富民枳微滴玻璃化法超低溫保存方法
2023-12-04 13:36:01 3
富民枳微滴玻璃化法超低溫保存方法
【專利摘要】本發明提供了富民枳微滴玻璃化超低溫保存方法。包括材料獲取，加載處理，植物玻璃化溶液處理，超低溫保存，解凍和卸載處理，恢復培養步驟。本發明方法簡便易行、穩定性高、高效可靠；超低溫保存莖尖解凍後再生率達到90％以上；超低溫保存莖尖再生的植株生根狀況良好，移栽後生長狀態穩定。
【專利說明】富民枳微滴玻璃化法超低溫保存方法
【技術領域】
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[0001]本發明屬於植物細胞工程學領域。具體涉及富民枳微滴玻璃化法超低溫保存方法。
【背景技術】
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[0002]富民枳為芸香科枳屬植物。芸香科枳屬包括兩種，即枳和富民枳。富民枳於1984年由丁素琴等在雲南富民縣進行柑桔資源調查時發現和描述。富民枳的野生種群基本滅絕。少數富民枳的植株在昆明植物園，富民縣農業局茶桑果站種植園得到遷地保護。另外，在美國 Nat1nal Plant Germplasm System 中收集和保存了兩份(http: // www.ars-grin.Rov/cR1-bin/npRs/html/taxon.pi ? 411341)。富民積是柑橘育種的重要種質資源。一項對富民枳生物學特性的研究表明富民枳在做砧木嫁接柑橘時結果早，株型矮化，是柑橘優良的矮化砧。富民枳在其原生地以果實入藥，被當地人稱為「止咳樹」。在一項專利中提到，富民積的抽提物具有抗氧化和抗炎的作用(http://ip.com/patfam/en/39396292)。富民積除現有的活體植株保存以外，可以通過種子保存而在種質資源庫長期保存。此類植物由於種子表現為頑拗性或者中間性，一般以活體植株的形式在資源圃或植物園保存。富民枳的種子儲藏類型沒有見研究報到。參考其它citrus屬和Poncirus屬植物的情況，富民枳的種子可能也表現為中間性的(intermediate)儲藏類型。因而無法進行脫水和在常規種子庫(15%含水量，-200C )中保存。
[0003]超低溫保存一般是指使用液氮(_196°C )或液氮蒸汽保存生物材料的技術和方法。在液氮溫度下，細胞中所有的生化反應都被暫時停止，從而可以使細胞在理論上進行無限期保存。超低溫保存技術廣泛應用於微生物、動物和植物種質資源的長期保存。超低溫保存是生產非正常性種子的植物和需要以營養體繁殖的農作物長期安全保存的唯一途徑，是珍稀瀕危植物長期保存的重要手段。由於柑橘產業的重要性，對於Citrus屬和Poncirus屬的超低溫保存研究很多。超低溫保存的外植體主要包括胚軸和莖尖。由於富民枳現有植株數量很少，果實和種子數量非常有限。離體莖尖是目前進行富民枳超低溫保存的唯一可行的外植體類型。
[0004]迄今，未見有富民枳微滴玻璃化法超低溫保存方法的報導。
【發明內容】
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[0005]本發明的目的在於提供一種富民枳微滴玻璃化法超低溫保存方法。包括富民枳試管苗的節段培養、離體莖尖的超低溫保存和再生試管苗的生根和移栽技術。本發明為富民枳種質資源的長期安全保存提供了一種簡單、高效和穩定的方法。
[0006]為實現本發明的上述目的，本發明採用如下的技術方案:
[0007]富民枳微滴玻璃化超低溫保存方法，包括下述步驟:
[0008](I)材料獲取，取富民枳莖尖，通過莖尖培養獲得試管苗，然後通過節段培養獲得擴繁富民枳試管苗，在解剖鏡下進行莖尖切割；在解剖鏡下切割莖尖；
[0009](2)加載處理，將莖尖在加載溶液中，25°C下處理20分鐘；
[0010](3)植物微滴玻璃化處理，將莖尖轉入預冷的PVS2溶液，在冰上處理20-40分鐘；
[0011](4)超低溫保存，將經過PVS2處理的莖尖轉移到無菌鋁箔條上並插入液氮，待降溫過程完成後轉入凍存管並進入液氮罐保存；
[0012](5)解凍和卸載處理，將鋁箔條從液氮中移出並直接轉入卸載溶液，在25°C下處理20分鐘；
[0013](6)恢復培養,將解凍後的莖尖轉移到恢復培養基上進行恢復培養。
[0014]如所述的富民枳微滴玻璃化超低溫保存方法，其中所述節段培養是將試管苗節段接種在添加0.Smgr1BA^0.Zmgr1IBA和3(^171蔗糖的WPM培養基上進行擴繁，在以上培養基中富民枳節段在4周內形成試管苗。
[0015]如所述的富民枳微滴玻璃化超低溫保存方法，其中所述莖尖切割是選高度5cm的富民枳試管苗，在體視顯微鏡下切割長度為2mm的莖尖，轉入添加30gL-l蔗糖的WPM培養基上待用。
[0016]如所述的富民枳微滴玻璃化超低溫保存方法，其中所述加載處理和微滴玻璃化是將莖尖轉入凍存管中加入加載溶液，在25°C下處理20分鐘，所述加載溶液的組成為WPM基礎培養基添加2M甘油和0.4M蔗糖，在加載溶液處理結束以後，用冰上預冷的PVS2溶液替換加載溶液，並在冰上處理20-40分鐘，PVS2溶液的組成是WPM基礎培養基添加30% (w/V)甘油、15% (w/v)乙二醇、15% (w/v)DMS0 和 0.4M 鹿糖。
[0017]如所述的富民枳微滴玻璃化超低溫保存方法，其中所述超低溫保存是在PVS2處理結束前I分鐘，將莖尖和一滴PVS2溶液轉到無菌鋁箔條上，在PVS2處理結束後，將鋁箔條直接插入液氮，待不再有氣泡產生時，將鋁箔條轉入放置在液氮中的凍存管，並保持在液氮中30分鐘。
[0018]如所述的富民枳微滴玻璃化超低溫保存方法，其中所述解凍和卸載處理是將鋁箔條從液氮中取出，快速插入卸載溶液裡，在25°C下處理20分鐘，卸載溶液的組成是WPM基礎培養基添加1.2M蔗糖。
[0019]如所述的富民枳微滴玻璃化超低溫保存方法，其中所述恢復培養是將在卸載溶液處理結束後，將莖尖轉入恢復培養基，恢復培養基的組成為WPM基礎培養基添加30gL-l蔗糖、1.0mgIZ1BA和SgIZ1Phytagel,恢復培養的前7天為暗培養。
[0020]與傳統的Citrus屬和Poncirus屬植物玻璃化超低溫保存方法相比,本發明的技術方案中超低溫保存莖尖的存活率和再生率更高，解凍後的莖尖在恢復培養階段生長更為迅速。在保持高再生率的情況下，去掉了傳統方法中必須的預培養階段。本發明方法簡便易行、穩定性高、高效可靠；超低溫保存莖尖解凍後再生率達到90%以上；超低溫保存莖尖再生的植株生根狀況良好，移栽後生長狀態穩定。
【專利附圖】
【附圖說明】
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[0021]圖1PVS2處理時間對超低溫保存富民枳莖尖再生率的影響。
[0022]圖2玻璃化途徑中PVS2處理時間對存活率和再生率的影響。
[0023]圖3富民枳超低溫保存莖尖的再生情況。(al)微滴玻璃化超低溫保存莖尖存活但不再生長(標尺為0.5mm)。(a2-3)微滴玻璃化超低溫保存莖尖再生為試管苗(標尺為0.5mm)。(bl)玻璃化超低溫保存莖尖存活但不再生長(標尺為0.5mm)。(b2_3)
[0024]玻璃化超低溫保存莖尖再生為試管苗(標尺為0.5mm)。
[0025]圖4IBA濃度對富民枳試管苗生根的影響。將長度約3釐米的富民枳試管苗轉入添加添加SOgr1蔗糖、SgL—1活性炭、3g r 1Phytagel和不同濃度IBA的WPM培養基中進行生根誘導，生根培養6周時統計生根率。
[0026]圖5超低溫保存富民枳莖尖再生和移栽情況。a由超低溫保存莖尖重新建立起來的試管苗(標尺為Icm)。b試管苗生根情況(標尺為Icm)。C生根植株移栽後I年(標尺為 2cm)。
【具體實施方式】
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[0027]下面結合附圖，用本發明的實施例來進一步說明本發明的實質性內容，但並不以此來限定本發明。
[0028]實施例1:
[0029]1、試管苗的節段培養。
[0030]取富民枳(Poncirus polyandra)莖尖，通過莖尖培養獲得試管苗，然後將試管苗節段接種在添加0.Smgr1BA^0.2mgr1IBA和3(^171蔗糖的WPM培養基上進行擴繁。在以上培養基中富民枳節段可在4周內形成試管苗。
[0031]2、莖尖切割。
[0032]選取高度約5cm的富民枳試管苗，在體視顯微鏡下切割長度約為2_的莖尖，轉入添加SOgL-1蔗糖的WPM培養基上待用。
[0033]3、微滴玻璃化超低溫保存。
[0034]將10個莖尖轉入凍存管中加入ImL loading solut1n溶液，在25°C下處理20分鐘。Loading solut1n溶液的組成為WPM基礎培養基添加2M甘油和0.4M鹿糖。在loadingsolut1n溶液處理結束以後，用ImL冰上預冷的PVS2溶液替換loading solut1n溶液，並在冰上處理一定的時間。PVS2溶液的組成是WPM基礎培養基添加30% (w/v)甘油、15% (w/V)乙二醇、15% (w/v)DMS0和0.4M蔗糖。在PVS2處理結束前I分鐘，將莖尖和一滴PVS2溶液(15 μ L)轉到一個8 X 25mm的無菌鋁箔條上。在PVS2處理結束後，用一把細鑷子將鋁箔條直接插入液氮，待不再有氣泡產生時，將鋁箔條轉入放置在液氮中的凍存管，並保持在液氮中至少30分鐘。解凍時，將鋁箔條從液氮中取出，並快速插入6釐米直徑培養皿中的10mT, unloading solut1n 溶液裡，並在 25°C下處理 20 分鐘。Unloading solut1n 溶液的組成是WPM基礎培養基添加1.2M蔗糖。在unloading solut1n溶液處理結束後，將莖尖轉入恢復培養基。恢復培養基的組成為WPM基礎培養基添加SOgr1蔗糖、1.0mg^1BA和3gL^ 1Phytagelο恢復培養的前7天為暗培養。
[0035]本發明中，測試了微滴玻璃化途徑中PVS2在(TC分別處理20、30和40分鐘對超低溫保存莖尖的存活率和再生率的影響。結果表明20、30和40分鐘PVS2對應的存活率分別為 88.3%,90.0%和 83.3% (圖1);再生率分別為 75.0%,78.3%和 73.3% (圖1)。可見超低溫保存莖尖在20-40分鐘PVS2處理下都保持了非常高的存活率。
[0036]圖1顯示了 PVS2處理時間對超低溫保存富民枳莖尖再生率的影響。莖尖切割後在WPM半固體培養基上過夜。將裝載處理後的莖尖轉入PVS2在冰上處理一定的時間，PVS2處理結束後將莖尖轉入鋁箔條進行液氮處理，解凍時直接將鋁箔天轉入卸載溶液進行處理。
[0037]4、微滴玻璃化法和玻璃化法的比較。
[0038]玻璃化法的處理程序如下所述。將10個莖尖轉入凍存管中加入ImL loadingsolut1n溶液，在25°C下處理20分鐘。Loading solut1n溶液的組成為WPM基礎培養基添加2M甘油和0.4M蔗糖。在loading solut1n溶液處理結束以後，用ImL冰上預冷的PVS2溶液替換loading solut1n溶液，並在冰上處理30分鐘。PVS2溶液的組成是WPM基礎培養基添加30% (w/v)甘油、15% (w/v)乙二醇、15% (w/v)DMSO和(λ 4M蔗糖。在PVS2處理結束後，將凍存管直接插入液氮保存。解凍時，將凍存管從液氮中取出，在40°C水浴中解凍2分鐘。解凍完成後，用移液槍移掉凍存管中的PVS2並加入ImL unloading solut1n溶液，並在25°C下處理20分鐘。Unloading solut1n溶液的組成是WPM基礎培養基添加1.2M蔗糖。在unloading solut1n溶液處理結束後，將莖尖轉入恢復培養基。恢復培養基的組成為WPM基礎培養基添加SOgL-1蔗糖、1.0mgL-1BA和3gL_ 1Phytagel。恢復培養的前7天為暗培養。
[0039]本發明測試了玻璃化途徑(vitrificaitonusing Cryotubes)中 PVS2 在 0°C分別處理20、30和40分鐘對超低溫保存莖尖的存活率和再生率的影響。結果表明20、30和40分鐘？￥52對應的存活率分別為91.7%、96%和91.7% (圖2);再生率分別為50.0%、54.0%和50.0% (圖2)。在玻璃化超低溫保存中，PVS2處理時間在20-40分鐘之間時莖尖的存活率都高於90%，且相互之間沒有顯著差異。莖尖的再生率在20-40分鐘之間也沒有顯著差異，但都顯著性的低於存活率。可見在玻璃化超低溫保存中，有接近50%的莖尖能夠存活下來，但不能再生為試管苗。這一結果與微滴玻璃化的結果差異較大。
[0040]圖2顯示了玻璃化途徑中PVS2處理時間對存活率和再生率的影響的。莖尖切割後在WPM半固體培養基上過夜。對滲透保護後的莖尖轉入PVS2在O °C下處理30分鐘。PVS2
[0041]處理結束後，莖尖分別按照玻璃化程序進行液氮處理和解凍。
[0042]5、富民枳超低溫保存莖尖存活和再生情況
[0043]液氮處理以後，存活的莖尖表現為頂端分生組織存活和生長；莖尖其他部分細胞死亡並變為白色(圖3)。莖尖存活以恢復培養6周時莖尖表現綠色為標誌。莖尖再生以恢復培養6周時莖尖表現明顯伸長為標誌。微滴玻璃化和玻璃化超低溫保存的莖尖都有存活但不再生長的情況(圖3al，bl)。超低溫保存莖尖再生的植株經過繼代培養可以重新建立試管苗培養體系(圖5a)。
[0044]6、富民枳試管苗生根情況。
[0045]從繼代4周的試管苗中選取生長良好,長度約3釐米的試管苗(in vitro shoots)用於生根實驗。將其基部用手術刀切割，保持切面整齊；轉入不同的培養基中進行生根實驗。每個組培瓶中添加50mL生根培養基，轉入2株試管苗。生根培養基:1.添加3(^171蔗糖、SgL—1活性炭和3gL^ 1Phytagel的WPM培養基。2.添加3(^171蔗糖、SgL—1活性炭、
0.SmgL4 IBA 和 SgIZ1Phytagel 的 WPM 培養基。3.添加 3(^171 鹿糖、3gL-1 活性炭、5.0mgL4IBA和 3gL 1Phytagel 的 WPM 培養基。
[0046]不同濃度IBA的生根培養基對試管苗生根的影響。所有的生根培養基都添加了活性炭。在不添加IBA的基礎培養基中，大約7.5%的試管苗生根(圖4)。當在生根培養基中添加了 2.46 μ M IBA時，生根率上升到了 15%。而當IBA濃度進一步提高到24.6 μ M時，生根率進一步提高到了 37.5% (圖4)。試管苗在通常情況下產生1-2條根(圖5b)，隨在生根培養基的時間推移，生根率逐漸增高。生根植株在高度約為1cm可以移栽入溫室環境，移栽成功率接近100%。移栽入溫室的植株生長正常，旺盛(圖5c)。
【權利要求】
1.富民枳微滴玻璃化超低溫保存方法，包括下述步驟: (1)材料獲取:取富民枳莖尖，通過莖尖培養獲得試管苗，然後通過節段培養獲得擴繁的富民枳試管苗，在解剖鏡下進行莖尖切割； (2)加載處理:將莖尖在加載溶液中，25°C下處理20分鐘； (3)微滴玻璃化處理:將步驟(2)處理後的莖尖轉入預冷的PVS2溶液，在冰上處理20-40分鐘； (4)超低溫保存:將經過PVS2處理的莖尖轉移到無菌鋁箔條上並插入液氮，待降溫過程完成後轉入凍存管並進入液氮罐保存； (5)解凍和卸載處理:將鋁箔條從液氮中移出並直接轉入卸載溶液，在25°C下處理20分鐘； (6)恢復培養:將解凍後的莖尖轉移到恢復培養基上進行恢復培養。
2.如權利要求1所述的富民枳微滴玻璃化超低溫保存方法，其特徵在於所述步驟(1)中的節段培養是將試管苗節段接種在添加0.SmgL^BA.0.2mgr1IBA和3(^171蔗糖的WPM培養基上進行擴繁。
3.如權利要求1所述的富民枳微滴玻璃化超低溫保存方法，其特徵在於所述步驟(1)中的莖尖切割是選高度5cm的富民枳試管苗，在體視顯微鏡下切割長度為2mm的莖尖，轉入到添加3(^171蔗糖的WPM培養基上待用。
4.如權利要求1所述的富民枳微滴玻璃化超低溫保存方法，其特徵在於所述步驟(2)和(3)中的加載處理和微滴玻璃化是將莖尖轉入凍存管中加入加載溶液，在25°C下處理20分鐘，所述加載溶液的組成為WPM基礎培養基添加2M甘油和0.4M蔗糖，在加載溶液處理結束以後，用冰上預冷的PVS2溶液替換加載溶液，並在冰上處理20-40分鐘，PVS2溶液的組成是WPM基礎培養基添加30% (w/v)甘油、15% (w/v)乙二醇、15% (w/v)DMS0和0.4M蔗糖。
5.如權利要求1所述的富民枳微滴玻璃化超低溫保存方法，其特徵在於所述步驟(4)的超低溫保存是在步驟(3)的PVS2處理結束前1分鐘，將莖尖和一滴PVS2溶液轉到無菌鋁箔條上，在PVS2處理結束後，將鋁箔條直接插入液氮，待不再有氣泡產生時，將鋁箔條轉入放置在液氮中的凍存管，並保持在液氮中30分鐘。
6.如權利要求1所述的富民枳微滴玻璃化超低溫保存方法，其特徵在於所述步驟(5)的解凍和卸載處理是將鋁箔條從液氮中取出，快速插入卸載溶液裡，在25°C下處理20分鐘，卸載溶液的組成是WPM基礎培養基添加1.2M蔗糖。
7.如權利要求1所述的富民枳微滴玻璃化超低溫保存方法，其特徵在於所述步驟(6)的恢復培養是將卸載處理結束後，將莖尖轉入恢復培養基，恢復培養基的組成為WPM基礎培養基添加SOgI/1鹿糖、1.0mgL_1BA和SgL—Phytagel,恢復培養的前7天為暗培養。
【文檔編號】A01N3/00GK104336009SQ201410628073
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2014年11月10日 優先權日:2014年11月10日
【發明者】李唯奇, 林亮, 馬俊超 申請人:中國科學院昆明植物研究所