粘質沙雷氏菌NlM280及作為殺蟲劑的應用的製作方法

2023-11-08 04:13:22

粘質沙雷氏菌NlM280及作為殺蟲劑的應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種粘質沙雷氏菌NlM280及作為殺蟲劑的應用，粘質沙雷氏菌NlM280發酵培養獲得的菌懸液或菌懸液離心後的上清液可應用於褐飛蝨或二化螟的防治；對褐飛蝨採用注射和飼餵該菌菌懸液或發酵上清液的結果表明，其菌懸液注射對褐飛蝨的致死率2天可達100％，飼餵菌懸液3天致死率為79.8％；該菌株發酵液的上清液在55℃以下處理均不影響其致病效果，注射發酵上清液致死率2天時可達97.2％，飼餵發酵上清液效果滯後，6天時致死率達84.2％。菌懸液和發酵上清液噴施水稻後飼餵二化螟，對二化螟的致死率4天時可達80.0％以上。
【專利說明】粘質沙雷氏菌NIM280及作為殺蟲劑的應用 (一）

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一株對水稻害蟲（褐飛蝨和二化螟）具有致病作用的新菌株-粘質沙 雷氏菌以及該菌在褐飛蝨和二化螟防治方面的應用。 (二）

【背景技術】
[0002] 水稻是我國主要糧食作物之一，它是超過一半世界人口的主糧。因此在糧食安全 生產中佔有極其重要的地位。然而，水稻也是受蟲害侵襲最為嚴重的糧食作物之一。全國 稻區病蟲害常年發生面積在1億公頃次以上，每年可造成稻穀損失約60萬噸。因此，有效 地控制水稻害蟲對水稻增產具有重要意義。
[0003] 褐飛風（Nilaparvata 1 μ gens Still ) (Brown planthopper)屬於同翅目飛風科， 是我國和許多亞洲國家當前水稻上的首要害蟲，可以直接取食或將病菌和病毒傳給水稻， 從而給糧食生產帶來巨大損失。褐飛蝨具有遠距離遷飛的能力和很強的適應性。目前，控 制褐飛蝨致害性的首要方法是化學殺蟲劑如吡蟲啉、噻嗪酮、仲丁威及異丙威，但隨著吡蟲 啉大範圍高頻次的使用，稻飛蝨對其抗藥性快速提高，各地反映其對稻飛蝨的效果大不如 前。其次是培育抗性水稻品種，但由於褐飛蝨的強適應性，化學農藥容易導致產生抗藥性種 群和飛蝨的再猖獗，抗性水稻的培育和種植雖對環境友好但也由於能克服寄主抗性的新褐 飛蝨致害性種群出現，導致其危害越來越嚴重。
[0004] 二化螟（Chilo s μ ppressalis Walker)屬鱗翅目，螟蛾科，是我國水稻上危害最 為嚴重的常發性害蟲之一，在分櫱期受害造成枯鞘、枯心苗，在穗期受害造成蟲傷株和白 穗，一般年份減產3%?5%，嚴重時減產在3成以上造成的經濟損失約為115億元，已成為 取代稻飛蝨和棉鈴蟲，影響我國國計民生的頭號害蟲（盛承發等，2003)。二化螟除危害水 稻外，還能危害茭白、玉米、高粱、甘蔗、油菜、蠶豆、麥類以及蘆華、稗、李氏禾等雜草。目前 我國防治水稻二化螟的主要藥劑為沙蠶毒素類的殺蟲單，殺蟲雙，三唑磷以及進口農藥氟 蟲晴，銳勁特等化學農藥。純生物農藥也得到了逐步推廣。但由於化學農藥長期大量使用， 二化螟對其抗藥性逐漸增高，其中對沙蠶毒素類已增長了 67倍，已不能單獨控制二化螟為 害（汪明根等，2004)。進口農藥氟蟲晴對二化螟防效較好但存在著防治成本高，對水生動 物不安全等缺點。因此，開發選用新型高效農藥新品種有效防治二化螟顯得十分迫切。
[0005] 通過化學殺蟲劑控制水稻害蟲，不僅生產成本高，且對生態平衡造成破壞，對人、 畜健康危害嚴重，農藥殘留對人類生存環境造成長期影響，害蟲也產生了抗藥性。因此挖 掘有益微生物資源，開發新型微生物殺蟲劑將成為農藥產業的主體。目前主要的微生物殺 蟲劑包括有細菌殺蟲劑、病毒殺蟲劑和真菌殺蟲劑。細菌殺蟲劑其作用機制是胃毒作用， 昆蟲攝入病原細菌製劑後，通過腸細胞吸收，進入體腔和血液，使之得敗血症導致全身中毒 死亡。目前篩選的殺蟲細菌大約有100多種，其中被開發成產品投入實際應用的主要有4 種，即蘇雲金芽孢桿菌（Bacill μ s th μ ringiensis, Bt)、日本金龜子芽孢桿菌（Bacill μ s popilliae)、球形芽抱桿菌（Bacillus sphaeric μ s Meyer and Neide)和緩病芽抱桿菌 (Bacillus Lentimorb μ s)。其中蘇雲金芽孢桿菌是商業開發最成功的殺蟲劑）。這些殺 蟲劑在生產實踐中均不同程度的存在局限性如殺蟲譜窄、穩定性差，易產生抗藥性等。因此 急需挖掘微生物資源，尋找新的殺蟲譜廣，性能穩定的微生物殺蟲劑，並通過基因工程等手 段對其進行有目的的改進，從而能更好地發揮生物防治的綜合效益。
[0006] 粘質沙雷氏菌（Serratia marcescens)屬於腸桿菌科，革蘭氏陰性菌杆狀菌。可 產生紅色或紫色色素。是一類普遍存在於自然界的浮生小桿菌，可從土壤、水，牛奶、面 包中分離出來，室內飼養的昆蟲易於感染該菌。目前已報導從健康的，死的昆蟲都可分 離出粘質沙雷氏菌，該菌可侵染昆蟲6個目（直翅目，鞘翅目，膜翅目，鱗翅目和雙翅目 等）之多，是室內飼養昆蟲最易感染的一種病原菌之一。小量的消化道感染通常不會造 成昆蟲發病，但一旦進入血淋巴在1-3天之內大量繁殖即可造成昆蟲死亡（Sikorowski， 2001)。該菌引起昆蟲致死率受到昆蟲的種類、昆蟲發育的齡期以及其他環境因素等的影 響（Steinhaysl958)。粘質沙雷氏菌殺蟲的機制包括其分泌的蛋白酶、脂酶、幾丁質酶以 及依賴於脂多糖和鞭毛誘導的寄主免疫細胞的程序性死亡等（Lysenko, 1976 ;Kaska，et all976;Hines et al，1988;Givskov et all997;Ishii et al，2012)。目前尚無從水稻害 蟲中分離出粘質沙雷氏菌以及對水稻害蟲褐飛蝨和二化螟具有致病作用的病原性細菌資 源的分離和致病機制的研究報導。 (三）
【發明內容】

[0007] 本發明目的是從水稻褐飛蝨中分離出致病細菌，研究其致病性，為細菌殺蟲劑的 研究開發提供了新的菌株來源。
[0008] 本發明採用的技術方案是：
[0009] 本發明提供一株新菌株一粘質沙雷氏菌（Serratia marcescens)N1M280,保藏於 中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 9131，保藏日期為 2014年5月8日，保藏地址為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究 所，郵編100101。
[0010] 本發明還提供一種所述粘質沙雷氏菌N1M280作為殺蟲劑的應用。
[0011] 進一步，所述粘質沙雷氏菌N1M280以發酵培養獲得的菌懸液或菌懸液離心後的 上清液作為殺蟲劑，優選菌體密度為lXl〇8CFU/mL的菌懸液。
[0012] 進一步，所述粘質沙雷氏菌N1M280作為褐飛蝨或二化螟殺蟲劑的應用。
[0013] 更進一步，粘質沙雷氏菌N1M280菌懸液按如下步驟製備：
[0014] (1)斜面培養：將粘質沙雷氏菌N1M280接種至LB固體培養基上，28°C恆溫24h，獲 得斜面菌體；LB固體培養基終濃度組成：NaC110g/L、酵母提取物5g/L、蛋白腖10g/L、15g/L 瓊脂，pH7. 2,溶劑為水；
[0015] ⑵種子培養：從斜面菌體挑取單菌落接種於LB液體培養基，28°C恆溫，200rpm振 蕩培養24h，獲得種子液；LB液體培養基終濃度組成：NaC110g/L、酵母提取物5g/L、蛋白腖 10g/L，pH7. 2,溶劑為水；
[0016] (3)發酵培養：取種子液以體積濃度1 %的接種量接種於LB液體培養基中擴大 培養，28°C恆溫，200rpm振蕩培養至0D600值為1. 0,獲得發酵培養液，將發酵培養液用LB 液體培養基調整菌體密度製成菌懸液（優選菌體密度為lXl〇8CFU/mL)。將菌懸液4°C， 12000rpm離心10min，去菌體，取上清液即為胞外代謝物的發酵上清液。
[0017] 利用所述菌懸液或發酵上清液注射3-4齡褐飛蝨，2天致死率達97%以上，利用含 該菌懸液的全純人工飼料飼餵3-4齡褐飛蝨，3天死亡率達79%以上，用含發酵上清液的全 純人工飼料飼餵3-4齡褐飛蝨，6天死亡率達84%以上。用噴施過菌懸液或發酵上清液的 水稻葉片飼餵二化螟，4天死亡率達80%以上。
[0018] 與現有技術相比，本發明的有益效果主要體現在：本發明提供一株新菌株--粘質 沙雷氏菌N1M280,該菌株發酵培養獲得的菌懸液或菌懸液離心後的上清液可應用於褐飛 蝨或二化螟的防治；對褐飛蝨採用注射和飼餵該菌菌懸液或發酵上清液的結果表明，其菌 懸液注射對褐飛蝨的致死率2天可達100%，飼餵菌懸液3天致死率為79. 8%。該菌株發 酵液的上清液在55°C以下處理均不影響其致病效果，注射發酵上清液致死率2天時可達 97. 2 %，飼餵發酵上清液效果滯後，6天時致死率達84. 2 %。菌懸液和發酵上清液噴施水稻 後飼餵二化螟，對二化螟的致死率4天時可達80. 0%以上。該菌株的分離開拓了抗蟲微生 物資源，為進一步抗蟲物質的分離鑑定提供了材料，在生產實踐中具有潛在的應用價值。 (四）

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019] 圖1為菌株N1M280在LB平板上的生長情況。
[0020] 圖2為菌株N1M280的16S rDNA序列PCR擴增電泳圖，泳道1-5分別為挑取的5 個單菌落16S rDNA擴增的結果，泳道Μ為Marker 100bp DNA ladder。
[0021] 圖3為菌株N1M280與其他腸桿菌科細菌16S rDNA序列系統發育樹。
[0022] 圖4為褐飛風微量注射位置示意圖（箭頭所示）。
[0023] 圖5為實施例3中褐飛蝨感染粘質沙雷氏菌菌株N1M280 (注射菌懸液）後的發病 症狀。其中A為超景深顯微鏡放大100倍的照片，B為普通照相機拍攝。
[0024] 圖6為注射和飼餵N1M280菌懸液（1 X 108CFU/mL)對褐飛蝨致病性柱形圖。
[0025] 圖7為N1M280發酵上清液不同溫度處理後注射褐飛蝨，褐飛蝨發病率柱形圖，CK 為對照。
[0026] 圖8為注射和飼餵菌株N1M280發酵液上清液對褐飛蝨致病性柱形圖。
[0027] 圖9為N1M280菌懸液和發酵上清液對二化螟的致病性柱形圖，CK為對照。 (五）

【具體實施方式】
[0028] 下面結合具體實施例對本發明進行進一步描述，但本發明的保護範圍並不僅限於 此：
[0029] 實施例1、菌株N1M280的篩選、鑑定和保存
[0030] (1)菌株的篩選
[0031] 將中國水稻研究所富陽實驗室內飼養的褐飛風種群Mudgo的褐飛風自然發病蟲 體（蟲體體色全紅）用體積濃度75%的乙醇水溶液表面消毒5min後，研磨蟲體成粉末， 然後用無菌水進行梯度稀釋（具體稀釋梯度為10倍，100倍，1000倍），取1000倍稀釋度 的稀釋液塗板於LB固體培養基上，28°C培養12h，獲得單菌落，挑取紅色單菌落記為菌株 N1M280。
[0032] (2)菌株的鑑定
[0033] 菌株的生理生化特徵為：
[0034] 將菌株N1M280塗板於LB固體培養基上，28°C恆溫24h活化，菌株N1M280平板生 長見圖1。菌株的菌落基本上是凸起，中心不透明，邊緣不規則，大小為1?2. 5_，均產生 紅色色素。LB固體培養基上37°C?43°C培養，菌株為白色。
[0035] 挑取5個單菌落N1M280分別接種於3mL的LB液體培養基中，28°C、200rpm培養 12h，取培養0D600值為1. 0左右的新鮮菌液，lOOOrpm離心lOmin，收集溼菌體。按褐飛蝨基 因組的提取方法分別提取溼菌體基因組DNA並進行16S rRNA的PCR擴增（參考：王渭霞， 羅舉，賴鳳香，傅強.水稻褐飛蝨內生共生細菌Arsenophonys的鑑定和系統分析.昆 蟲學報，2010,647-654)。？〇?反應條件：941：變性41^11，然後進入下列循環 ：941：308、 55°C 30s、72°C 30s，共進行35個循環，最後72°C延伸lOmin。經1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢 測，得到一條1500bp左右的特異性片段（圖2)，測定該片段序列（PCR產物由上海英俊公 司測序），結果表明，測得菌株N1M280的16S rDNA為1053bp。將測得的16s rDNA全序 列（SEQ ID Ν0· 1 所不）提交 GenBank(www. ncbi. N1M. nlh. gov)，應用其中的 BLAST 軟體和 DNAMAN軟體進行分析，發現，菌株N1M280測得的16S rDNA序列與粘質沙雷氏菌（Serratia marcescens strain RJT)16s rDNA序列相似性達99. 0%。因此初步鑑定菌株N1M280為 粘質沙雷氏菌（Serratia marcescens)。Genbank登陸號為⑶124498。系統發育樹顯示菌 株N1M280與腸桿菌科的粘質沙雷氏菌聚類為同一類（圖3)。結合菌株N1M280的生理生 化特徵及16s rDNA序列分析，將菌株N1M280鑑定為粘質沙雷氏菌，命名為粘質沙雷氏菌 (Serratia marcescens)NlM280〇
[0036] (3)菌株的保藏
[0037] 菌株保藏：將粘質沙雷氏菌N1M280接種至LB液體培養基中，28°C、200rpm培養 12h，取菌懸液與質量濃度50%的甘油水溶液等體積混合後，-80°C保存。
[0038] LB固體培養基終濃度組成：NaC110g/L、酵母提取物5g/L、蛋白腖10g/L、15g/L瓊 月旨，pH7. 2,溶劑為水。
[0039] LB液體培養基終濃度組成：NaC110g/L、酵母提取物5g/L、蛋白腖10g/L，pH7. 2,溶 劑為水。
[0040] 實施例2、菌懸液的製備
[0041] (1)斜面培養
[0042] 將粘質沙雷氏菌N1M280接種至LB固體培養基上，28°C恆溫24h，獲得斜面菌體。
[0043] (2)種子培養：從斜面菌體挑取單菌落接種於3mL LB液體培養基，28°C恆溫， 200rpm振蕩培養24h，獲得種子液。
[0044] (3)發酵培養：取500 μ L種子液接種於50mL LB液體培養基中擴大培養，28°C恆 溫，200rpm振蕩培養8h，測定菌體0D600值到1. 0時，獲得發酵培養液，將發酵培養液用LB 培養基調整菌體密度為1 X 108CFU/mL，製成菌懸液。
[0045] 實施例3 :粘質沙雷氏菌N1M280的菌懸液對褐飛蝨的致病性
[0046] (1)、注射法檢測菌株的致病力：
[0047] 選取3-4齡褐飛風若蟲，利用eppendorf顯微注射儀（型號TransferMan NK2,廠 家上海艾本德公司），每個褐飛蝨注射〇. 1 μ L實施例2方法製備的菌懸液，注射位置為褐飛 蝨胸部中足基部柔軟的地方，見圖4,以注射LB液體培養基為對照，注射後褐飛蝨接種於分 櫱盛期的水稻品種（Taichung Nativel)TNl上，每個水稻單株用籠罩罩住，每個籠罩接50 頭注射後的褐飛蝨。三次重複。將籠罩放置於帶水的大水盆中，控制室內溫度在25±1°C， 溼度80%左右。24h內剔除因注射操作造成的死蟲，記錄活蟲數，48h統計褐飛蝨死亡率。 褐飛蝨病蟲症狀（褐飛蝨通體發紅）見圖5所示，死亡率見圖6所示。結果表明菌懸液注 射褐飛蝨2天死亡率達100 %。
[0048] (2)、飼餵法檢測菌株對褐飛蝨的致病力：
[0049] 選取3-4齡褐飛蝨若蟲，在褐飛蝨全純人工飼料（成分見表1，參見：Fu Q，Zhang Z T, Hu C, Lai F X, Sun Z X. A Chemically defined diet enables continous rearing of the brown planthopper, Nilaparvata lugens. (Homoptera ：Delphacidae). Appl Entomol Zool，2001，36(1) :111-116)中加入終濃度為IX 108Cf μ/ml的菌懸液（實施例2方法制 備）。用15cmX 2. 5cm的雙通管作為人工飼養褐飛風的器皿。60. 0 μ L人工飼料放在兩端 均有開口的雙通管中，一端用兩層封口膜封口（靠近飼料），另一端用尼龍網封口，在將測 試的50頭褐飛蝨放入後用尼龍網封口。雙通管用潮溼的毛巾包裹起來保溼，有飼料的一頭 對著光源。飼養環境條件27. 0±0. 5°C，90. 0%溼度，12-14小時的光照。24h換飼料一次， 並統計活蟲數。結果見圖6,表明飼餵3天死亡率達到79. 8%。
[0050] 表1全純人工飼料成分
[0051]
[0052]

【權利要求】
1. 粘質沙雷氏菌（Serratia marcescens)NlM280,保藏於中國微生物菌種保藏管理委 員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC No. 9131，保藏日期為2014年5月8日，保藏地址 為北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編100101。
2. -種權利要求1所述粘質沙雷氏菌N1M280作為殺蟲劑的應用。
3. 如權利要求2所述的應用，其特徵在於所述粘質沙雷氏菌N1M280以發酵培養獲得的 菌懸液或菌懸液離心後的上清液作為殺蟲劑。
4. 如權利要求3所述的應用，其特徵在於所述菌懸液菌體密度為1 X 108CFU/mL。
5. 如權利要求2所述的應用，其特徵在於所述粘質沙雷氏菌N1M280作為褐飛蝨或二化 螟殺蟲劑的應用。
6. 如權利要求3所述的應用，其特徵在於粘質沙雷氏菌N1M280菌懸液按如下步驟制 備： (1) 斜面培養：將粘質沙雷氏菌N1M280接種至LB固體培養基上，28°C恆溫24h，獲得斜 面菌體；LB固體培養基終濃度組成：NaC110g/L、酵母提取物5g/L、蛋白腖10g/L、15g/L瓊 月旨，pH7. 2,溶劑為水； (2) 種子培養：從斜面菌體挑取單菌落接種於LB液體培養基，28°C恆溫，200rpm振蕩培 養24h，獲得種子液；LB液體培養基終濃度組成：NaC110g/L、酵母提取物5g/L、蛋白腖10g/ L，pH7. 2,溶劑為水； ⑶發酵培養：取種子液以體積濃度1 %的接種量接種於LB液體培養基中，28 °C恆溫， 200rpm振蕩培養至0D600值為1. 0,獲得發酵培養液，將發酵培養液用LB液體培養基調整 菌體密度製成菌懸液。
【文檔編號】C12N1/20GK104109649SQ201410344394
【公開日】2014年10月22日 申請日期:2014年7月18日 優先權日:2014年7月18日
【發明者】王渭霞, 李凱龍, 陳洋, 賴鳳香, 傅強 申請人:中國水稻研究所