牡蠣天然活性肽及其製備方法和在製備抗癌藥物中的應用的製作方法
2023-11-03 09:47:22 1
專利名稱：牡蠣天然活性肽及其製備方法和在製備抗癌藥物中的應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種首次從自然界分離提取的多肽和製備方法及其在製備抗癌藥物中的應用。
(2)背景技術海洋天然活性物質是現代生物學研究熱點，現已發現其中含有多種抗腫瘤作用的化合物，而海洋天然活性肽是海洋活性物質研究的重要組成部分。牡蠣(Saccostrea cucullata)是一種高營養價值的貝類，也是一種很有藥用價值的海洋生物，所起藥用價值和保健功能不僅在中醫藥領域得到推崇，近些年來同樣受到國內外一些學者的重視。國內外都曾報導了牡蠣體內的抗菌肽、特異蛋白和酶類的分離純化和結構分析，但目前尚缺乏對牡蠣抗腫瘤活性物質的分離研究。尹淑敏等報導了牡蠣的藥用(中國藥學雜誌，1999，29(12)751-752)；王穎等公開了一種牡蠣提取物抗腫瘤作用的實驗研究(中國海洋藥物，1997，16(1)18-22)；曹棄元等公開了一種牡蠣提取物體外放射增敏作用(中國海洋藥物，1993，12(2)11-13，29)。
(3)發明內容本發明旨在提供一種首次從牡蠣中分離提取的牡蠣天然活性肽組分(The BioactivePeptides of Oyster in peakl，BPO-1)。
本發明的另一目的是提供一種從牡蠣(Saccostrea cucullata)中分離提取BPO-1的方法。
本發明的另一目的是BPO-1在製備抗癌藥物中的應用。
本發明所說的BPO-1的組分由7種蛋白組成，其分子量介於29～97kD之間，分別為29kD、30kD、32kD、37kD、57kD、91kD和97kD。
本發明所說的BPO-1的製備方法是1、將牡蠣勻漿，收集勻漿液；2、對牡蠣勻漿液酸抽提，收集上清液；3、對牡蠣勻漿上清液進行分子篩層析，純化牡蠣活性物質，收集含有牡蠣天然活性肽組份。
在牡蠣勻漿時，可加入Tris-HCl緩衝液，其含量為新鮮牡蠣與Tris-HCl緩衝液的體積比為1∶1。
對牡蠣勻漿液採用酸抽提時，可用20mmol/L HCl反覆抽提，收集所有的上清液置冷凍乾燥機乾燥後即為牡蠣酸提物。
所說的分子篩層析可將牡蠣酸提物溶解於洗脫液中，再將牡蠣酸提物溶解液加到層析柱的Sephadex G-50膠面上洗脫。
所說的BPO-1可作為製備抗癌藥物的活性組份。
本發明採用勻漿、低溫超速離心、冷凍乾燥和柱層析從牡蠣體內分離提取出BPO-1，並證實了BPO-1是一種具有顯著的誘導胃癌等腫瘤細胞凋亡作用的海洋生物抗腫瘤活性物質，能有效地抑制胃癌細胞惡性增殖活動，降低胃癌細胞代謝相關酶活性，幹預胃癌相關癌基因與抑癌基因的表達、調控細胞周期，促使胃癌細胞出現細胞凋亡形態與超微結構特徵，進而誘導胃癌細胞凋亡。因此BPO-1可作為具有誘導細胞凋亡作用的活性肽組份在製備抗癌藥物中應用。
(4)
圖1為牡蠣細胞提取物SDS電泳圖譜。
圖2為分離純化操作流程圖。
圖3為牡蠣細胞提取物Sephadex G-50凝膠柱層析洗脫曲線。
圖4為蛋白SDS-PAGE電泳標準曲線。
圖5為BPO-1對人胃腺癌BGC-823細胞生長的影響。
圖6為BPO-1對人胃腺癌BGC-823細胞分裂指數的影響。
圖7為BGC-823細胞DNA瓊脂糖凝膠電泳結果。
圖8為HE染色觀察結果圖版。
圖9為BGC-823細胞透射電鏡觀察圖版。
圖10為40μg/mL BPO-1處理的BGC-823細胞透射電鏡觀察圖版。
圖11為BPO-1對BCG-823細胞相關癌基因與抑癌基因表達的影響圖版。
(5)具體實施方式
牡蠣天然活性肽BPO-1是鮮活牡蠣經勻漿，離心再經酸抽提和葡聚糖凝膠SephadexG-50凝膠柱層析後，從第一個洗脫峰中分離所得到的一組天然活性肽組分。參見圖1，SDS-PAGE電泳表明該組分由7種蛋白組成，分子量介於29-97kD之間，分別為29kD、30kD、32kD、37kD、57kD、91kD和97kD。在圖1中A為BPO-1，B為牡蠣酸粗提物，C為Maker，a為雞蛋清溶菌酶97000，b為胰蛋白酶抑制劑66200，c為牛碳酸酐酶43000，d為免肌動蛋白31000，e為牛血清蛋白20100，f為免磷酸化酶14400。
BPO-1的分離提取方法如下(參見圖2)
1.BPO-1的提取將鮮活僧帽牡蠣低溫0-4℃保存。取適當量，懸浮於50mM NaCl的20mM Tris-Cl緩衝液中，用攪拌機攪拌勻漿，將勻漿液在4℃低溫10,000rpm離心30min，收集的沉澱用含50mM NaCl的20mM Tris-HCl緩衝液洗滌三次後，懸浮於20mM HCl中，攪拌均勻，再次充分勻漿，將勻漿液在4℃低溫10,000rpm離心30min，收集上清液，沉澱用20mM HCl抽提兩次，同樣收集上清液，棄沉澱，三次收集的上清液為牡蠣提取混合物，冷凍乾燥。
2.BPO-1的分離採用Sephadex G-50(工作範圍500-10,000)分子篩層析純化牡蠣活性物質。先將Sephadex G-50凝膠顆粒溶於無菌水中沸水浴2h使其膨脹後，無菌水細心洗滌，除去細小顆粒，然後將凝膠溶於洗脫液中，將其小心地灌到已經垂直裝好的層析柱(100m×3cm)中，保留10cm柱高，將牡蠣提取物通過長嘴吸管沿柱壁周圍均勻加到膠面上，20mM HCl洗脫，流速40mL/h，核酸蛋白檢測儀280nm處記錄，結果發現牡蠣粗提物經柱層析後，分子量大小不同的蛋白質組分初步得到分離。BPO-1是相對較高分子量蛋白質，經過分子篩層析柱時，較早洗脫出來，參見圖3，收集了含有BPO-1的峰(I)，冷凍乾燥，用於鑑定和細胞培養實驗。
3.BPO-1的分子量測定安裝電泳槽。用細頭長嘴滴管吸取1％瓊脂溶液，封住玻璃板與矽膠間的縫隙，加瓊脂溶液時，應防止氣泡進入，在每個樣品槽內，只加一種樣品或標準蛋白質，加樣量為20μL。在電泳槽中倒入0.1％SDS pH7.2 Tris緩衝液，連接電泳儀與電泳槽。打開電源，將電壓調至80V60min，樣品進入分離膠後，SDS凝膠電泳160V，300min。電泳結束後，取下凝膠膜，用鑷子撬開玻璃板，放入大培養皿中，將考馬斯亮藍染色液(考馬斯亮藍R-250∶甲醇∶蒸餾水∶冰醋酸＝1.0g∶450mL∶450mL∶100mL)倒入培養皿中，染色2h，用蒸餾水漂洗，再用脫色液(甲醇∶冰醋酸∶蒸餾水＝1∶1∶8)脫色。繪製標準曲線(參見圖4)。計算BPO-1各組分的分子量。從圖4中的蛋白種類和標準蛋白分子量上比較(圖1)，峰I有7種組分，分子量較大，，分別為29,000，30,000，32,000，37,000，57,000，91,000，97,000。BPO-1分離所用儀器設備見下表。
BPO-1分離所需試劑見下表。
以下給出BPO-1在製備抗癌藥物中應用的實驗資料。
以人胃腺癌細胞系BCG-823細胞(引自中科院上海細胞生物學研究所細胞庫)為實驗模型，研究了BPO-1對腫瘤細胞的生物學效應，所得結果如下1.BPO-1對人胃腺癌BCG-823細胞增殖抑制作用1)細胞生長曲線測定圖5給出BPO-1對人胃腺癌BGC-823細胞生長的影響，細胞生長曲線測定結果顯示人胃腺癌BGC-823細胞增殖速度較快，當接種細胞數為5×104/mL時，連續計數至第七天，細胞數為82.29×104/mL，為原來的16.46倍。經不同濃度的BPO-1處理後，BGC-823細胞狀態分別受到不同程度的抑制，其中30μg/mL BPO-1處理7天，細胞計數結果為51.46×104/mL細胞數為原來的10.29倍，細胞生長抑制率達37.46％。35μg/mL BPO-1連續處理7天，細胞減至41.04×104/mL，僅為原來的10.21倍，細胞生長抑制率為50.13％，與對照組細胞相比較，具有非常顯著性差異。而經40μ g/mLBPO-1處理7天後，細胞計數結果為29.91×104/mL，細胞數僅為原來的5.98倍，細胞生長抑制率高達63.65％。由於30μg/mLBPO-1對細胞生長的抑制率相對較低，而40μg/mL BPO-1處理時細胞鋪展已較為明顯，細胞生長受到明顯抑制，因此本研究選擇40μg/mLBPO-1作為處理BGC-823細胞的適宜濃度。
2)細胞分裂指數測定圖6為BPO-1對人胃腺癌BGC-823細胞分裂指數的影響，細胞分裂指數測定結果顯示，BGC-823細胞具有旺盛的增殖能力，在接種第四天後達到分裂高峰，細胞分裂指數值為33.64‰。但經40μg/mL BPO-1處理後，細胞的分裂指數呈下降趨勢，分裂高峰較對照組前移一天，即加藥處理後第三天達到分裂高峰，分裂高峰值為15.90‰，抑制率達52.73％。
3)細胞周期檢測應用流式細胞儀檢測BPO-1對人胃腺癌BGC-823周期分布的影響(見下表)。檢測結果顯示，BPO-1抑制BGC-823細胞增殖過程分為兩階段先使細胞停留在G0/G1期；誘導G0期細胞產生凋亡。隨著BPO-1濃度的增加，亞G1峰增寬、增高。
其中以20μg/mLBPO-1處理細胞，細胞周期即發生明顯的G0/G1期阻抑，亞G1期細胞比例上升為15.4％，而G2/M期細胞比例則無明顯變化，細胞出現凋亡；30μg/mLBPO-1處理的細胞周期各時相的分布與其處理20μg/mL的相類似，亞G1期細胞比例達17.6％，而G2/M期細胞比例也無明顯變化，細胞仍被阻滯於G0/G1期；40μg/mL處理的細胞周期各時相的分布也與20μg/mL、30μg/mL處理的相類似，亞G1期細胞比例高達25.1％，但與對照組細胞相比G2/M期無明顯區別，細胞很少，未發生明顯變化。結果顯示BPO-1對BGC-823細胞的生長抑制作用與細胞凋亡有關。經不同濃度BPO-1處理後，BGC-823細胞周期均出現明顯的亞G1期(凋亡峰)，並且隨BPO-1濃度增加逐漸比例增大，而G2/M期細胞比例則無明顯變化。
2.BPOL-1對人胃腺癌BCG-823細胞形態和超微結構變化的影響1)光學顯微鏡觀察光鏡下，BGC-823細胞具有人胃腺癌細胞典型的形態特徵，呈上皮樣、圓形、梭形、腎形等不規則形態，同時較常見癌巨細胞、多核細胞以及多極分裂相等。細胞體積較小，細胞核大，核形不規則，常見畸形核，核內常見多個核仁；細胞質較少，HE染色不均勻，著色深淺不一。參見圖8，圖版說明如下圖版8-1為BCG-823細胞，×536；圖版8-2為0.1mg/ml BPOL-1處理的BCG-823細胞，×536。
經30μg/mL BPO-1處理的BGC-823細胞形態發生變化，細胞體積變小，形態較一致，核仁數目減少；35μg/mLBPO-1處理的BGC-823細胞形態較一致，胞質突起較為明顯，發現有固縮細胞，細胞核變小，癌巨細胞，多核細胞較少；經40μg/mL處理的BGC-823細胞，群體細胞形態一致，排列規則，固縮細胞較多，HE染色較深，細胞多見胞質突起，核仁減少，有些細胞發現有明顯的核凝聚現象。
2)透射電鏡觀察透射電子顯微鏡觀察結果顯示，BGC-823細胞體積較小，形狀不規則，核質比例大。細胞核較大，形態不規則，核膜向核內有不同程度的凹陷，核內有多個核仁，大小不一，還可見核仁內大小不一的核仁小泡。細胞核內異染色質多，除核內膜與核仁部位較多外，還有一些呈團塊地散在分布。在細胞質內，線粒體體積小，形狀不規則，常可見呈深色負染，有些還呈空泡化，線粒體嵴數量較少，基質的電子密度也不均勻。高爾基體少見，體積較小，高爾基囊數目少排列不規則，極性不明顯，高爾基囊腔有明顯的膨脹現象，甚至呈泡狀化。粗糙內質網不發達，數量少，長度相對較短，呈散在分布。細胞質多聚核糖體較多，游離核糖體較少。有些細胞還有少量的分泌顆粒，溶酶體少見，細胞表面還有較多的微絨毛突起，參見圖9，圖版說明如下圖版9-1為BGC-823細胞，細胞核質比例較大，細胞器不發達，×8600。N(細胞核)Nu(核仁)Mi(線粒體)ER(內質網)SG(分泌顆粒)圖版9-2為BGC-823細胞局部，細胞器不發達，×11100。
圖版9-3為BGC-823細胞核，核仁較大，核形狀不規則，×8600。
圖版9-4為BGC-823細胞線粒體形態不規則，×21500。
圖版9-5為BGC-823細胞多聚核糖體較多，游離核糖體較少，×37100。
經過40μg/mL BPO-1處理後的BGC-823細胞的超微結構均產生了明顯的變化。經過40μg/mL BPO-1處理的BGC-823細胞主要表現為細胞體積變小，細胞形態較為一致；細胞核內的異染色質塊增多，一些較大的團塊邊聚，使核內出現了透明區域，有些細胞可見明顯的緻密核和殘核；細胞質變得較為緻密，細胞膜皺縮但完整，有小泡形成，基質的電子密度增高，細胞質體積縮小，細胞器數目減少，線粒體空泡化明顯，內質網網腔擴大，但都可辨認；透射電鏡下可見體積小、數目多的凋亡小體，參見圖10，圖版說明如下圖版10-1為40μg/mL BPO-1處理的BGC-823細胞，細胞體積固縮，細胞質內有空泡化現象，×14900。
圖版10-2為40μg/mL BPO-1處理組細胞局部，示細胞質空泡化，線粒體腫脹，×10000。
圖版10-3為40μg/mL BPO-1處理組細胞核斷裂，×5000。
圖版10-4為40μg/mL BPO-1處理組細胞，線粒體空泡化，×21000。
圖版10-5為40μg/mL BPO-1處理組凋亡小體，×8000。
3.BPO-1對人胃腺癌BGC-823細胞作用DNA電泳結果圖7為BGC-823細胞DNA瓊脂糖凝膠電泳結果，其中1為DNA Marker DL2000+DL15,000；2為對照組；3為20μg/mL BPO-1處理；4為40μg/mL BPO-1處理。
經過BPO-1處理的BGC-823細胞DNA瓊脂糖電泳顯示出現了不同與對照組細胞的條帶現象。其中20μg/mL BPO-1實驗組DNA電泳現象與對照組相比變化不明顯，而40μg/mL實驗BPO-1組較對照組相比，產生了180bp-200bp或倍數級左右的小分子DNA。推測細胞核DNA可能出現了水解，出現了條帶(參見圖7)。
4.BPOL-1對BCG-823細胞相關癌基因與抑癌基因表達的影響參見圖11，圖版說明如下圖版11-1，11-3，11-5，11-7為對照組。
圖版11-2，11-4，11-6，11-8為實驗組。
1)BPO-1對BGC-823細胞p53蛋白表達的影響應用免疫細胞化學方法檢測BGC-823細胞在BPO-1、薑黃素及其組合處理前後突變型p53蛋白(MTp53)表達的變化。檢測結果顯示，BGC-823對照組細胞尤其是球形細胞中MTp53蛋白免疫顯色反應呈強陽性，反應產物為深棕黃色顆粒，主要分布於細胞核和核周邊細胞質區域，細胞質其它區域分布相對較少。
經BPO-1處理後，BGC-823細胞中MTp53蛋白表達量均明顯下降，免疫細胞化學反應為弱陽性，淺黃色反應產物僅少量分布於核周邊細胞質區域，細胞核內幾乎沒有分布。
2)BPO-1對BGC-823細胞bcl-2蛋白表達的影響免疫細胞化學檢測顯示，BGC-823細胞bcl-2蛋白含量較高，免疫顯色反應呈強陽性，反應產物為深棕黃色顆粒，大量分布於細胞質和細胞核內，分布較為緻密，尤其是球形細胞內bcl-2蛋白遍布整個細胞。BPO-1對BGC-823細胞bcl-2蛋白表達有一定的影響。
經40μg/mLBPO-1處理，細胞內bcl-2蛋白免疫顯色反應略有降低，但仍呈陽性表達，反應產物為深黃色，細胞質和細胞核內仍有大量分布，但與對照組相比其細胞內尤其是核周邊細胞質內bcl-2蛋白分布仍有一定程度的降低。
3)BPO-1對BGC-823細胞c-myc蛋白表達的影響應用免疫細胞化學檢測BPO-1誘導處理前後人胃腺癌BGC-823細胞c-myc蛋白表達的變化。檢測結果顯示，c-myc在對照組BGC-823細胞尤其是球形細胞中表達較弱，免疫顯色反應呈弱陽性，反應產物為黃色顆粒，主要分布於細胞核和核周邊細胞質區域。
BPO-1誘導處理可顯著促進BGC-823細胞c-myc蛋白表達，其免疫細胞化學顯色反應為強陽性，反應產物為棕黃色顆粒，主要分布於細胞核周邊細胞質區域，細胞質內分布較少。
4)BPO-1對BGC-823細胞Fas蛋白表達的影響應用免疫細胞化學檢測BPO-誘導處理前後人胃腺癌BGC-823細胞Fas蛋白表達的變化。檢測結果顯示，Fas在對照組BGC-823細胞尤其是球形細胞中表達較弱，免疫顯色反應呈弱陽性，反應產物為黃色顆粒，主要分布於細胞核和核周邊細胞質區域。
BPO-1處理可顯著促進BGC-823細胞Fas蛋白表達，其免疫細胞化學顯色反應為強陽性，反應產物為深黃色顆粒，主要分布於細胞核周邊細胞質區域，細胞質內分布較少。
權利要求
1.牡蠣天然活性肽，其組分由7種蛋白組成，其分子量介於29～97kD之間，分別為29kD、30kD、32kD、37kD、57kD、91kD和97kD。
2.如權利要求1所述的牡蠣天然活性肽的製備方法是1)、將牡蠣勻漿，收集勻漿液；2)、對牡蠣勻漿液酸抽提，收集上清液；3、)對牡蠣勻漿上清液進行分子篩層析，純化牡蠣活性物質，收集含有牡蠣天然活性肽組份。
3.如權利要求2所述的牡蠣天然活性肽的製備方法，其特徵在於在牡蠣勻漿時，加入Tris-HCl緩衝液，其含量為新鮮牡蠣與Tris-HCl緩衝液的體積比為1∶1。
4.如權利要求2所述的牡蠣天然活性肽的製備方法，其特徵在於對牡蠣勻漿液採用酸抽提時，用20mmol/L HCl反覆抽提至少兩次，收集所有的上清液置冷凍乾燥機後即為牡蠣酸提物。
5.如權利要求2所述的牡蠣天然活性肽的製備方法，其特徵在於所說的分子篩層析將牡蠣酸提物溶解於洗脫液中，再將牡蠣酸提物溶解液加到層析柱的葡聚糖凝膠SephadexG-50膠面上洗脫。
6.如權利要求1所述的牡蠣天然活性肽作為製備抗癌藥物的活性組份。
全文摘要
涉及一種從自然界分離提取的多肽和製備方法及其在製備抗癌藥物中的應用。牡蠣天然活性肽其組分由7種蛋白組成，其分子量介於29～97kD之間，分別為29kD、30kD、32kD、37kD、57kD、91kD和97kD。採用勻漿、低溫超速離心、冷凍乾燥和柱層析從牡蠣體內分離提取，並證實是一種具有顯著的誘導胃癌等腫瘤細胞凋亡作用的海洋生物抗腫瘤活性物質，能有效地抑制胃癌細胞惡性增殖活動，降低胃癌細胞代謝相關酶活性，幹預胃癌相關癌基因與抑癌基因的表達、調控細胞周期，促使胃癌細胞出現細胞凋亡形態與超微結構特徵，進而誘導胃癌細胞凋亡。可在製備抗癌藥物中應用。
文檔編號A61P3/00GK1478542SQ0214171
公開日2004年3月3日 申請日期2002年8月30日 優先權日2002年8月30日
發明者李祺福 申請人:廈門大學