lancet.3371124-1125(1991))。
本發明不進一步提供了編碼相應於純化的哺乳動物H-NUC蛋白質H-NUC衍生物、突變蛋白、其活性片段和抗-H-NUC抗體的胺基酸序列的分離的核酸分子。在此所用的「核酸」是指單鏈和雙鏈DNA、cDNA和mRNA。在一個實施方案中，編碼H-NUC蛋白質和片段的核酸分子具有圖3所示的序列或其部分。那些在嚴謹條件能與核酸分子或其補體雜交的核酸分子，例如圖3所示的序列，也包括在本發明的範圍之內。這些雜交的核酸分子或探針可通過，例如圖3的核酸分子的缺口翻譯而製備，在這種情況下，雜交的核酸分子可以是該分子、圖3所示序列的隨機片段。製備這些片段的方法學，參見Sambrook等，Molecular CloningA Laborato-ry Manual，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989)，該書在此引作參考。含至少10個核苷的核酸片段作為雜交探針十分有用。分離的核酸也用於產生新的肽。反過來，這些肽被用作產生多克隆和單克隆抗體的免疫原。製備和使用這些探針和免疫原的方法對本領域的技術人員來說是熟知的。
這些核酸分子也用於抑制細胞的細胞分裂和增殖。將該核酸分子插入細胞，使細胞培養在該核酸能編碼H-NUC蛋白質，並使之達到有效濃度的條件下，從而抑制細胞的生長。為達本發明的目的，可通過脂質體或脂質體DNA或其它基因載體如Sambrook等在Supra公開發表的病毒載體將該核酸插入，Supra在此引作參考。具有突變的H-NUC蛋白質產物的乳腺癌細胞即為得益於本方法的細胞。
用轉基因治療人類疾病現在已從理論階段進入到實踐的階段。第一例人類基因療法開始於1990所9月，即將腺苷脫氨酶基因轉入患者的淋巴細胞，該患者患有此酶的致命性缺陷，產生了免疫缺陷。這一開創性試驗的結果具有極大的鼓舞作用，並有助於進一步推動臨床試驗(Culver，K.W.，An-derson，W.F.，Blaese，R.M.，Hum.Gene.Ther.1991，2107)。
到目前為此，大部分已成功的人類轉基因試驗均依賴於逆病毒載體的基因轉導。本文所稱的逆病毒載體是已除去或變更了所有病毒基因的逆病毒，從而使受該載體感染的細胞不產生病毒蛋白質。用產生所有病毒蛋白質不產生病毒蛋白質。用產生所有病毒蛋白質但並不產生有侵染性病毒的逆病毒包裝細胞提供病毒的複製功能。逆病毒載體DNA導入包裝細胞，結果產生病毒粒子，該病毒粒子帶有載體RNA並能侵染靶細胞，但侵染後不能進一步產生病毒的傳播。為了區別這一過程與天然病毒侵染的不同，其中天然病毒侵染後繼續複製和傳播，術語「轉導」比「侵染」更常用。
僅為描述的目的，核酸的插入傳遞系統是複製—非競爭性逆病毒載體。在此所用的術語「逆病毒」包括，但不限於，載體或具有選擇靶位並使核酸導入分裂細胞能力的傳遞載體。在此所用的術語「複製—非競爭」定義為不能產生病毒蛋白質，防止該載體在受侵染的寄主細胞內傳播。
複製—非競爭性逆病毒載體的另一個例子是LNL6(Miller，A.D等，BioTechniques 7980～990(1989))，該文獻在此引作參考。用複製—非競爭性逆病毒進行標記基因的逆病毒—介導的基因轉移的方法已經很好地建立了(Correll，P.H.等，PNAS USA 868912(1989)；Bordigton，C.等，PNASUSA 868912-52(1989)；Culver，K.等，PNAS USA 883155(1991)；Rill，D.R.等，Blood 79(10)2694～700(1991)，所有的這些文獻在此均引作參考。臨床研究表明沒有或幾乎沒有與該病毒載體相關的副作用(Anderson，Sci-ence 256808～13(1992))。
逆病毒載體用於基因療法的主要的好處是將基因高效轉入複製細胞，轉入基因精確整合到DNA上，和基因轉導後沒有該序列的進一步傳播(Miller，A.D.，Nature，1992，357455～460)。
在生產逆病毒載體的過程中，複製—競爭性(輔助)病毒產生的潛在可能性仍是人們關心的問題，雖然在實際應用中此問題已經解決了。迄今為此，所有的FDA—合格的逆病毒載體是用PA317雙性逆病毒包裝細胞製得的(Miller，A.D.，和Buttimore，C.，Molec.Cell Biol.，1986，62895～2902)。在PA317細胞內使用沒有或很少與病毒序列重疊的載體可免除輔助病毒的產生，即使在允許此類事件放大的嚴謹的試驗中(Lynch，C.M.，和Miller，A.D.，J.Viral，1991，653887～3890)。也可用其它包裝細胞系。例如，設計用來分離不同質粒上不同的逆病毒編碼區的細胞系可通過重組減少輔助病毒產生的可能性。由這些包裝細胞系產生的載體也為人類的基因療法提供了有效的系統(Miller，A.D.，1992 Nature，357455～460)。
已經考慮非—逆病毒載體用於遺傳治療。一個這樣的選擇即為腺病毒(Rosenfeld，M.A.，等1992，Cell，68143～155；Jaffe，H.A.等，1992，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，896482～6486)。腺病毒載體的主要優點是它們能攜帶大DNA片段(36kb的基因組)，效價高(1011/ml)，能在原位特別是在肺部侵染組織。迄今為止使用該載體最令人興奮的是通過氣管內滴注將人包囊纖維化轉膜傳導調節(CFTR)基因導入棉鼠的氣道表皮(Rosenfeld，M.A.，等，Cell，1992，63145～155)類似地，證明了皰疹病毒對人類的基因療法也是有價值的(Wolfe，J.H.等，1992，Nature Genetics，1379～384)。當然，其它任何合適的病毒載體可用於本發明的遺傳療法。
用於人類的由FDA證明的其它轉基因的方法是在人細胞的原位用質脂體直接轉移質粒DNA(Nabel，E.G.，等1990Science，2491285～1288)。質粒DNA應易於證明能用於人基因療法，因為不象逆病毒載體，它可以被純化成均質的。除了質脂體—介導的轉移外，其它幾種物理學DNA轉移方法如通過將質粒DNA與蛋白質複合使DNA定位於細胞上的受體的那些方法已在人類基因療法中顯示了前景(Wu，G.Y.，等1991 J.Biol.Chem.，26614338～14342；Curiel，D.T.等，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，888850～8854)。
通過本領域技術人員熟知的方法將本發明的H-NUC的編碼基因置於表達載體，如質粒或病毒表達載體上。通過磷酸鈣轉染、質脂體(例如，LIPOFECTIN)—介導轉染、DEAE—葡聚糖介導轉染、聚凝胺—介導的轉染、電穿孔和將DNA導入細胞的其它方法可將質粒表達載體導入腫瘤細胞。
病毒表達載體可通過感染或轉導以表達型導入靶細胞。這樣的病毒載體包括，但不限於，逆病毒、腺病毒、皰疹病毒和禽痘病毒。當H-NUC在任何異常增殖的細胞內表達時，細胞的複製周期被阻礙，因此結果是細胞老化和細胞死亡並且最終是異常組織，即腫瘤或癌的體積的減小。可以用任何有效的方法將能將基因導入靶細胞並能在細胞內表達H-NUC的載體以細胞增殖—抑制量給藥。
例如，可通過局部、眼內、腸胃外口服、鼻內、靜脈內、肌肉內、皮下或其它任何有效的方法給藥含有有效濃度活性載體的生理上適當的溶液。特別地，用針頭將治療靶組織腫瘤細胞有效量的載體直接注射到靶癌或腫瘤組織。
選擇地，在體腔內存在的癌或腫瘤，如在眼內、胃腸道內、泌尿生殖道內(例如尿道膀胱)、肺和支氣管系統內和其它存在的癌或腫瘤可接受生理上適當的組合物(即溶液如鹽水或磷酸鹽緩衝液，懸浮液、或乳劑，除載體外它們是經過消毒的)，該組合物含有效濃度的活性載體，通過針頭直接注射或導管或其它置於遭受癌或腫瘤痛苦的中空的器官中的傳遞管給藥該組合物。任何可想到的裝置如X—射線、聲波圖或視纖維成像系統可用於靶組織的定位和用於針頭和導管的指引。
在另一個可選擇的方案中，對那些不能直接到達並可被解剖分離出的腫瘤或癌進行治療。可將含有有效濃度活性載體的生理上適當的溶液通過血液循環系統地給藥。
在另一個可選擇的方案中，可用任何已知的方法將H-NUC蛋白質導入靶腫瘤或癌細胞而對其進行治療。例如，脂質體是人工膜載體，它們可用於在活體外或活體內(Manni-no，R.J.等，1988，Biotechniques，6682～690)將藥物、蛋白質和質粒載體傳入靶細胞(Newton，A.C.和Huestis，W.H.，Biochemistry，1988，274655～4659；Tanswell，A.K.等1990，Biochmica et Biophysica Acta，1044269～274；和Ceccoll，J.等，Journal of Investigative Dermatology，1989，93190～194)。因此，H—NUC蛋白質可與脂質體載體高效地包入囊中，並將之在活體內或活體外導入哺乳動物細胞。
質脂體—包裹的H-NUC蛋白質可通過局部、眼內、腸胃外、鼻內、氣管內、支氣管內、肌肉內、皮下或其它任何有效的方式以有效治療靶組織異常增殖細胞的劑量給藥。將含有有效濃度的包裹的H-NUC蛋白質的任何生理上適當的組合物以脂質體給藥。
其它載體用於本發明也是合適的，並將選擇出有效傳遞編碼H-NUC的基因的載體。該核酸可以是DNA，cDNA或RNA。
在一個獨立的實施方案中，本發明的分離的核酸分子與RNA轉錄的啟動子連接在一起。這些核酸分子用於重組生產H-NUC蛋白質和多肽或作為載體用於基因治療。
本發明也提供了在其中插有上面所述分離的核酸分子的載體。例如，合適的載體可以是，但不限於質粒，粘粒或病毒載體。合適載體的例子參見Sambrook等，Supra，和Zhu等，Science 261209～211(1993)，該文獻在此引作參考。當插入適當的寄主細胞即原核或真核細胞時，可重組產生H-NUC。適當的寄主細胞或包括哺乳動物細胞、昆蟲細胞、酵母細胞、和細菌細胞。參見在此引作參考的Sambrook等，Supra。
本發明提供了生產H-NUC重組體或其衍生物的方法，將上面所述的寄主細胞生長在適當的條件下使編碼H-NUC或其片段的核酸得以表達。合適的條件用本領域技術人員熟知的方法確定。例子參見在此引作參考的Sambrook等，Supra。本發明也提供了由此方式產生的蛋白質和多肽。
本發明也提供了能與H-NUC蛋白質或其片段特異地形成複合體的抗體。術語「抗體」包括多克隆抗體和單克隆抗體。抗體包括但不限於小鼠、大鼠、兔或人的單克隆抗體。
在此所用的「抗體或多克隆抗體」指的是對抗原或受體進行免疫應答而產生的蛋白質。術語「單克隆抗體」意思是由單克隆細胞產生的免疫球蛋白。由該克隆產生的所有單克隆抗體在化學上和結構上是一致的，並且對單一抗原決定簇是特異的。
生產多克隆抗體和單克隆抗體的實驗方法在本領域是已知的，參見在此引作參考的Harlow和Lane，AntibodiesALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，New York(1988)。本發明的單克隆抗體可通過將H-NUC或其片段導入動物，如小鼠或兔子而生物製得。將動物的抗體產生細胞分離出來，並將之與瘤細胞或雜交瘤細胞融合產生雜交細胞或雜交瘤。相應地，也提供了生產本發明單克隆抗體的雜交瘤。以這種方式生產的單克隆抗體包括，但不限於下面所述的單克隆抗體。
因此，用H-NUC蛋白質或其衍生物，和熟知的方法，本領域的技術人員能生產和篩選具有和H-NUC結合能力的本發明抗體的雜交瘤細胞和抗體。
本發明也提供了上面所述的具有生物學活性的多克隆和單克隆抗體的片段。這些「抗體片段」保留了一些和抗原或免疫原選擇性地結合的能力。這樣的抗體片段可包括，但不限於(1)Fab，該片段含有單價抗原—結合的抗體分子片段，所述的抗體分子通過用木瓜蛋白酶消化產生完整的輕鏈和一重鏈的一部分而產生；(2)Fab′，該片段是用胃蛋白酶處理，接下來還原，以產生完整的輕鏈和部分重鏈而獲得的抗體分子片段；每個抗體分子可獲得兩個Fab′片段；(3)(Fab′)2，該片段是用胃蛋白酶處理但不進行隨後的還原步驟而獲得的抗體片段；(Fab′)2是由兩個二硫鍵連在一起的兩個Fab′的聚合體；(4)Fv，定義為含有輕鏈可變區和重鏈可變區表達作為兩鏈的遺傳工程片段；和
(5)SCA，定義為由適當的多肽接頭連接的含有輕鏈可變區，重鏈可變區和遺傳融合的單鏈分子的遺傳工程分子。
製備這片片段的方法在本領域是已知的，例子參見Har-low和Lane，Supra，這篇文獻在此引作參考。
「生物活性抗體片段」的特異的例子包括抗體的CDR區。
本發明還提供了與抗體或其生物活性片段特異起反應的抗——獨特型肽。在此所用的「抗——獨特型肽」是從一個種中純化的抗體，該抗體被注射到遠緣種中，被識別為外源抗原而且產生強烈的體液免疫應答。對一般方法學的討論，參見在此引為參考的Harlow和Lane的Supra。
那些重組產生的、生化合成的、化學合成的或化學修飾的保留了與H-NUC或其片段結合能力的，如同相應的天然多克隆或單克隆抗體的蛋白質或多肽也包括在本發明之內。用本領域所知的抗原結合試驗如抗體捕獲試驗測定與抗原或免疫原結合的能力。例子參見在此引為參考的Harlow和Lane的Supra。
在一個實施方案中，抗體或核酸同檢測試驗連接起來，用於檢測樣品中的H-NUC蛋白質和片段，所用方法為標準的免疫化學技術如由Harlow和Lane在Supra中描述的免疫組織化學，該文獻在此引作參考；或者用在「Principles andPractice of Immunoassays」，eds.C.J.Price and D.J.New-man，Stockton Press，New York，(1991)中描述的技術，該文獻在此引為參考。
在一獨立的實施方案中，給藥抗體使之與H-NUC結合併改變其在細胞內的功能。用本領域技術人員熟知的方法給藥抗體，以有效的濃度施給以使H-NUC的功能得以恢復。該抗體也可用來治療，即通過與已喪失了與成視網膜細胞瘤蛋白結合能力的H-NUC的結合以抑制細胞生長或增殖。這個抗體與H-NUC結合，引起了它重新摺疊成活性構象。換句話說，該試劑恢復了H-NUC的天然生物活性。
本發明的抗體和核酸分子用於檢測或測定從患者身上取出的細胞或樣品中的H-NUC蛋白或者選擇性地變化了的-H-NUC蛋白或者選擇性的變化了的-H-NUC基因的存在與否。這樣，乳腺癌或患乳腺癌的可能性則可被診斷出來。
綜上所述，上述的蛋白質、多肽、核酸、抗體、和其片段可用於製備治療的藥劑。
現在將結合下面的實施例對本發明做更進一步的詳述。這些實例用於說明，但並不限制本發明。試驗方法和結果用酵母雙雜交系統，已分離出25個與RB(p56-RB)的C-末端區域相互作用的克隆。其中之一是克隆C49(Durfee等，Gene Devel.，7555～569(1993)。RB蛋白質的C-末端部分具有兩個非鄰近的對於幾種DNA腫瘤病毒的癌蛋白的結合是必需的區域，和與DNA的結合活性有關的C-末端區。這裡，一種RB-相關蛋白質的特徵已被測定，其具有初級序列，並其生化性質類似於S.Pombe酵母的nuc2蛋白質和真菌中構巢麴黴的bimA的那些性質。這後兩個基因在低等真核細胞中的突變使細胞停滯在中期，指示出這些蛋白質在有絲分裂的正常過程中起著重要的作用。這兩個蛋白質含有新的以34個殘基為基元的重複胺基酸，稱之為TPR基元。這些重複的功能還不清楚，但據推斷，它們可形成親水脂的α-螺旋，原則上該螺旋使蛋白質—蛋白質相互作用。這裡報導的這些蛋白質是人類首次分離出並報導的人TPR蛋白質。cDNA文庫的篩選和序列分析為分離全長的H-NUC cDNA，用Durfee等的方法按上面描述的分離1.5kb的C-49 Bgl II片段，將其用缺口翻譯標記，並通過噬菌斑雜交來篩選人成纖維細胞cDNA文庫。將cDNA插入片段亞克隆到pBSK+載體(stratagene，SanDiego，CA.)的EcoRI位點，從而使之能進行DNA測序。按照商家的說明(US Biochemicals)，用雙脫氧-NTPs和測序酶進行測序。用DNASTAR軟體進行序列分析和同源搜索(DNAS-TRA，Inc，Madison，WI)。GST融合體的構建、蛋白質的製備和在活體外的結合為構建GST-491，用Bgl II消化質粒C-49並將1.3kb的插入片段亞克隆到pDGEX-3X(Pharmacia，Piscataway，N.J.)的BamHI位點。通過用Hind III切Y62-25-2，用Klenow補平末端，並將該823bp的片段亞克隆到用SmaI切斷的pGEX-3X上而製得GST-T。用0.1mM IPTG誘導GST融合蛋白質在大腸桿菌中表達(Smith和Johnson，Jene，6731～40(1988))。將細胞在10K離心5分鐘，將所得到沉澱物重新懸浮於Lysis 250緩衝液(25mM NaCl，5mM EDTA，50mM Tris(pH8.0)，0.1％NP40，1mM苯甲基磺醯氟(PMSF)，8μg亮抑酶肽，8μg木瓜蛋白酶抑制劑)。加入4mg溶菌酶，並使細胞置於4℃30分鐘，用超聲作用使細胞裂解。離心(10K 30分鐘)除去細胞碎片，將上清液加到谷光甘肽包被珠中。
活體外的結合試驗按下述方式進行。在室溫下將2×106個2E3細胞(Chen等，1992，infra，在此引作參考)的抽提物與含有2～3μg GST或GST融合蛋白的珠子在Lysis 150緩衝液中一起溫育30分鐘，所述Lysis 150緩衝液為50mMTris(pH7.4)，150mM NaCl，5mM EDTA，0.1％NP-40，50mM NaF，1mM PMSF，每ml 1μg亮抑抑酶肽，每ml 1μg木瓜蛋白酶抑制劑。用Lysis 150緩衝液充分洗滌複合物，並將之在上樣緩衝液中煮沸，在7.5％的SDS-PAGE上跑膠。將凝膠轉移到固定化膜上，用抗-RB單克隆抗體，11D7進行免疫印跡。在加入了鹼性—磷酸酶—接合的二級抗體後，用5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸甲苯銨和氮藍四唑(BCIP；NBT；Promega Madison，WT)可見結合的RB蛋白質。抗體的產生和蛋白質的鑑定用本領域技術人員熟知的方法生產抗-H-NUC抗體，Harlow和Lane的AntibodiesA Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory(1988)，在此引作參考。簡言之，用大約100μg的GST-491融合蛋白質免疫小鼠，並進行三次加強免疫。從免疫的小鼠中收集血清，並將其直接用於免疫沉澱試驗。用34S—蛋氨酸對每個細胞系的大約1×107個細胞進行標記2小時，並隨後將之在冰冷的Lysis 250緩衝液中溶胞產。將澄清的裂解物與各種抗體在4℃溫育1小時，然後加入蛋白A瓊脂糖珠，並將之在4℃繼續保溫30分鐘。用裂解緩衝液充分洗滌後，在SDS樣品緩衝液中煮沸瓊脂糖珠，用7.5％SDS-PAGE進行分離免疫沉澱物。為進行雙免疫沉澱，將所得的免疫複合物在200ml分離緩衝液I(20mMTrisCl，pH7.4，50mM NaCl，1％SDS和5mM 5Mm DTT)中煮沸以變性蛋白質。該變性的蛋白質用200ml分離緩衝液II(20mM TrisCl，pH7.4，50mM NaCl，1％NP40和1％脫氧膽酸鈉)稀釋並用抗體再進行免疫沉澱。細胞分級分離步驟分離膜、核、和細胞漿級分的步驟由Lee，H.W.，等Na-ture(1987)Supra中而來，該文獻在此引作參考。所有的三個級分均按上面所述通過免疫沉澱對RB蛋白質和H-NUC含量進行分析，而且將等分的每一級分與谷光甘肽珠進行溫育以證實每部分的組合物。DNA結合分析大約1×107個K562人慢性骨髓性白血病細胞(ATCC)用35S-蛋氨酸進行標記，然後將之在Lysis 250緩衝液中裂解。離心以澄清溶胞產物，並用2體積的上樣緩衝液稀釋，上樣緩衝液為10mM KH2PO4，pH6.2，1mM MgCl2，0.5％NP40，1mM DTT，10％甘油。將稀釋的抽提物過DNA—纖維素柱(天然小牛胸腺DNA，Pharmacia，Piscataway，NJ)，該柱在輕微的振蕩下於40℃溫育1小時。接下來用5床體積的上樣緩衝液洗滌柱子，然後用含有提高濃度NaCl的同樣的緩衝液洗脫。如上所述用抗-RB抗體或者用抗-H-NUC抗體對級分進行免疫沉澱分析。等分的每種級分也與谷光甘肽珠一起溫育用以檢測谷光甘肽轉移酶。H-NUC酵母表達質粒；缺失突變體將源於H-NUC cDNA的DNA片段亞克隆到pSE1170上(Durfee等，1993 Supra)克隆491是由酵母雙雜交篩選分離得到的原初克隆。把33kb的XhoI片段插入到修飾的pSE1107中得到框內融合蛋白質來構建H-NUC，RV含有N-末端XhoI-EcoRV片段。BR208，BR207、B5和B6是Sau3A部分消化的產物，來源於這些構建體的Gal4融合蛋白質含有的胺基酸分別為H-NUC為1-824位的胺基酸，491為559～824位的胺基酸，RV為1-663位的胺基酸，BR2-8為699～824位的胺基酸，BR2-7為797～824位的胺基酸，B5為559～796位的胺基酸和B6為597～796位的胺基酸。用復性引物替換H-NUC的NsiI片段可產生溫度敏感突變株。該引物如下引物1TGGTATGACCTAGGAATGATTTATTACAAGCAAGAAAAATTCAGCCTTGCAGAAATGCA引物2TTTCTGCAAGGCTGAATTTTTCTTGCTTGTAATAAATCATTCCTGGTCATACCATGCA所有的構建體均已由DNA序列分析得到了證實。酵母轉化和β-半乳糖苷酶活性的定量如以前所述用LiOAC方法進行酵母轉化(Durfee等，1993，Supra，該文獻在此引作參考)，轉化後，將細胞鋪板於缺乏色氨酸和亮氨酸的合成液滴培養基中，以選擇存在的質粒。在30℃生長2至3天後，每次轉化的單一克隆接種於適當的選擇培養基中。2.5ml培養物在適當的選擇培養基中生長至OD600 1.0～1.2。然後按Guarente，L.，Methods Enzy-mol，101181～191(1983)中描述的製備細胞，滲透細胞，該文獻在此引作參考。用氯苯基-紅-β-D吡喃半乳糖苷(CPRG；Boehringer Mannheim)在標準條件下進行定量(Durfe-e，1993，Supra)，該文獻在此引作參考。H-NUC與未磷酸化的RB的類似於SV40 T-抗原結合區的區域結合構建了一批缺失突變體。這些突變體原來是用於描述T-結合域的，按以前所述將其亞克隆到含有Gal-4 DNA一結合域的質粒，PAS1中(Durfee等，1993，Supra)，該文獻在此引作參考。這些構建體中的兩個，Gal-4活化域-C-49融合表達質粒(即原初的克隆C-49)和YIpPTG10——含有β-半乳糖苷酶的指示質粒。用於共轉化醋母菌株Y153(Dur-fee等，1993，Supra)。用Sambrook等，Molecular CloningALaboratory Manul，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Har-bor，N.Y.(1989)——該文獻在此引作參考中描述的方法通過Weston印跡測量每種RB融合蛋白質的表達水平，結果相差不到2～3倍。如上所述對所得的轉化子進行β-半乳糖苷酶活性的分析。如圖1所示，由於許多和RB蛋白質一樣的突變，包括使SV40 T-抗原結合喪失的706位胺基酸半胱氨酸突變成苯丙氨酸的點突變，減少了C-49融合蛋白質和Gal-4-RB的結合。然而有一個例外，C-49不能與Ssp突變體結合，該突變體缺少了RB蛋白質的C-末端的160個胺基酸，但T-抗原卻能結合，儘管親合力降低了。缺失了在兩結合亞域之間的接頭區部分的MI缺失(612～632位胺基酸)突變體，是唯一能同H-NUC和T-抗原結合的突變體。顯然，與RB蛋白質類似的但不相同的區域對結合T-抗原和C-49來說是必要的。
接下來，在活體外測量C-49蛋白質與p110RB結合的能力。p110RB的胺基酸序列由Lee，W·H·，等在Science 2351394～1399(1987)中公開，該文獻在此引作參考。1.3kb cD-NA(圖3)克隆在大腸桿菌中表達谷光甘肽S-轉移酶(GST)融合蛋白(Smith和Johnson，Gene 6731～40(1988)，該文獻在此引作參考)。含有等量GST-C-49蛋白質和另外兩種對照的谷光甘肽珠，單獨的GST和GST-T抗原(圖2A)與從人成視網膜細胞瘤細胞系(WERI RB27)提取的所有細胞一起溫育，所述的細胞系用RB基因重建(Chen等，CellGrowth Differ，3119～125(1992)。在標準的培養條件下，這些WERI(RB+)細胞表達不同的同型的RB蛋白質，如圖2B(泳道2)所示代表不同的磷酸化狀態。充分洗滌後，結合到珠子上的蛋白質用SDS-PAGE和Weston印跡按照Sam-brook等公開的方法分析，Sambrook等Supra在此引作參考。用抗-RB抗體，11D7對所顯的印跡進行標記(Shan等，Mol.Cell.Biol.125620～5631(1992)，該文在此引作參考)。在這些條件下，H-NUC只能和末磷酸化的p110RB以與Gst-T相似的親合力相結合，Gst-T作為陽性對照。GST單獨不能和任何的Rb蛋白質相結合(參見圖1A，2～4道)。這些結果揭示H-MUC蛋白質只能與末磷酸化的天然的全長RB蛋白質複合。全長的cDNA和其序列為更充分地分析該新蛋白質的特徵，用1.3kb的cDNA作探針來篩選人的成纖維細胞cDNA文庫。在分離出的12個克隆中，最長的cDNA克隆，3.3kb，其序列已完全測出。其開放的閱讀框編碼824個胺基酸的蛋白質(圖3)。該蛋白質與兩個已知的蛋白質，S.pombe酵母nuc2和構巢麴黴bimA在總體上有35％的同源性。已知兩個低等真核蛋白質參與有絲分裂，因為這兩個基因的溫度——敏感型突變體將細胞阻止在中期。nuc2和bimA蛋白質含有10個34-胺基酸重複，如圖4所示，一個重複在N-末端區，9個在C-末端區成族排列。在新的RB——相關蛋白質中也發現了類似的重複排列。如果僅將這三個蛋白質的9個重複區進行比較，相同的序列佔60％(圖4B)。然而，nuc2和bimA的第一和第二重複的序列間具有很低的同源性。來源於C-49的蛋白質也存在這樣差的同源性。基於序列的同源性，分離的克隆很象人與酵母nuc2和構巢麴黴bimA的同源性。因此，C-49克隆即為H-NUC。與RB蛋白質結合的C-末端重複該H-NUC蛋白質既不含已知的L-X-C-X-E基元，該基元是T-抗原和腺病毒E1A用於結合RB的，也不含已顯示出對結合RB很重要的E2F的18-胺基酸序列。這一發現提示H-NUC蛋白質用不同的基元結合RB。為幫助確定這樣基元，構建了一系列缺失突變體，每一種突變體含有H-NUCcDNA的不同的區域，如圖5所示表達Gal-4融合蛋白質。在活體內的結合分析中，用前面所述(Durfee，1993，supra)的酵母雙雜交系統來測定含結合基元的蛋白質區域。全長的蛋白質和原初的克隆(含6個重複)與RB的結合同樣地好。然而，含有第一個重複的N-末端都不能與RB結合。這些數據提示H-NUC以一種新的方式與RB結合，可能通過該蛋白質的較大的區域以特異的二級結構來實現。將640位的甘氨酸變成天冬氨酸產生了敏感型H-NUC突變體，該突變體降低了在非容許溫度下與RB的結合為了幫助證實H-NUC與RB的結合在生理學上很重要，通過對H-NUC蛋白質的定點突變產生在640位胺基酸的單一點突變(Gly→Asp)。nuc2的Gly504變成Asp的相似的變化產生了溫度敏感型表型，該突變阻止S.pombe酵母的中期發育(Hirano.T.，Y.Hiraoka和M.Yahagida，J.Cell Biol1061171～1183(1988))。既然該甘氨酸殘基在H-NUC蛋白質中是保守的，如同酵母的同源序列，產生Gly到Asp的突變將測試在非容許溫度下H-NUC蛋白質是否是結合RB的缺陷型。如圖6所示，含有Gly-640突變的H-NUC蛋白質在酵母於37℃(非容許溫度)下生長時不能與RB相互作用，但在酵母於22℃(容許溫度)下生長時，該突變蛋白卻保留了其與RB結合的能力。這些數據證明了在假定的中期阻滯的溫度敏感(ts)表型和Rb-結合特性之間存在著聯繫。H-NUC抗體的製備和H-NUC蛋白質的鑑定為在蛋白質凝膠和Weston印跡中鑑定該新的H-NUC蛋白質，製備了它的小鼠抗體。在大腸桿菌中表達的Gst-C-49(Smith和Johnson，1988，supra，和Shan等，1992，supra，每篇文獻在此均引作參考)，用谷光甘肽珠純化之，並將其用作抗原來誘導小鼠產生抗體應答。然後收穫含多克隆抗-H-NUC抗體的血清。得到抗體後，如前所述，用35S-蛋氨酸代謝標記紅白血病細胞系(K562)，用該細胞系製備細胞溶胞產物，並用多克隆抗體對之進行免疫沉澱。如圖6A所示，用免疫血清(泳道2)沉澱出具有大約95kb分子量的特異蛋白質，但用免疫前血清則未沉澱出。該複合體在凝膠中分離開。因為35S-蛋氨酸只對K562特異性地標記，因此只有95kDa的蛋白質可被見到。當用GST蛋白質進行競爭性免疫沉澱時，該95kd的蛋白質也可被檢出，這證明了多克隆抗體不僅僅只識別GST。另一方面，該原初的抗原能與內源性細胞蛋白質進行競爭，該95kd的帶變得不可檢測了(泳道3和4)。當初級免疫沉澱物變性和再免疫沉澱時，該抗體的特異性得到了進一步證實。如圖6B所示(泳道3)，95kd蛋白質是唯一能被檢出的帶，且背景是清楚的。因此，所有的免疫學證據提示95kd蛋白質即為H-NUC基因產物。H-NUC蛋白質具有DNA-結合活性用35S-蛋氨酸標記大約1×107個細胞，然後將之在Ly-sis250緩衝液(250mM NaCl，5mM EDTA，50mM Tris(pH8.0)，0.1％NP40，1mM苯甲基磺醯氟(PMSF)，8μg/ml的亮抑肽酶和8μg/ml的木瓜蛋白酶抑制劑)中裂解。離心澄清溶胞產物，並用2體積的上樣緩衝液(10mM KH2PO4，pH6.2，1mM MgCl2，0.5％NP40，1mM DTT，10％甘油)稀釋。然後，如前所述，將稀釋的提取物上到DNA-纖維素柱(天然的小牛胸腺DNA，Pharmacia，Poscatawas，NJ)，並使該混合物在輕微振蕩下於4℃保溫1小時。用5床體積的上樣緩衝液洗滌該柱，然後用含有提高NaCl濃度的同樣的緩衝液洗脫。
用抗成視網膜細胞瘤蛋白質的抗體11D7，圖7A)、H-NUC(圖7B)、或GST珠(圖7C)對每種洗脫液的級分進行免疫-沉澱分析。等分的每種級分也用來與谷光甘肽一起溫育，用以檢測谷光甘肽轉移酶。RB蛋白質具有DNA結合活性，把其用作陽性對照。H-NUC蛋白質具有類似的DNA-結合活性，但單獨的谷光甘肽轉移酶卻沒有這樣的活性。同源序列分析表明H-NUC的DNA-結合區位於TRP區域之外。H-NUC定位於染色體17q21～22圖譜如圖9所示3H-標記的3.3kb-H-NUC cDNA探針對人染色體的原位雜交表明在17號染色體的q21-22區顯示出特異性的標記。從統計的150個細胞的320中，發現有42例13.1％在17q21-22。背景上其它位點未見標記。因為所用的探針的一部分含有其假基因的同源序列，在每個受檢測的細胞中均檢出了近端著絲粒染色體的多重雜交，而且它們被排除在分析之外。用體細胞雜交法也獲得了相似的做圖結果，即H-NUC被做圖定位於第17號染色體。H-NUC的定位很有趣，因為家族性乳腺癌基因也已被做圖定位於相同的區域。H-NUC的腫瘤抑制活性在活體外的細胞培養條件下和在裸鼠動物模型中對H-NUC的腫瘤抑制活性進行了估測。用於估測H-NUC腫瘤抑制活性的細胞系是MDA-MB-231和T-47D，MDA-MB-231含有H-NUC的一個功能性等位基因，T-47D是H-NUC座位的純合突變體。
簡言之，用腺病毒表達載體表達H-NUC後對H-NUC對上面兩種細胞系增殖的作用效果進行估測。ACN是缺乏cDNA插入片段的對照腺病毒載體，而AC-H-NUC是在人CMV啟動子控制下的表達H-NUC的腺病毒載體。含H-NUC的腺病毒載體為構建腺病毒表達載體，用PCR從Quick Clone雙鏈胎盤eDNA(Clontech)對含有H-NUC全長cDNA的2520個鹼基對的片段進行擴增。為擴增H-NUC所用的引物給該片段的5′-末端增加了Kpn I限制酶位點，給3′-末端增加了Xho I位點，這樣使該片段定向克隆到pBluescript II KS+的多克隆位點(5端引物寡核苷酸為5′CGCGGTACCATGACGGTGCTGCAGGAA3′；3端引物的寡物苷酸為5′ATCGGCTCGAGCAGAAGTTAAAATTCATC3′)。PCR循環如下1圈在94℃1分鐘；30圈在94℃1分鐘，53℃11/2分鐘，72℃2分鐘；和1圈在72℃7分鐘。用TnT Coupled Reticulo-cyte Lysate System(Promega)篩選能產生95KD蛋白質的克隆。Bluescript載體的T3啟動子能使H-NUC編碼序列在免網狀細胞中轉錄和翻譯。每一個網狀細胞反應中加入1μg的微—溶胞產物DNA，並將其在30℃溫育1小時。10μl的反應物與上樣緩衝液混合，在165V電壓下，在10％的聚丙烯醯胺凝膠(Nevex)上跑膠 小時。乾燥凝膠，並將之與膠片過夜曝光。對產生全長蛋白質的4個克隆進行了測序。用KpnI和HindII消化從載體上收穫H-NUC插入片段，並將之亞克隆到pAdCMVb-載體的KpnI-BgIII位點(載體中BgIII的填入產生了平端)。所有的4個克隆均含有一些突變。將兩個克隆的片段連接起來產生了含有正確的野生型序列的克隆。
為構建重組腺病毒，用NruI將上面的質粒線化，並與用ClaI消化的d1309突變體的大片段，用CaPO4轉染試劑盒(Stratagene)共轉染(Jones和Shenk，Cell，17683～689(1979)，該文獻在此引作參考)。分離病毒斑，通過限制酶消化分析和用針對於H-NUC cDNA序列的引物的PCR對重組子進行鑑定。通過限制性稀釋進一步純化重組病毒，用標準方法純化病毒粒子並測定效價(Graham和Van der Erb，Vi-rology，52456～457(1973)；Graham和Prevec，Manipulationof adenovirus vectors.InMethods in Molecular Biology Vol T；GeneTrans+er and Protocols，Murray E.J.(ed.)The HumanPress Inc.，Clifton N.J.，T109～128(1991))，這兩篇文獻在此均引作參考。
為保證上面的H-NUC載體表達適當大小的蛋白質，在提高病毒/細胞噬斑形成單位的感染複數(MOI)的條件下，用對照或者用含H-NUC的重組腺病毒感染T-47D細胞。用PBS洗滌細胞一次，並在裂解緩衝液(50mM Tris-HCl.pH7.5，250mM NaCl，0.1％NP40，50mM NaF，5mM ED-TA，10μg/μl的抑蛋白酶肽，10mg/ml的亮抑酶肽，和1mMPMSF)中收穫之。通過10％SDS-PAGE分離細胞蛋白質，並將之轉移到硝酸纖維素膜上。將膜與抗-H-NUC抗體溫育，然後將之與連接有辣根過氧化物酶的羊抗-鼠IgG一起溫育，通過化學發光在Kodak XAR-5膠片上可見H-NUC的精確表達(ECL kit，Amersham)。在活體外將乳腺癌細胞系，MDA-MB-231和T-47D以每100mm板1×106個細胞接種於Kaighn′s F12/DME培養基中(Irvine Scientific)，對T-47D細胞，培養基中補加10％FBS和0.2IU的胰島素(Sigma)。該板於37℃7％CO2下保溫過夜。第二天，給細胞再餵以10ml的生長培養基，並用ACN對照病毒溶胞產物(MOI 10)或者用AC-H-NUC病毒溶胞產物(MOI 10)感染細胞，在37℃保溫。3天後，除去培養基，用1∶5的乙酸—甲醇溶液固定細胞。用20％甲醇-0.5％結晶紫溶液對細胞染色30分鐘，並用水漂洗以除去多餘的染料。
用AC-H-NUC對細胞的感染，結果由於H-NUC蛋白質的表達而產生了這些細胞的生長抑制(圖11)。當與ACN對照細胞相比時，可觀察到用結晶紫染色的AC-H-NUC感染的細胞顯示出細胞數目的減少(大約50％)。另外，T-47D細胞發生了形態變化。該細胞看起來變得稠密，喪失了其正常生長的特徵。當T-47D細胞用對照ACN病毒侵染時，未發現明顯的變化。作為對照，雜合細胞，MDA-MB-231，沒有出現在活體外被ACN或AC-H-NUC的感染。
胸苷的摻入也用來估測H-NUC對細胞增殖的作用效果。簡言之，將大約3×103MDA-MB-231和T-47D細胞鋪板於96-孔板(Costar)的每一孔中，並將之保溫過夜(37℃，7％CO2)。用DMEF12/15％FBS/1％穀氨酸對ACN或AC-H-NUC進行系列稀釋，以感染複數為10和100(MOI)的每種腺病毒對細胞進行感染(每個MOI做4孔的重複)。感染後24小時時更換一半體積的細胞培養基，並每48小時換一次，直到收穫細胞。收穫前18小時，向每個孔中加入1μCi的3H-胸苷。感染後5天，將細胞收穫於玻璃-纖維濾紙上，用液閃法檢測摻入到細胞核酸內的3H胸苷(TopCount，Packard Instruments)。每種MOI的細胞增殖(cpm/孔)以佔未處理細胞增殖平均數的百分數來表達。
所得的結果顯示出用ACN或AC-H-NUC處理後，MDA-MB-231細胞(對H-NUC而言是雜合的)的增殖是相似的(參看圖12)。作為對照，在T-47D細胞中觀察到了對AC-H-NUC的特異應答，T-47D細胞是H-NUC缺失的，所述應答在高MOI時增強。這些數據表明腺病毒—介導的H-NUC基因的轉移對H-NUC變化了的細胞產生抗—增殖的作用。體外基因治療為估測H-NUC的表達對致瘤性的影響，上面的腫瘤細胞系在裸鼠模型內試驗了其產生腫瘤的能力。將大約2×107T-47D細胞鋪板於T225瓶中，並用含有MOI為3或30的ACN或AC-H-NUC的蔗糖緩衝液處理細胞。過夜感染後，收穫細胞，並將大約107細胞經皮下注射到BALB/c裸鼠的左脅和右脅(4隻/組)，該裸鼠在此之前經皮下接受過17β-雌二醇。一側脅用ACN-處理的細胞注射，而對照側脅則用AC-H-NUC細胞注射，每隻小鼠做為自身的對照。雙側脅接受未經處理的細胞注射的動物做為腫瘤生長的另外的對照。每周測量二次腫瘤的大小(長、寬、高)和體重。假定腫瘤的半徑等於測得的腫瘤大小平均數的一半，以球體幾何來估算每隻動物腫瘤的體積。
該試驗的結果示於圖13，揭示出在表達H-NUC的細胞中腫瘤生長明顯減少。簡言之，在細胞接種21天後，測量所有動物雙側的腫瘤。對所有4隻小鼠，源於由AC-H-NUC(MOI＝30)處理的細胞腫瘤小於對照側源於用ACN(MOI＝30)處理的細胞的腫瘤。在21天的期間內，AC-H-NUC(MOI＝30)處理的細胞引起的腫瘤的平均大小一直比由ACN(MOI＝30)處理的細胞引起的腫瘤的大小要小。(參見圖3)。這些數據進一步證實了此處公開的H-NUC的腫瘤抑制活性。H-NUC在活體內的腫瘤抑制將人乳腺癌細胞系T-47D細胞經皮下注射到雌性BALB/C無胸腺裸鼠中。使腫瘤發育32天。此時，在腫瘤周圍靠近腫瘤的地方注射一次ACN(對照)或AC-H-NUC(含H-NUC基因)的腺病毒載體。然後在注射腺病毒2天或者7天後，切下腫瘤，並從每個腫瘤中分離多聚腺苷+RNA。然後用使用了H-NUC特異引物的反轉錄酶-PCR探測經處理的腫瘤中的H-NUC RNA。使用肌動蛋白引物的擴增做為RT-PCR反應的對照，而含有重組體-(H-NUC)序列的質粒做為該重組體-(H-NUC)特異帶的陽性對照。
在一獨立的試驗中，T-47D細胞經皮下注射到小鼠右脅的皮下，並使腫瘤生長2周。小鼠接受每周2次共計8劑的緩衝液或重組病毒的靠近腫瘤的注射。在整個處理過程中對監測接受ACN和緩衝液的對照動物和那些接受AC-H-NUC的動物中腫瘤的生長進行。體重和存活時間也在被監測之列。乳腺癌細胞系T-47D細胞中外源H-NUC的表達來自乳腺癌細胞系T-47D的乳腺癌細胞，因是H-NUC基因的純合突變而不含有內源的H-NUC，因此為H-NUC的功能性研究，提供了乾淨的背景。用可比較效價的AC-H-NUC或對照ACN載體感染T-47D細胞。多數的克隆各自繁殖成塊狀培養物。
用35S對受侵染的細胞進行代謝標記，並將之用來製備細胞溶胞產物以估計產生的蛋白質的量。根據在裸鼠中測得的形態學、生長速率(例如倍增的時間)、飽和密度、軟瓊脂集落的形成和致腫瘤性，把AC-H-NUC侵染的培養物和對照細胞進行比較。
雖然本發明結合參考文獻對目前優選的實施方案進行了描述，但應理解為在不背離本發明精神的前提下可對本發明進行各種修飾。相應地，本發明不受下列權利要求的限制。
權利要求
1.分離和純化的編碼Rb結合蛋白質的DNA序列，所述的蛋白質在C-末端含有與9個34個胺基酸的肽重複有至少60％同源性的亞序列，條件是所述的DNA序列既不編碼S.pombe酵母蛋白nuc2、構巢麴黴bimA蛋白質，也不編碼啤酒酵母(S.cerevisiae)CDC27蛋白質。
2.權利要求1所述的分離和純化的編碼Rb結合蛋白質的DNA序列，所述的DNA序列與Sequence I.D.No.1的465到770位胺基酸有60％的同源性。
3.權利要求1所述的分離和純化的DNA序列，該序列編碼Sequence I.D.No.1的465到770位的胺基酸。
4.根據權利要求1的分離的和純化的DNA序列，基本上按照Sequence I.D.No.1中所列的順序編碼H-NUC。
5.含有權利要求1、2、3或4的分離和純化的DNA的重組載體。
6.權利要求5的重組載體，其中所述載體是粘粒、質粒、或由病毒衍生而來。
7.含有權利要求1、2、3或4所述的DNA分子的表達載體，該載體能將所述的DNA分子插入哺乳動物寄主細胞，並在其中表達蛋白質。
8.權利要求7的表達載體，其中所述的表達載體選自由質粒和病毒載體所組成的組。
9.權利要求8的表達載體，其中所述的病毒載體選自由逆病毒載體和腺病毒載體所組成的組。
10.權利要求9的表達載體，其中所述的表達載體是AC-H-NUC。
11.用於生產具有H-NUC蛋白質生物活性的多肽或蛋白質或其生物活性衍生物的寄主—載體系統，該系統包括在適宜的寄主細胞中的權利要求7、8、9或10的載體。
12.權利要求11的寄主—載體系統，其中寄主細胞是原核細胞。
13.權利要求11的寄主—載體系統，其中寄主細胞是真核細胞。
14.含有權利要求7的載體和藥物學可接受載體的藥物組合物。
15.含有權利要求8的載體和藥物學可接受載體的藥物組合物。
16.含有AC-H-NUC載體和藥物學可接受載體的藥物組合物。
17.由互補於權利要求1的DNA序列的至少大約27個核苷酸組成的DNA探針。
18.權利要求17的DNA探針，其中的核苷酸互補於Se-quence I.D.No.1的DNA序列。
19.分離和純化的結合Rb蛋白的哺乳動物蛋白質，所述的蛋白質在C-末端含有具有至少6個34個胺基酸的肽重複的胺基酸序列，條件是所述的蛋白質不是S.pombe酵母的nmc2蛋白質、構巢麴黴bimA蛋白質，也不是啤酒酵母CDC27蛋白質。
20.權利要求19的分離和純化的哺乳動物蛋白質，在其C-末端含有具有9個34個胺基酸的肽重複的胺基酸序列。
21.權利要求20的分離和純化的哺乳動物蛋白質，該蛋白質是具有Sequence I.D.No.2胺基酸順序的H-NUC。
22.生產權利要求19的蛋白質的方法，包括以下步驟a.將含有編碼權利要求19的蛋白質基因的相容性表達載體插入寄主細胞；b.使所述的寄主細胞表達所述的蛋白質。
23.按照權利要求22的方法，其中所述的寄主細胞選自由原核寄主細胞和真核細胞組成的組。
24.根據權利要求23的方法，其中所述的寄主細胞是哺乳動物寄主細胞的真核寄主細胞，且所述的表達載體與所述的哺乳動物寄主細胞是相容的。
25.抑制沒有內源性H-NUC蛋白質的癌細胞成瘤表型的方法，包括對這樣的癌細胞給藥有效量的權利要求1、2、3或4的DNA。
26.權利要求25的方法，其中H-NUC基因的施給是通過重組載體。
27.抑制沒有內源性H-NUC蛋白質的癌細胞成瘤表型的方法，包括對這樣的細胞給藥權利要求19至21的蛋白質。
28.與Rb-結合蛋白質結合的抗體，所述的蛋白質在其C-末端含有具有至少6個34個胺基酸的肽重複的亞序列，條件是所述的蛋白質既不是S.pombe酵母蛋白質nuc2、構巢麴黴bimA蛋白質、也不是啤酒酵母CDC27蛋白質。
29.權利要求28的抗體，所述抗體與具有Sequence I.D.No.2胺基酸序列的H-NUC蛋白質結合。
30.產生單克隆抗體的雜交瘤，所述的單克隆抗體與具有Sequence I.D.No.2胺基酸序列的H-NUC蛋白質結合。
31.檢測腫瘤細胞中H-NUC不存在的方法，包括如下步驟a.從腫瘤中製備組織切片；b.將權利要求26或27的抗體與所述的組織切片接觸；c.檢測所述的抗體與所述的組織切片的結合是否存在。
全文摘要
本發明涉及分離和純化的編碼Rb結合蛋白質的DNA序列、含有所述DNA序列的載體、基於所述DNA的DNA探針和使用所述的DNA的載體進行治療的方法。本發明也涉及由所述DNA編碼的蛋白質、使用所述蛋白質進行治療的方法、和表達所述蛋白質的方法。最後，本發明還涉及針對所述蛋白質的抗體、產生所述單克隆抗體的雜交瘤、和使用所述抗體診斷方法。
文檔編號C07H21/04GK1138295SQ94194569
公開日1996年12月18日 申請日期1994年12月20日 優先權日1993年12月20日
發明者李文華, 陳芳蘭 申請人:德克薩斯系統大學董事會