脆弱擬桿菌在預防和/或治療腦膜炎中的應用的製作方法

2023-12-09 05:28:42

本發明涉及微生物、藥品、保健品、食品及日化產品
技術領域：
，特別是涉及脆弱擬桿菌在預防和/或治療腦膜炎中的應用。
背景技術：
：細菌性腦膜炎是中樞神經系統嚴重的感染性疾病，常見於成人，但以新生兒患者最多。因為新生兒免疫功能低下，白細胞趨化、黏附和移動功能不完善，補體活性以及體內特異性和非特異性抗體的濃度都比較低，所以是細菌性腦膜炎的高危人群。20世紀30年代，磺胺藥的問世將球菌性腦膜炎的病死率降至5％-15％。到1944年，採用磺胺和靜脈注射兔抗血清治療了87例b型流感嗜血桿菌性腦膜炎患兒，將病死率降至22％。20世紀60年代初期，氯黴素(加磺胺嘧啶)將流感嗜血桿菌性腦膜炎的病死率進一步降至5％-10％，使用抗血清治療從此成為了歷史。但磺胺對肺炎球菌性腦膜炎的療效較差，病死率在45％-95％之間波動。青黴素治療肺炎球菌性腦膜炎始於20世紀40年代中期，全身和鞘內應用青黴素的病死率為49％。1949年道林(Dowling)採用大劑量青黴素(每2小時肌肉注射100萬單位)治療了21例肺炎球菌性腦膜炎病人，將病死率降至38％，開創了青黴素未經鞘內給藥而達到「腦脊膜劑量」的現代療法新時代。在過去15年內，細菌性腦膜炎的治療方法為靜脈注射青黴素(或氨苄青黴素)和/或第3代頭孢菌素。此時，腦膜炎球菌性腦膜炎的病死率徘徊於10％左右，流感嗜血桿菌性腦膜炎的病死率已降至5％以下，肺炎球菌性腦膜炎的病死率仍保持在20％左右。貝克(Beek)等通過大量荷蘭病例證實了這一結果：腦膜炎球菌性腦膜炎的病死率為7％，肺炎球菌性腦膜炎的病死率為30％。當腦脊液(CSF)內的細菌成分可引起炎性細胞因子釋放的現象被揭示後，人們開始開展地塞米松輔助治療的研究。在20世紀90年代初期進行的4項研 究證明，地塞米松並不能改變流感嗜血桿菌性腦膜炎患兒的病死率，但可降低神經系統後遺症的發生率，主要是感覺神經性耳聾。2002年，荷蘭科學家證明，地塞米松輔助治療可使成年病人的後遺症發生率從25％降至15％，其中以肺炎球菌性腦膜炎的預後最好。近30年來，儘管在各種新型有效抗生素不斷出現以及現代醫療技術飛速發展的背景下，細菌性腦膜炎急性期的病死率有所下降，但神經系統後遺症的發生率仍居高不下。在抗生素時代，細菌性腦膜炎病原菌對抗生素耐藥性的問題將長期存在。例如，20世紀60年代出現了腦膜炎奈瑟菌對磺胺的耐藥，20世紀70年代出現了流感嗜血桿菌對氨苄青黴素的耐藥；20世紀90年代從美國腦膜炎病人分離出的肺炎鏈球菌菌株對青黴素耐藥(中度耐藥佔21％，高度耐藥佔14％)，因此不得不聯合應用第3代頭孢菌素和萬古黴素進行治療。但是抗生素在殺死病原菌的同時，會造成機體菌群失調、抗性的出現及免疫功能的下降。而菌群失調會導致便秘、急慢性腹瀉、腸胃炎、腸功能紊亂，以及外來菌感染等疾病。長期下去，還可導致其他疾病並促進衰老，甚至引起癌症。阪崎克羅諾桿菌(EnterobacterSakazakii)是乳製品中近年新發現的一種致病菌，阪崎克羅諾桿菌能引起嚴重的新生兒腦膜炎、小腸結腸炎和菌血症，死亡率高達40％-80％。克羅諾桿菌傳播入血需首先穿越腸屏障，進而引起腸菌血症，而腸上皮細胞是該屏障重要組成部分，是克羅諾桿菌侵入機體的門戶。克羅諾桿菌還能穿越血腦屏障到達腦部引起腦膜炎，如果通過抑制克羅諾桿菌進入機體的腸屏障，則可以阻止其進入血腦屏障，並進而防止其引發腦膜炎。阪崎克羅諾桿菌跨越人體血腦屏障最終引發腦膜炎有幾個關鍵性的環節：高濃度的菌血症、細菌黏附、侵襲人腦微血管內皮細胞(HBMEC)、誘導HBMEC的細胞骨架重排及相關信號通路的激活，最終成功穿越HBMEC。HBMEC是人體血腦屏障的主要組成部分，黏附於細胞表面是細菌進入HBMEC的第一步，然後通過「拉鏈」(Zipper)機制進入細胞，並以空泡的形式穿越HBMEC。益生菌是一類對宿主有益的活性微生物，是定植於人體腸道、生殖系統內，能產生確切健康功效從而改善宿主微生態平衡、發揮有益作用的活性有益微生 物的總稱，其具有緩解乳糖不耐症、調整腸道微生態、增強自身免疫力等多種功效，目前越來越多的研究人員聚焦於益生菌，逐漸意識到它們的巨大治療功效。益生菌在攝入人和動物體內後，它們能夠在腸黏膜上定居，在腸道內建群並且防止有害微生物在其上粘附，能通過保持腸內自然微生物區系，促進生物個體形成健康的可生長的微生物製劑，幫助維持人和動物的健康。脆弱擬桿菌是一種革蘭氏染色陰性、杆狀、兩端鈍圓而濃染，有莢膜、無芽胞、無動力的專性厭氧細菌，其分為產腸毒素型和非產腸毒素型。脆弱擬桿菌作為人及動物腸道正常菌群的一部分，主要存於結腸中，此外，呼吸道胃腸道及泌尿生殖道也可定植生長。目前，研究較多的是脆弱擬桿菌作為一種條件致病菌，當宿主黏膜受損時，可侵犯黏膜下層，引起感染，也可經血液流動，引起身體其器官如腸道、腹腔、肝、肺、腦組織化膿性感染並伴發膿腫和引起急慢性腹瀉等症狀；此外，脆弱擬桿菌對結腸、直腸癌的發生也有促進作用。本領域已經對脆弱擬桿菌進行了大量研究。例如，從發育良好的嬰兒或低齡動物腸道中分離出一種擬桿菌菌株BF839，將其製成活菌製劑後能夠增加兒童生長發育，對防治急慢性腸炎、菌群失調、上呼吸道感染和神經官能症等具有較好療效(參見申請號為「90102847.9」，名稱為「一株有益菌株及其應用」的中國發明專利申請；張季階，等.脆弱擬桿菌(BF839)菌液的臨床應用研究.中國生物製品學雜誌，1995年，第8卷，第2期，第63-65頁))。再如，申請號為「201310095126.7」，名稱為「具有益生菌特性的脆弱擬桿菌」；申請號為「201310085744.3」，名稱為「脆弱擬桿菌在製備治療急性放射性腸炎組合物中的應用」；申請號為「201310085716.1」，名稱為「脆弱擬桿菌在製備治療炎症性腸病組合物中的應用」的中國發明專利申請所公開的脆弱擬桿菌，為在2012年從嬰兒糞便中分離出一種具有益生菌特性的脆弱擬桿菌菌株(保藏編號為CGMCCNO.7280)，可用於治療炎症性腸病、腹瀉等。此外，通過對該菌株的進一步鑑定，發現該菌株(Bd312)在細菌形態、培養特性、生理生化反應結果與脆弱擬桿菌相似，經BLASTN序列比對，所分離菌株與脆弱擬桿菌標準株ATCC25285同源性達99％，藥敏實驗提示，菌株Bd312對頭孢拉定、阿莫西林、慶大黴素、磺胺甲嗯唑、甲氧苄啶不敏感，急慢性毒性試驗提示無毒性(劉洋洋，等.健康嬰兒體內的無毒脆弱擬桿菌的分離及鑑 定.中華醫學雜誌，2014年，第94卷，第30期，第2372-2374頁)。然而，目前還沒有關於利用脆弱擬桿菌治療腦膜炎的文獻記載。技術實現要素：本發明所要解決的技術問題是通過在多種疾病模型中對脆弱擬桿菌的作用進行檢測和鑑定，提供一種脆弱擬桿菌在預防和/或治療腦膜炎中的應用，能對腦膜炎具有良好的治療和/或預防效果。為了實現上述目的，本發明提供了了一種脆弱擬桿菌在製備用於預防和/或治療腦膜炎的藥物中的應用。上述的脆弱擬桿菌應用，其中，所述脆弱擬桿菌為脆弱擬桿菌ZY-312，該脆弱擬桿菌ZY-312於2015年4月2日保藏於中國普通微生物菌種保藏管理中心，其保藏號為CGMCCNo.10685。上述的脆弱擬桿菌應用，其中，所述腦膜炎為新生兒腦膜炎。上述的脆弱擬桿菌應用，其中，所述腦膜炎為細菌性腦膜炎。上述的脆弱擬桿菌應用，其中，所述新生兒腦膜炎為細菌性腦膜炎。為了更好地實現上述目的，本發明還提供了一種用於預防和/或治療腦膜炎的藥物組合物，其中，所述藥物組合物包括藥學有效劑量的脆弱擬桿菌ZY-312，該脆弱擬桿菌ZY-312於2015年4月2日保藏於中國普通微生物菌種保藏管理中心，其保藏號為CGMCCNo.10685。上述的藥物組合物，其中，所述藥物組合物為膠囊、溶液、懸乳液、袋裝粉劑或顆粒劑，每一單一劑量的所述脆弱擬桿菌ZY-312菌株為106-1011細胞。為了更好地實現上述目的，本發明還提供了一種用於預防和/或治療腦膜炎的食品，其中，所述食品含有脆弱擬桿菌ZY-312，該脆弱擬桿菌ZY-312於2015年4月2日保藏於中國普通微生物菌種保藏管理中心，其保藏號為CGMCCNo.10685。為了更好地實現上述目的，本發明還提供了一種用於預防和/或治療腦膜炎的保健品，其中，所述保健品含有脆弱擬桿菌ZY-312，該脆弱擬桿菌ZY-312於2015年4月2日保藏於中國普通微生物菌種保藏管理中心，其保藏號為CGMCCNo.10685。為了更好地實現上述目的，本發明還提供了一種用於預防和/或治療腦膜 炎的食品添加劑，其中，所述食品添加劑含有脆弱擬桿菌ZY-312，該脆弱擬桿菌ZY-312於2015年4月2日保藏於中國普通微生物菌種保藏管理中心，其保藏號為CGMCCNo.10685。本發明的技術效果在於：本發明的脆弱擬桿菌對於預防和/或治療腦膜炎具有很好的效果，不產生耐藥性，且安全無毒，為治療和/或預防腦膜炎提供了新的選擇。此外，本發明的脆弱擬桿菌ZY-312是一株新的脆弱擬桿菌，該菌株是從發育良好的嬰兒糞便中分離純化得到的，是具有益生菌特性的脆弱擬桿菌新菌株，實驗表明所分離到的脆弱擬桿菌ZY-312不含腸毒素基因bft(Bacteroidesfragilistoxin)，與現有菌株相比，具有耐膽鹽、耐胃酸等益生特性，具有廣闊的應用前景。以下結合附圖和具體實施例對本發明進行詳細描述，但不作為對本發明的限定。附圖說明圖1為本發明的脆弱擬桿菌ZY-312厭氧培養後菌落形態圖；圖2為本發明的脆弱擬桿菌ZY-312革蘭氏染色鏡檢圖(1000×)；圖3為本發明的脆弱擬桿菌ZY-312掃描電鏡觀察圖(30000×)；圖4為本發明的PCR產物凝膠電泳結果對比圖；圖5為本發明的PCR產物凝膠電泳結果對比圖；圖6為根據全基因組序列比較建立的系統發育樹截圖；圖7為本發明的ZY-312對阪崎克羅諾桿菌的抑制作用對比效果圖。本發明的脆弱擬桿菌(Bacteroidesfragilis)，命名為ZY-312，於2015年4月2日保藏於中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)，其保藏編號為CGMCCNo.10685，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號。具體實施方式下面結合附圖對本發明的結構原理和工作原理作具體的描述：本發明的實施方式包括：本發明通過對大量來自健康嬰兒的糞便進行篩選，篩選出大量脆弱擬桿菌菌株，通過理化實驗鑑定，發現了一種新的脆弱擬 桿菌(Bacteroidesfragilis)，命名為ZY-312，與現有的脆弱擬桿菌菌株相比，其具有耐膽鹽、耐胃酸等益生特性，可以彌補原有益生菌的一些缺陷，在消化道的含膽鹽、酸性條件下仍然保持較高生物活性，是益生菌製品的優選菌株。該脆弱擬桿菌ZY-312於2015年4月2日保藏於中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)，其保藏編號為CGMCCNo.10685，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號。利用脆弱擬桿菌ZY-312可以製備成藥物組合物。該藥物組合物含有藥學有效劑量的脆弱擬桿菌ZY-312。此外，所述藥物組合物還可以含有合適的藥物載體。該藥物組合物可以為膠囊、溶液或可飲用懸乳液、袋裝粉劑、顆粒劑等形式，每一單一劑量優選為脆弱擬桿菌ZY-312菌株約為106-1011細胞。本發明的脆弱擬桿菌ZY-312還可以製成食品、保健品或食品添加劑等。所述食品、保健品或食品添加劑均含有脆弱擬桿菌ZY-312。這些食品、保健品或食品添加劑均可用於預防和治療新生兒腦膜炎。下面將結合具體實施例對本發明作進一步說明。需要指出的是，由本發明中的用於預防和/或治療腦膜炎的脆弱擬桿菌或含有本發明的脆弱擬桿菌的藥物組合物、食品、保健品和食品添加劑在施用於受試者後，都可以應用於上文所述的適應症並展現出上文所述的功能，在本發明範圍內的所有劑型均已測試，下文中，僅僅是為說明，只在實施例中描述了其中一少部分，然而不應將其理解為對本發明的限制。除非特殊說明，否則本發明中所使用的試劑都是市售可購買的。實施例1脆弱擬桿菌ZY-312的分離、純化試劑和儀器(1)培養基A：類桿菌-膽汁-七葉苷(BBE)瓊脂(青島海博生物科技有限公司，貨號：HB7028)基礎上加入改良配方，具體成分如下表一：表一(2)培養基B：類桿菌-膽汁-七葉苷(BBE)瓊脂(青島海博生物科技有限公司，貨號：HB7028)基礎上加入改良配方，具體成分如下表二：表二(3)培養基C：布氏肉湯(青島海博生物科技有限公司，貨號：HB0241)中加入胎牛血清，加入量為5％(v/v)(浙江天杭生物科技股份有限公司，品牌：四季青，貨號：HB0205)。(4)實驗儀器2.5L密封培養罐(三菱瓦斯化學株式會社，C-31)恆溫培養箱(上海一恆科學儀器有限公司，型號：DHP-9082)顯微鏡(尼康儀器(上海)有限公司，型號：E100)PCR儀(賽默飛世爾科技公司，型號：AppliedPCR系統9700)電泳儀(北京市六一儀器廠，型號：DYCP-32B)(5)試劑厭氧產氣袋(三菱瓦斯化學株式會社，貨號：C-1)細菌DNA提取試劑盒(BacterialDNAKit(細菌DNA提取試劑盒)OMEGA，貨號：D3350-01)Taq酶(寶生物工程(大連)有限公司，貨號：DR100A)瓊脂糖(品牌：Biowest，貨號：91622)磺胺甲惡唑(西格瑪奧德裡奇公司(sigma)，貨號：S7507-10G)甲氧苄啶(西格瑪奧德裡奇公司(sigma)，貨號：T7883-5G)維生素K1(青島日水生物科技有限公司，貨號：21005)DL1000DNAMarker(生物工程(大連)有限公司，貨號：D526A)脆弱擬桿菌產腸毒素株(南方醫院消化科孫勇老師提供，分離自臨床腹瀉患者)脆弱擬桿菌標準株ATCC25285(購自廣東省微生物研究所)脆弱擬桿菌菌株Bd312(保藏號為CGMCCNo.7280，由廣州知光生物科技有限公司提供)BF839菌株(分離自圖騰益生液)。(6)培養基配置培養基A配置：稱取BBE培養基61.5克，加熱溶解於1000mL蒸餾水中，121℃高壓滅菌15分鐘，冷卻至50℃左右時，加入過濾除菌的磺胺甲噁唑1g、甲氧苄啶4g和無菌脫纖維羊血50mL，混勻，傾入無菌平皿，備用。培養基B配置：稱取BBE培養基61.5克，加熱溶解於1000mL蒸餾水中，121℃高壓滅菌15分鐘，冷卻至50℃左右時，加入過濾除菌的磺胺甲噁唑1g、甲氧苄啶4g，混勻，傾入無菌平皿，備用。培養基C配置：稱取布氏肉湯培養基28.1g，加熱攪拌溶解於1000mL蒸餾水中，分裝三角瓶，121℃高壓滅菌15分鐘，備用。使用前，加入5％的胎牛血清。布氏肉湯配置：稱取布氏肉湯培養基28.1g，加熱攪拌溶解於1000mL蒸餾水中，分裝三角瓶，121℃高壓滅菌15分鐘，備用。方法：1、分離純化取新鮮的嬰兒糞便0.5g，置於盛有4.5mL布氏肉湯的三角瓶中，振蕩1分鐘。取0.1mL滴於培養基上，劃線後，置於厭氧罐中，37℃、培養48小時。挑取典型菌落於布氏肉湯培養基24h，進行革蘭氏染色。顯微鏡下觀察形態，選取革蘭氏陰性菌的菌液，劃線接種於血平皿，厭氧培養48h。根據平板上菌落形態特徵及鏡下觀察菌體的染色特性、大小、球桿狀和分布情況，判斷是否純化。如細菌不純，則繼續以上步驟，反覆多次分離傳代，直至得到純化的菌株。2、菌落特徵脆弱擬桿菌ZY-312在血平皿上培養48h後，呈現圓形微凸、半透明、白色、表面光滑、不溶血，菌落直徑在1-3mm，參見圖1。3、顯微鏡下形態脆弱擬桿菌ZY-312進行革蘭氏染色鏡檢，為革蘭陰性細菌，呈現典型的杆狀，兩端鈍圓而濃染，菌體中間不著色部分形如空泡，參見圖2。4、電鏡下形態固定液固定，掃描電鏡觀察。鏡下可見，脆弱擬桿菌ZY-312大小在0.5～0.8×1～4.5μm，無鞭毛，無芽孢，參見圖3。5、生化鑑定生化鑑定結果如下表三(表中，+表示陽性，-表示陰性)表三測定反應底物結果色氨酸-脲素-葡萄糖+甘露醇-乳糖+蔗糖+麥芽糖+柳醇-木糖+阿拉伯糖-明膠-七葉靈+甘油-纖維二糖-/+甘露糖+松叄糖-棉子糖+山梨醇-鼠李糖-海藻糖-API20A(生化反應鑑定板，法國生物梅裡埃股份有限公司)生理生化反應結果顯示：脆弱擬桿菌ZY-312可發酵葡萄糖、乳糖、蔗糖、麥芽糖、木糖、七葉靈、甘露糖、棉子糖，符合脆弱擬桿菌的特徵。實施例2脆弱擬桿菌ZY-312鑑定聚合酶鏈式反應(PCR)引物(由英濰捷基(上海)貿易有限公司合成)序列如下：引物對1：正向引物：5』-ACGCTTGCACCCTCCGTATTA-3』反向引物：5』-GCTTAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3』引物對2：正向引物：5』-TGGGTGGTTGCTGCCTGGACACA-3』反向引物：5』-CATCCGGGTATGGATATGAA-3』引物對3：正向引物：5』-GATGCTCCAGTTACAGCTTCCATTG-3』反向引物：5』-CGCCCAGTATATGACCTAGTTCGTG-3』bft基因引物對：正向引物：5』-GACGGTGTATGTGATTTGTCTGAGAGA-3』反向引物：5』-ATCCCTAAGATTTATTATCCCAAGTA-3』1、PCR鑑定(PCR即聚合酶鏈式反應，是常用的快速擴增基因的方法)(1)16SrRNA序列測定取上述菌株接種於培養基A上，37℃、厭氧培養48h。取單一菌接種於液體培養基中，37℃、厭氧培養48h。DNA提取試劑盒提取細菌DNA(天根生化科技(北京)有限公司，貨號：DP302-02)，作為PCR模板DNA。16SrRNA基因序列的擴增：引物對1擴增片段大小約為531bp；引物對2擴增片段大小為518bp；引物對3擴增片段大小約為970bp。採用20μLPCR反應體系：Taq酶10μL、模板DNA2μL、正向反向引物各1μL、無菌去離子水6μL。PCR反應條件為：95℃預變性5min、95℃變性30s、55℃退火30s、72℃延伸45s、30個循環、72℃延伸10min。PCR產物在2％的瓊脂糖凝膠進行電泳，電泳條件為100V、15min。PCR產物凝膠電泳結果如圖4所示，其中1、2泳道分別為引物對1、引物對2；4、5泳道分別為引物對1、引物對2(重複PCR的結果)；3、6泳道為引物對3；8泳道為DNA分子量標準物(DL1000DNAmarker)。分離菌株DNA採用引物對1進行PCR擴增後產物大小為531bp，採用引物對2進行PCR擴增後產物大小為518bp，採用引物對3進行PCR擴增後產物大小為970bp，符合預期，所分離菌株為脆弱擬桿菌。將PCR產物進行核苷酸序列測定(由深圳華大基因科技有限公司進行測定)，測序結果在Genbank(美國國家生物技術信息中心建立的DNA序列資料庫)上進行BLAST比對(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，見表四。結果表明分離到為一株脆弱擬桿菌。表四為16SrRNA序列的BLAST比對結果(部分)表四(2)PCR檢測bft基因將測序篩選到的菌株接種於培養基C中，37℃、厭氧培養48小時。取培養菌液2mL，用細菌DNA提取試劑盒提取DNA，作為PCR模板DNA。bft基因的 擴增採用bft基因引物，擴增片段大小應為294bp。採用20μLPCR反應體系：Taq酶10μL、模板DNA2μL、上下引物各1μL、無菌去離子水6μL。PCR反應條件為：95℃預變性5min、95℃變性30s，55℃退火30s、72℃延伸45s，共30個循環，72℃延伸10min。PCR產物進行2％的瓊脂糖凝膠電泳，電泳條件為100V、15min。結果參見圖5，其中1、2、3、4泳道為分離菌株ZY-312電泳結果；5、6、7為產腸毒素株脆弱擬桿菌電泳結果；8泳道為DL1000DNAmarker。4、5泳道為bft基因引物對擴增產物；1、7泳道為引物對2擴增產物；2、6為引物對1擴增產物；3泳道為引物對3擴增產物。結果表明，ZY-312為一株脆弱擬桿菌，且不含有腸毒素bft基因，為一株新的無毒株。2、全基因組測序分析鑑定對脆弱擬桿菌ZY-312進行全基因組測序(深圳華大基因科技有限公司)，測序結果與已發表的菌株序列相互比對，利用treebest軟體(該軟體可在sourceforge網站上免費下載，下載連結為：http：//treesoft.svn.sourceforge.net/viewrc/treesoft/)採用鄰接法構建NJ-tree或利用軟體PhyML採用最大似然法構建最大似然樹。系統發育樹顯示(參見圖6)，脆弱擬桿菌ZY-312與脆弱擬桿菌標準株ATCC25285(即NCTC9343)在同一分支上，表明檢脆弱擬桿菌ZY-312為一株新的脆弱擬桿菌，與ATCC25285同源。對全基因組測序結果進行毒力基因分析，以驗證其是否含產毒素bft基因。結果顯示，脆弱擬桿菌ZY-312全基因組中不含bft基因，為一株不產腸毒素的新的脆弱擬桿菌。實施例3脆弱擬桿菌ZY-312對胃酸的耐受性1、人工胃液配製(根據2010年《中國藥典》人工胃液配製方法)23.4mL濃HCl溶解於100mL純化水中，即得稀鹽酸。取8.2mL稀鹽酸，加入400mL純化水與5g胃蛋白酶(豬源，1∶15000)，定容到500mL。 於37℃、磁力攪拌過夜，即得人工胃液。2、菌體準備收集菌液，離心，棄上清，生理鹽水重懸後，再次離心，棄上清，菌體備用。3、加入人工胃液測定活菌數向菌體加入人工胃液，重懸，分別測定0、1、2、3h活菌數。活菌計數採用10倍系列稀釋法：取100μL菌液加入900μL布氏肉湯培養基中，逐步梯度稀釋至合適濃度。例如，每個平板點4個濃度梯度，每個梯度重複點樣3次，每次點樣20μL。37℃、厭氧培養48h，數菌落數(取菌落數為3-30的濃度梯度計數)。活菌數(CFU/mL)＝三個點樣菌落總和/3×50×稀釋度表五為不同菌株胃酸耐受實驗結果(其中，數據為活菌濃度log值，h為小時)表五益生菌必須進入人體的胃腸道並達到一定濃度才能發揮其功能。從口腔到腸道過程中，益生菌首先必須以活菌狀態通過胃才有可能進入腸道。食物(尤其是流體)通過胃的時間一般為1-2h(小時)。根據飲食結構的不同，人體胃液的pH值波動很大，通常在pH3.0左右，空腹或食用酸性食品時可達pH1.5，食用鹼性食品時可達pH4-5，胃液的這種酸性環境可以激活胃蛋白酶原，從而殺死隨食物進入胃內的細菌。益生菌如果要在人體內發揮益生作用，就必須具有一定的耐酸能力和耐胃蛋白酶的能力。結果表明，與脆弱擬桿菌其他菌株相比，脆弱擬桿菌ZY-312在3h後活菌濃度仍然較高，而其他菌株的活菌濃度隨時間降低很快，說明ZY-312對胃酸耐受性較好，具有很好的益生潛力和應用前景。實施例4脆弱擬桿菌ZY-312對膽鹽耐受實驗1、實驗材料胰蛋白腖大豆肉湯(簡稱TSB，品牌：OXOID，貨號：CM0129B)胰蛋白腖大豆瓊脂(簡稱TSA，品牌：OXOID，貨號：CM0131B)牛膽粉(生物工程上海(股份)有限公司，貨號：ON1210)胎牛血清(美國MPBiomedicals公司，貨號：2916754)2、菌株和試劑的準備膽粉溶液：在TSB中加入牛膽粉，設置三個終濃度，分別為10g/L(1％牛膽粉)、20g/L(2％牛膽粉)和40g/L(4％牛膽粉)。滅菌後加入血清(終濃度50mL/L)待用。同時，以不加牛膽粉的TSB作為對照。菌株培養與收集：菌株(ZY-312、Bd312、BF839、ATCC25285)於37℃、厭氧液體靜態培養至對數生長後期(約14-16小時)，分裝至離心管中，每管分裝3ml菌液，室溫、4000rpm離心5分鐘。再用0.01MPBS洗菌1次(室溫、4000rpm離心5分鐘)，棄上清，沉澱待用。3、人工膽粉培養基中培養用上述膽粉溶液將洗滌後的細菌重懸，用含膽粉溶液調整初始菌液濃度為1×108CFU/mL。並在37℃、厭氧培養1、2、4小時，塗板計數活菌數目的變化，0小時細菌數目作為對照。實驗平行做3次。4、計算細菌耐受膽粉情況將上述三個時間點塗板結果，與對應的0小時結果進行比較，即可得到菌株在人工膽粉溶液中作用不同時間後其耐受膽粉的結果，以均數±標準差及統計結果說明。表六為SK08菌株耐膽粉實驗結果(n＝3)表六時間菌株膽粉濃度0％膽粉濃度1％膽粉濃度2％膽粉濃度4％0hZY-312100.00％100.00％100.00％100.00％Bd312100.00％100.00％100.00％100.00％BF839100.00％100.00％100.00％100.00％ATCC25285100.00％100.00％100.00％100.00％1hZY-31272.90±8.39％89.18±8.20％111.65±9.85％127.15±3.52％Bd31265.32±5.6％73.92±9.32％96.73±5.35％118.72±4.93％BF83950.32±3.09％65.73±7.32％89.33±7.39％94.76±6.32％ATCC2528551.34±3.45％66.97±3.54％90.73±2.51％95.72±8.43％2hZY-312112.15±3.73％131.30±3.44％190.61±5.54％226.80±24.63％Bd31299.39±6.17％103.83±2.52％135.32±5.92％164.03±8.43％BF83993.39±3.51％98.52±4.91％103.21±4.81％105.51±6.53％ATCC2528595.61±4.82％101.47±2.57％112.56±2.69％115.49±5.72％4hZY-312231.51±5.03％274.62±7.73％364.40±6.78％327.49±3.20％Bd312210.23±4.93％203.57±5.02％293.84±4.91％299.21±6.31％BF639202.52±3.91％211.82±6.41％229.57±4.91％253.41±4.62％ATCC25285204.97±5.82％201.93±5.93％246.52±6.41％254.38±4.93％結果如表六所示，0-4h觀察，ZY-312在1％、2％、4％濃度膽粉中均可正常生長，隨著膽粉濃度升高其活菌數越高，ZY-312活菌數顯著高於其他菌株組。結果表明ZY-312耐受膽鹽，並顯著優於其他菌株。膽鹽是肝細胞分泌的膽汁酸與甘氨酸或牛磺酸結合形成的鈉鹽或鉀鹽，它是膽汁參與消化和吸收的主要成分。膽鹽排到小腸後，大部分由小腸黏膜吸收入血，再入肝臟組成膽汁。人體小腸中膽鹽的質量濃度在0.03～0.3g/100mL的範圍波動。對於活細胞來說，膽鹽能破壞細胞膜，因此對膽鹽的耐受性是評價益生菌的重要指標之一。益生菌可產生膽鹽水解酶，此酶可將甘氨酸和牛磺酸結合的膽鹽催化水解為胺基酸殘基和游離膽鹽。具有膽汁鹽解離能力的菌株可以降低高膽固醇人群的血清膽固醇水平和防止正常人高膽固醇血症的發生。消化道中膽鹽的濃度不是固定不變的，在進食消化的開始1h，其質量濃度為15～20g/L，之後其質量濃度降為3g/L左右。益生菌必須在通過胃腸過程中，可以在正常的膽鹽濃度下存活，如要在小腸中定殖，必須耐受膽鹽的抑制作用。因此，相對於脆弱擬桿菌的其他菌株，ZY-312具有更好的應用前景。實施例5脆弱擬桿菌ZY-312對阪崎克羅諾桿菌的抑制作用的細胞實驗細胞和菌株：結腸腺癌細胞Caco-2由南方醫科大學微生物學系保存；阪崎克羅諾桿菌ATCC29544為購自ATCC(即美國模式培養物集存庫Americantypeculturecollection)的標準株；大腸桿菌E44、DH5α由南方醫科大學微生物學系保存。培養基：乳酸細菌培養基(簡稱MRS)、腦心浸液肉湯培養基(簡稱BHI)、細菌基礎培養基(簡稱LB)，購自廣東環凱微生物科技有限公司；胎牛血清(賽默飛世爾科技公司，品牌：Gbico)，購自廣州鼎國生物科技有限公司；無菌脫脂纖維綿羊血，購自南京便診生物科技有限公司。本實驗分為四個組，分別為對照組、競爭組、置換組、排斥組。對照組：Caco-2+ATCC29544共孵育3h；競爭組：Caco-2+ATCC29544+ZY-312共孵育3h；置換組：Caco-2+ATCC29544共孵育1h，再加ZY-312，繼續孵育2h；排斥組：Caco-2+ZY-312共孵育1h，再加ATCC29544，繼續孵育2h。細胞感染倍數為100(細胞∶細菌＝1∶100)，ZY-312為108CFU(Colony-FormingUnits，菌落形成單位，指單位體積中的活菌個數)。孵育後，細胞用培養基洗3次，加入100μL0.5％TritonX-100裂解細胞(此濃度TritonX-100在半小時之內不會影響細菌活性)，孵育8min後，立即加入50μL蒸餾水。在溶解細胞之前的孵育和清洗階段，單層細胞都要保持完整。反覆吹打後吸出樣品，做梯度稀釋(10-1～10-4)後塗血平板計數菌落數。計算侵襲率，侵襲率＝胞內細菌數/孵育細菌數×100％。共孵育分別採用競爭、排斥、置換方式，參見圖7，結果顯示：細胞中加入ZY-312後，克羅諾桿菌侵襲率明顯降低(*P＝0.0184＜0.05)，競爭組、排斥組、置換組與對照組有顯著性差異。實驗結果表明脆弱擬桿菌ZY-312可抑制ATCC29544對Caco-2細胞的侵襲。實施例6脆弱擬桿菌ZY-312對阪崎克羅諾桿菌的抑制作用的大鼠實驗實驗動物：SD大鼠窩鼠2-3日齡12窩，80隻，精神狀態良好，購自南方醫科大學實驗動物中心。分別進行預防和治療實驗，檢測ZY-312在動物體內對阪崎克羅諾桿菌的抑制效果，實驗分組及方案具體見表七，表七為動物實驗分組及處理方法，其 中，PBS為磷酸鹽緩衝液。表七通過ZY-312對乳鼠的預防和治療實驗，結果顯示：血液中均無ZY-312，表明使用ZY-312，不會引起益生菌性菌血症；血液中對照組100％檢測到ATCC29544，預防實驗組、治療實驗組檢測率分別為60％、70％；腦脊液檢測結果，對照組檢測率為70％(預防)和75％(治療)，而實驗組為0％(預防)和5％(治療)。實驗組檢測到腦膜炎的小鼠數量明顯少於對照組，說明ZY-312在體內可抑制阪崎克羅諾桿菌穿越腸屏障，從而減少進入血腦屏障的細菌數量，用ZY-312預防和/或治療細菌性腦膜炎具有顯著效果，見表八，表八為ZY-312對乳鼠阪崎克羅諾桿菌致腦膜炎的預防和治療效果，其中，腦脊液平板上長有致病菌的即定義為腦膜炎。表八可見，本發明的脆弱擬桿菌對於預防和/或治療腦膜炎具有很好的效果，不產生耐藥性，且安全無毒，為治療和/或預防腦膜炎提供了新的選擇。此外，本發明的脆弱擬桿菌ZY-312是一株新的脆弱擬桿菌，該菌株是從發育良好的嬰兒糞便中分離純化得到的，是具有益生菌特性的脆弱擬桿菌新菌株，實驗表明所分離到的脆弱擬桿菌ZY-312不含腸毒素基因bft，與現有菌株相比，具有耐膽鹽、耐胃酸等益生特性，具有廣闊的應用前景。當然，本發明還可有其它多種實施例，在不背離本發明精神及其實質的情況下，熟悉本領域的技術人員當可根據本發明作出各種相應的改變和變形，但這些相應的改變和變形都應屬於本發明所附的權利要求的保護範圍。當前第1頁1&nbsp2&nbsp3&nbsp