一種唾液乙醇含量檢測試劑的製作方法
2023-12-09 04:36:06 1
專利名稱：：一種唾液乙醇含量檢測試劑的製作方法
技術領域：
：本發明涉及臨床檢測
技術領域：
，具體涉及一種唾液乙醇含量檢測試劑。
背景技術：
：近年來，酒後引起的刑事案件和酒後駕車引起的交通事故案件不斷上升。目前，許多國家都制定了血液中乙醇濃度與交通事故責任認定的關係，建立了多種能夠檢測血液中乙醇含量的方法。如GM/MS等儀器檢測乙醇成分，雖然這些方法可以準確定量，但是存在著購買儀器價格昂貴,檢測成本高，需專門培訓,無法在案發現場快速檢測的缺點。呼氣式乙醇測定儀可以在現場使用，但是價格也十分昂貴，而且不衛生，容易發生交叉感染疾病。大量的研究表明，人體在攝入酒精後唾液和血液中的酒精濃度幾乎相等，血液/唾液的比值大約是1.07。在酶學反應的基礎上，唾液乙醇檢測試劑條可以用來檢測唾液中的酒精含量，間接可以反映血液中的酒精的濃度。其方法適合在現場使用。目前，根據唾液和血液中乙醇含量一致性的實驗基礎，唾液中乙醇含量檢測試劑已經開發成功並投入使用，但是，根據文獻查閱的結果和市場調查中發現，大部分唾液中乙醇含量檢測試劑都是利用乙醇氧化酶催化酒精釋放過氧化氫，再通過辣根過氧化物酶催化底物TMB(N，N，N'，N'-四甲基聯苯胺)顯色反應。這些技術和製作工藝在很多專利和文獻中都有描述，例如中國專利申請03128880.4公開了一種應用玻化技術生產定量檢測唾液乙醇傳感器用雙酶試條，其配方為緩衝系統用量0.50.8M，pH值6.58.0;表面活性劑是丁二酸二辛酯磺酸鈉(AOT)，用量0.1%0.3%(>");乙醇氧化酶(A0D)活化劑是疊氮化鈉(NaN3)，用量0.05%0.10%(w/v);還原劑用量0.01%0.10%(w/v);穩定劑是VI型玻化載體，由山梨醇、明膠、右旋糖苷和植物種子粗提液組成，用量5X15X(w/v);顯色劑用量1.0%2,5%(w/v);顯色劑溶劑是二甲苯原液；助染劑是褚紅染料，用量0.5%1.5%~/v);乙醇氧化酶用量3045u/ml;過氧化物酶採用辣根過氧化物酶(HRP)，用量450650u/ml。中國專利申請200510013235.5公開了一種製備檢測唾液酒精含量試紙的方法，選取純棉漿濾紙，做試紙的底物載體，應用固相或半固相化學技術，將四甲基聯苯胺、磷酸鹽緩衝液、辣根過氧化物酶及乙醇氧化酶和牛血清白蛋白依次加入各試劑到試紙上，分步真空乾燥。中國專利200520025467.8公開了一種檢測唾液酒精含量的試紙，包括具有試劑物的試紙本體和承載該試紙本體的支持體，其中，所述的試紙本體由內之外依次形成如下試紙層真空乾燥固化的3，3',5，5'-四甲基聯苯胺試紙層、真空乾燥固化的磷酸鹽緩衝液試紙層、真空乾燥固化的辣根過氧化物酶試紙層、真空乾燥固化的乙醇氧化酶和牛血清白蛋白試紙層。中國專利申請200610029610.X公開了一種檢測唾液中乙醇含量的試劑條和試劑盒，通過試劑條中乙醇氧化酶、過氧化物酶將N，N，N'，N，-四甲基聯苯胺氧化後顏色改變的深淺，半定量地檢測唾液中乙醇的含量。該方法簡便、易攜帶，靈敏度高、反應速度快、穩定性高，尤其適合現場檢測。這些專利都是集中在如何用幹化學試紙法準確的測定樣品中乙醇和含量，以及如何將乙醇氧化酶進行固化，但是卻忽視了幾個關鍵的技術問題1)乙醇氧化酶的專一性較差，對大多數醇類如甲醇、異丙醇等非乙醇物質也具有很強的氧化作用，在檢測過程中這些物質具有很大的幹擾作用。2)乙醇氧化酶極不穩定，其活性難以長期保持的特點，導致了目前該產品的穩定性差異大，3)反應體系中的過氧化氫和TMB的顯色反應，容易受到一些還原性物質如抗壞血酸(維生素C)的幹擾，4)目前的乙醇檢測試劑條的顯色底物是TMB(N，N，N'，N'-四甲基聯苯胺)，是辣根過氧化物酶的最常用底物，但是它很難溶於水，在目前製備乙醇檢測試劑過程中，底物TMB是用二甲苯來溶解，然後通過揮發作用除去有機溶劑，如果揮發不徹底，無疑是對健康有害的。另外，底物TMB極不穩定，需避光保存，容易被其他氧化劑氧化而變色，導致唾液乙醇檢測試劑的長時間保存後出現藍色本底，對檢測結果產生幹擾。在製備檢測試紙的過程中，先將乙醇氧化酶乾燥於試紙上，在加上TMB二甲苯溶液進行二次乾燥過程。二次乾燥對於溫度敏感的乙醇氧化酶的活性影響甚大，同時，有機溶劑二甲苯對於乙醇氧化酶和辣根過氧化物酶的活性也有不同程度的抑制作用，導致產品的活性參差不齊。
發明內容針對上述現有唾液乙醇含量檢測試劑存在的不足，本發明公開了一種唾液乙醇含量檢測試劑，其特徵在於在5.0x5.0mn^固相或半固相載體上負載包含了乙醇脫氫酶1.25—0.5U;輔酶NAD0.05—0.2mg;四氮唑鹽0.025—0.2mg。本發明原理是利用酶學反應基礎之上的顯色反應，乙醇脫氫酶(alcoholdehydrogenase,ADH)是一種含鋅酶類。其分子由兩個亞基組成，其中一個位於酶的活性中心，另一個起穩定四級結構的作用。在輔酶I存在的條件下，它催化乙醇發生脫氫反應，乙醇脫氫酶將乙醇催化成乙醛同時，NAD在轉化NADH，與四氮唑鹽發生反應而顯色，具體的反應原理如下ADHCH3CH2OH(乙醇)+NAD+-CH3CHO(乙醛)+NADH+H+NADH+四氮唑鹽(無色)-四氮唑鹽(雙甲臢,藍紫色)+NAD+在以上反應中，四氮唑鹽的藍色深淺和顯色速度的快慢與樣品中乙醇的含量成線形關係，並最終作為一種半定量的檢測的指標。在一些實施方式裡，所述四氮唑鹽可為氯化-2，3,5-三苯基四氮唑或氯化硝基四氮唑藍(NBT)。在一些實施方式裡，所述固相或半固相載體為濾紙。在一些實施方式裡，所述5.0x5.0mm2固相或半固相載體上還包含抗壞血酸氧化物酶0.05—0.3U。大部分水果類飲料和口香糖中都含有某些還原劑如維生素C對唾液乙醇檢測試劑條有很大的影響，主要原因是這些還原劑阻止了顯色底物的氧化，給檢測帶來幹擾。在一些實施方式裡，所述固相或半固相載體還包含0.1M磷酸緩衝鹽，pH6.0-8.5，其中pH優選7.5。磷酸緩衝鹽可使檢測反應更為靈敏。在一些實施方式裡，所述5.0x5.0mm2固相或半固相載體上還包含穩定劑0.1—0.3mg，所述穩定劑可為明膠、瓊脂、矽膠或褐藻膠中之一或它們的任何組合。所述穩定劑可使乙醇脫氫酶在常溫下可以長期保持活性。本發明唾液乙醇含量檢測試劑具有高度的特異性、靈敏度高、反應快速，不含毒性物質，可口含檢測，安全可靠；且無需藉助複雜的傳感器主機出示結果，可直接與比色卡對照讀數；同時具有更好的熱穩定性，在室溫下可以保存2年。本發明試劑測定結果重複性好、便於攜帶、製備工藝簡單，成本低廉，易於產業推廣，便於現場檢測，可用於酒後駕車的檢測和作為法醫屍檢的簡易工具。具體實施例方式以下結合具體實施例，進一步闡明本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，或按照製造廠商所建議的條件。比例和百分比基於重量，除非特別說明。實施例中所涉及的酶和試劑均為市售。實施例1.唾液乙醇含量檢測試劑的製備1)配製乙醇脫氫酶和抗壞血酸氧化物酶溶液取褐藻膠10mg，明膠200mg，乙醇脫氫酶500單位，輔酶NAD3.0克，抗壞血酸氧化物酶1000單位，溶於20mlpH7.5的O.IM磷酸鹽。2)配製四氮唑藍溶液2.0克四氮唑鹽溶於20ml的雙蒸水中。3)酶和底物的固相化製備反應墊將0.5CM寬的3M濾紙浸入以上的酶/四氮唑鹽(1:1)混合液中,取出濾紙在500C熱風、避光下乾燥10分鐘。4)製備試劑條把千燥後的反應墊貼在單面含膠的白色聚酯板距前端1.0CM處，再在聚酯板前端粘貼長約2.5CM的吸水紙，用切紙機切成寬0.5cm的長條，即製成檢測試劑條。實施例2.唾液乙醇含量檢測試劑的用正常人的唾液配製乙醇溶液，濃度分別為O，20，80和300mg/dL，同時配製相同濃度的甲醇和異丙醇溶液。另外，配製含有10mg/ml的維生素C的不同濃度的乙醇溶液。將實施例1製備的試劑條的吸水端插入樣品中IO秒中後取出，放置5分鐘觀察反應墊的顏色變化。結果tableseeoriginaldocumentpage7本發明所述檢測試劑條最終是通過四氮唑鹽的顯色來判斷乙醇的含量，此反應體系中底物的顏色變化與乙醇濃度呈比例的梯度變化，反應體系呈藍色。低濃度則顯示為藍色，而高濃度乙醇顯示為深藍色。本試劑條結果通過肉眼可以明顯判別20-300mg/dL不同濃度的乙醇含量，可以進行半定量測試。同時，相同濃度的甲醇、異丙醇均不會產生顏色變化，說明本試劑條對甲醇、異丙醇不發生交叉反應。另外，含有10mg/ml維生素C的乙醇樣品測試顯示，其顏色的變化與不含維生素C的樣品沒有明顯的區別。說明維生素C對本試劑條的檢測結果沒有幹擾。本發明的範圍不受所述具體實施方案的限制，所述實施方案只欲作為闡明本發明各個方面的單個例子，本發明範圍內還包括功能等同的方法和組分。實際上，除了本文所述的內容外，本領域技術人員參照上文的描述和附圖可以容易地掌握對本發明的多種改進。所述改進也落入所附權利要求書的範圍之內。上文提及的每篇參考文獻皆全文列入本文作為參考。權利要求1.一種唾液乙醇含量檢測試劑，其特徵在於5.0x5.0mm2固相或半固相載體上負載包含了乙醇脫氫酶1.25—0.5U；輔酶NAD0.05—0.2mg；四氮唑鹽0.025—0.2mg。2.如權利要求l所述的唾液乙醇含量檢測試劑，其特徵在於所述固相或半固相載體為濾紙。3.如權利要求1所述的唾液乙醇含量檢測試劑，其特徵在於所述四氮唑鹽可為氯化-2，3，5-三苯基四氮唑或氯化硝基四氮唑藍。4.如權利要求1所述的唾液乙醇含量檢測試劑，其特徵在於所述四氮唑鹽為氯化硝基四氮唑藍。5.如權利要求l所述的唾液乙醇含量檢測試劑，其特徵在於所述5.0x5.0mm2固相或半固相載體上還包含抗壞血酸氧化物酶0.05—0.3U。6.如權利要求1所述的唾液乙醇含量檢測試劑，其特徵在於所述固相或半固相載體還包含O.1M磷酸緩衝鹽，pH6.0-8.5。7.如權利要求6所述的唾液乙醇含量檢測試劑，其特徵在於所述pH值為7.5。8.如權利要求1所述的唾液乙醇含量檢測試劑，其特徵在於所述5.0X5.0mn^固相或半固相載體上還包含穩定劑0.1—0.3mg，所述穩定劑可為明膠、瓊脂、矽膠或褐藻膠中之一或它們的任何組合。全文摘要本發明涉及臨床檢測
技術領域：
，具體涉及一種唾液乙醇含量檢測試劑。本發明公開了一種唾液乙醇含量檢測試劑，其特徵在於在5.0×5.0mm2固相或半固相載體上負載包含了乙醇脫氫酶1.25-0.5U；輔酶NAD0.05-0.2mg；四氮唑鹽0.025-0.2mg。本發明唾液乙醇含量檢測試劑具有高度的特異性、靈敏度高、反應快速，不含毒性物質，可口含檢測，安全可靠；且無需藉助複雜的傳感器主機出示結果，可直接與比色卡對照讀數；同時具有更好的熱穩定性，在室溫下可以保存2年。本發明試劑測定結果重複性好、便於攜帶、製備工藝簡單，成本低廉，易於產業推廣，便於現場檢測，可用於酒後駕車的檢測和作為法醫屍檢的簡易工具。文檔編號G01N21/77GK101419172SQ20081004380公開日2009年4月29日申請日期2008年9月25日優先權日2008年9月25日發明者原劉,周華山,凱朱,胡小龍申請人:上海錦隆生物科技有限公司