用於微滴標記的系統和方法與流程

2023-12-05 10:37:16 2

本申請要求Bernstein等於2014年4月17日提交的標題為「Systems and Methods for Droplet Tagging」的美國臨時專利申請系列號61/981,123的權益，此專利申請通過引用併入本文。

政府資金

本發明是在由國立衛生研究院授予的基金號P01GM096971以及由國家科學基金會授予的基金號DMR-1006546和DMR-0820484下於政府支持下作出的。政府對本發明具有一定的權利。

領域

本發明總的來說涉及微流體裝置，包括用於在這樣的裝置內標記微滴的系統和方法。

背景

存在用於在微流體系統內產生流體性微滴的各種技術，諸如在專利公開號WO 2004/091763、WO 2004/002627、WO 2006/096571、WO 2005/021151、WO 2010/033200和WO 2011/056546(其各自通過引用整體併入本文)中公開的那些技術。在一些情況下，可以產生相對大量的微滴，並且通常以相對高的速度，例如，可以以每秒至少約10個微滴的速率產生微滴。微滴中還可在其中含有多種物質。然而，可能難以精確地跟蹤這樣的微滴，特別是當產生大量微滴和/或以非常高的速率產生微滴時。另外，如果微滴暴露於各種不同的條件，包含不同的種類等，以使得微滴不是全部相同的，則這樣的跟蹤可能是複雜的。

概述

本發明總的來說涉及微流體裝置，包括用於在這樣的裝置內標記微滴的系統和方法。在一些情況下，本發明的主題涉及相關產品，對特定問題的替代解決方案和/或一個或多個系統和/或物品的多個不同用途。

在一個方面，本發明總體上涉及一種方法。根據一組實施方案，方法包括將微滴暴露於第一條件並向微滴添加第一核酸的，其中第一核酸編碼第一條件，將微滴暴露於第二條件並將第二核酸添加至微滴，其中第二核酸編碼第二條件，以及將第一核酸和第二核酸連接在一起。

根據另一組實施方案，該方法包括以下行為：將包含在微滴內的細胞暴露於第一物質種類，並向所述微滴添加第一核酸，將所述細胞暴露於第二物質種類，並向所述微滴添加第二核酸，將所述第一核酸和所述第二核酸連接在一起，測定所述細胞的性質，和基於所述細胞的性質分選所述微滴。

另一組實施方案總體上涉及包括以下行為的方法：將多種細胞類型和多種核酸包封在多個微滴中，以使得基本上每個微滴包含僅一種細胞類型的一個或多個細胞和編碼僅一種細胞類型的編碼核酸。

在一組實施方案中，該方法包括以下行為：在多個微滴中提供多種細胞類型和多種核酸，以使得基本上每個微滴包含僅一種細胞類型的一個或多個細胞和編碼僅一種細胞類型的編碼核酸，裂解微滴內的細胞以從所述細胞釋放細胞核酸，將所述編碼核酸和所述細胞核酸連接在一起，和對連接的核酸進行測序。

在另一組實施方案中，該方法包括以下行為：在多個微滴中提供多種細胞類型和多種核酸，以使得基本上每個微滴包含僅一種細胞類型的一個或多個細胞和編碼僅一種細胞類型的編碼核酸；將所述多個微滴暴露於多種物質種類，以使得基本上每個微滴暴露於所述多種物質種類中的單一物質種類，並向其中添加編碼所述單一物質種類的第一核酸；裂解微滴內的細胞以從所述細胞釋放細胞核酸；將編碼核酸、第一核酸和細胞核酸連接在一起；和對連接的核酸進行測序。

在另一方面，本發明總體上涉及多個微滴。在一些情況下，至少一些所述微滴含有編碼所述至少一些微滴暴露於的多個條件的核酸。

根據另一方面，本發明總體上涉及包含多種細胞類型和多種核酸的微滴的文庫。在一些實施方案中，基本上每種細胞類型由獨特的核酸序列編碼。

在另一方面，本發明包括製備本文所述的一個或多個實施方案的方法。在另一方面，本發明包括使用本文所述的一個或多個實施方案的方法。

當結合附圖考慮時，根據本發明的各種非限制性實施方案的以下詳細描述，本發明的其它優勢和新穎特徵將變得明顯。在其中本說明書和通過引用併入的文件包括衝突和/或不一致的公開內容的情況下，以本說明書為準。如果通過引用併入的兩個或更多個文件包括彼此相衝突和/或不一致的公開內容，則應以具有較晚生效日期的文件為準。

附圖概述

將參考附圖通過示例的方式來描述本發明的非限制性實施方案，附圖是示意性的並且不旨在按比例繪製。在圖中，所示的每個相同或幾乎相同的部件通常由單個數字表示。為了清楚起見，當示出對於本領域普通技術人員理解本發明不是必需的時，並非每個部件都在每個圖中標出，並且並非本發明的每個實施方案的每個部件被示出。在附圖中：

圖1A-1C示意性地舉例說明根據本發明的各種實施方案的用於標記微滴的各種方法；和

圖2A-2B示意性地舉例說明在本發明的某些實施方案中將各種核酸標籤連接在一起。

詳述

本發明總的來說涉及微流體裝置，包括用於在這樣的裝置內標記微滴的系統和方法。在一些方面，通過將微滴(或其它實體)暴露於多種不同條件來操作微滴。通過將多個「標籤」例如核酸標籤摻入微滴中並將標籤連接在一起，可編碼微滴所暴露於的條件。因此，即使將暴露於不同條件的微滴混合在一起，每個微滴遇到的條件仍然可以例如通過對核酸測序來確定。

最初，參考圖1討論某些非限制性實例。然而，在其它實施方案中，也可以使用其它配置。首先轉到圖1A，顯示了暴露於各種條件(例如，物質種類諸如藥物)的微滴，並且每次將微滴暴露於條件時，向微滴添加編碼該條件的核酸。應當注意，條件不必是添加化學物質種類，而是還可以是物理條件，諸如對特定溫度的暴露。還應當注意，儘管參考圖1討論了微滴，但這只是為了方便說明；在其它實施方案中，可使用其它離散實體來代替這些微滴，例如微孔板中的微孔。

如此實例中所示，微滴10首先遇到包含物質種類X和核酸1的微滴12，並與其融合。隨後，微滴10遇到微滴13(含有物質種類Y和核酸2)和微滴14(含有物質種類Z和核酸3)並與它們融合。然後可以以某種方式將酶E引入微滴10中，例如，作為另一微滴融合事件的一部分(如此處利用微滴15所示的)，或酶可以最初存在於微滴10、12、13或14的任一個中。酶可用於將核酸1、2和3連接在一起，如對於連接的核酸1-2-3所示的。然後微滴可以被破裂以獲取連接的核酸，並且可對核酸進行測序或以其它方式測定以確定微滴10的來歷。

在一些實施方案中，可以以這樣的方式處理兩個或更多個微滴，如圖1B中所示的。例如，可將兩個或更多個微滴暴露於各種不同的條件，其中每次將微滴暴露於條件時，將編碼該條件的核酸添加至微滴。然而，即使如在容器20中所示的，稍後將具有不同來歷的這樣的微滴組合(諸如，在混合物中)，每個微滴所暴露於的條件仍然可通過包含在每個微滴中的不同核酸來確定。即使微滴本身破裂和/或內容物被混合在一起，這也是真實的。例如，如圖1B所示，通過測定核酸1-2-3、4-5-6和7-8-9，可以知道容器20中的至少一個微滴暴露於條件A、B和C，至少一個微滴暴露於條件I、J和K，並且至少一個微滴暴露於條件X、Y和Z。另外，還可以能夠容器20中沒有微滴暴露於其它條件組。例如，可以能夠確定沒有微滴暴露於條件X、Y和K，因為在容器20中不存在序列1-2-9。

如圖1C所示，在本發明的某些實施方案中，還可發生微滴的測試和/或分選。如該圖所示，暴露於不同條件(如由其中包含的核酸編碼，由各種數字表示的)的多個微滴可以基於一些標準進行分選。例如，如果微滴還含有細胞，則可使用細胞的性質(例如，細胞是活的還是死的)將微滴分選成2個(或更多個)群體。然後可以諸如通過測定其中包含的核酸來單獨分析每個群體，以確定哪些條件可能導致不同的群體。例如，在圖1C中，可將微滴30的群體分選為第一組(A)和第二組(B)。然後可對每組中的核酸測序。因此，例如，可以確定組A的成員各自具有共同的條件2和3，而組B的成員沒有共同的條件2和3(儘管條件2或3可以單獨存在於一些B組微滴中)。因此，這些分選實驗會證明條件2和3的組合對於發生某些效應是必要的(組A)，並且如果兩者不存在，則不發生效應(組B)。

還值得注意的是，在圖1C中，每個微滴所暴露於的條件的數量不一定相同；相反，條件可以變化，即有意地或由於實驗誤差或不確定性。例如，將微滴2-4暴露於條件2和4，而將微滴1-2-3-6暴露於條件1、2、3和6。此外，還應注意，由於在從微滴中除去核酸之前核酸的連接，即使微滴和/或核酸隨後混合在一起，也可以單獨保持和分析每個微滴暴露於的條件。因此，參考圖1C，如果核酸未連接在一起，則組A和B中的每一個會看起來是相同的，因為在此舉例說明性實例中每個組以完全相同的比例含有相同的數字(代表條件)。

因此，本發明的某些實施方案的一個令人驚奇的特徵是連接的核酸允許容易確定更複雜的條件，例如單個條件或多個條件。這可以在不損失信息的情況下實現，即使微滴破裂或以其它方式組合在一起(例如為了便於處理或分析)。相比之下，在將各種標籤單獨引入微滴中的技術中，在沒有將標籤組合在一起的連接或其它方法的情況下，不能如此容易地分析條件；相反，必須小心地使每個微滴保持分離，因為意外組合(例如通過破裂或將不同微滴融合在一起)的任何標籤將導致信息的丟失。

上述討論不旨在是限制性的；本發明的其它實施方案也可以用於標記微滴，如現在將討論的。例如，本發明的各個方面總的來說涉及用於在微流體裝置內標記或鑑定微滴的系統和方法，例如使用可結合在一起的核酸和其它「標籤」。通過將標籤結合在一起，可以保留關於包含標籤的微滴的信息，例如即使在標籤與微滴分離和/或與其它不同的標籤組合之後。因此，例如，可將來自不同微滴(例如，暴露於不同條件)的多個標籤組合在一起並一起分析。

本發明的某些方面涉及多個微滴或其它離散實體(例如，其中實體的內容物不容易與其它實體的內容物混合)的用途。例如，離散實體可以是包含在載流體內的微滴、微孔板的微孔、載玻片或其它表面上的個體斑點等。如本文所討論的，每個實體可以是可含有一個或多個標籤或其它物質種類而不與其它實體意外混合的特定位置。在一些情況下，實體可以是相對小的，例如，每個實體可具有小於約1ml，小於約300微升，小於約100微升，小於約30微升，小於約10微升，小於約3微升，小於約1微升，小於約500nl，小於約300nl，小於約100nl，小於約50nl，小於約30nl或小於約10nl的體積。

在一些實施方案中，微滴或其它實體可以含有各種物質種類，例如細胞、化學物質等。本文討論了物質種類的其它實例。例如，如果微滴或其它實體包含一個或多個細胞，則細胞可以是基本相同或不同的。例如，微滴或其它實體可包含不止一個細胞或其它物質種類，其中細胞(或其它物質種類)是相同的或不同的；不同微滴或實體中的細胞(或其它物質種類)也可以是相同或不同的。如果使用細胞，在一些實施方案中，細胞還可來自特定細胞群，諸如來自某一器官或組織(例如，心臟細胞、免疫細胞、肌肉細胞、癌細胞等)，來自特定個體或物種的細胞(例如，人細胞、小鼠細胞、細菌等)，來自不同生物體的細胞，來自天然存在的樣品(例如，池塘水，土壤等)的細胞等。

因此，作為非限制性實例，可以研究一種或多種條件對特定類型的細胞(或多種特定類型的細胞)的影響。作為另一個實例，可研究某一特定條件(或多個條件)對合適的細胞群的影響。另外，應當注意，本發明不限於僅研究細胞。在其它實施方案中，例如，微滴或其它實體可包含其中待應用各種條件的物質種類。例如，物質種類可以是化學試劑，例如為生物或非生物、有機或無機等的化學試劑。例如，物質種類可以是聚合物、核酸、蛋白質、藥物、小分子化合物(例如，具有小於約1000Da或小於約2000Da的分子量)、抗體、酶、肽等。物質種類的其它實例在下面更詳細地討論。

一個或多個標籤可存在於微滴(或其它實體)內，其可被分析以確定微滴的身份和/或來歷。在一些情況下，標籤可被選擇為相對於微滴或其它實體的其它組分是相對惰性的。標籤可最初存在於微滴或其它實體中，和/或隨後例如使用如下文所述的方法添加。例如，當將微滴或其它實體暴露於一種或多種條件(或即將進行這樣的暴露)時，可以添加標籤。在一些情況下，在微滴或其它實體中可以存在不止一種標籤。

在本發明的某些實施方案中，可將微滴或其它實體內的標籤連接在一起(例如化學地)，以產生連接的標籤。可使用任何合適的技術例如在從微滴或實體移除之前將標籤連接在一起。標籤可使用任何合適的技術連接。諸如，標籤可以使用酶、催化劑或反應物(其可以使用任何合適的技術來添加至微滴或其它實體中)連接在一起。例如，可將包含標籤的微滴與包含化學劑的另一個微滴融合，或者可以例如使用移液或其它技術以及在一些情況下使用自動化技術將化學反應物添加或插入至微滴或其它實體中。

通過將微滴(或其它實體)中的標籤連接在一起以產生連接的標籤，可通過保持連接的標籤來維持微滴的身份和/或來歷，即使標籤與微滴分離或來自不同微滴的標籤混合在一起。例如，可將來自各種微滴或實體的連接的標籤收集在一起並進行分析。在一些實施方案中，取決於各種性質，可將一系列微滴或其它實體分離成各種組，並且可將每組內的標籤一起操作和/或用於鑑定具有這樣的性質的這樣的微滴或實體。

標籤可以包括例如核酸，其可以使用能夠將核酸連接在一起的合適的酶例如連接酶連接或結合在一起。連接酶的非限制性實例包括DNA連接酶，諸如DNA連接酶I、DNA連接酶II、DNA連接酶III、DNA連接酶IV、T4DNA連接酶、T7DNA連接酶、T3DNA連接酶、大腸桿菌DNA連接酶、Taq DNA連接酶等。許多這樣的連接酶可以商購獲得。此外，在一些實施方案中，可使用退火或引物延伸法將兩個或更多個核酸連接在一起。

如本文所討論的，根據某些實施方案，核酸的各種序列可以用於編碼微滴或其它實體可暴露於的特定條件，並且可向其中添加這樣的核酸以指示對條件的這樣的暴露。在一些情況下，可將微滴或其它實體內的核酸在移除(諸如，在微滴破裂後、在洗滌載玻片後等)之前連接在一起。可將來自不同微滴或實體的不同核酸混合在一起；然而，即使在這樣的混合之後，可單獨對每個核酸測序以確定相應的微滴或實體已暴露於的特定條件。

任何合適的系統可以用於編碼。例如，在一組實施方案中，核酸標籤可以包括核苷酸的編碼區，和任選地連接區。編碼區中的核苷酸可以對應於特定條件(或條件組)。任何合適數量的條件可以以這樣的方式被任意編碼，其中可由這樣的編碼區編碼的條件的數量可由編碼區中的核苷酸的數量確定。因此，例如，具有長度n的編碼區可以編碼多達4n個區域(基於四種類型的核苷酸)。例如，第一條件可以用A編碼，第二條件可以用T編碼(或如果核酸是RNA，用U編碼)，第三條件可以用G編碼，第四條件可以用C編碼，等。作為更複雜的實例，含有3個核苷酸的編碼區足以編碼超過50種不同條件(因為43＝64)。可以使用一個或不止一個編碼區。另外，在某些實施方案中，編碼區還可包括用於錯誤檢測和/或校正、冗餘等的其它核苷酸。

在一些情況下，核酸標籤還可包括一個或多個連接在一起的連接區域。例如，連接區可包括核酸的「粘性末端」或懸突，以使得只有特定的核酸可以適當地連接在一起。例如，如圖2A所示，第一核酸標籤21(編碼第一條件)可包括與第二核酸標籤22上的粘性末端基本上互補但不與第三核酸標籤23上的粘性末端基本互補的第一粘性末端；類似地，第二核酸22(編碼第二條件)可包括與第三核酸標籤23(編碼第三條件)上的粘性末端基本上互補但不與第一核酸21上的粘性末端基本上互補的粘性末端。因此，在暴露於合適的連接酶時，第一、第二和第三核酸可以以適於後續研究的順序結合或連接在一起，而不存在以不正確的順序(例如，第一核酸連接至另一第一核酸)錯誤地連接在一起的核酸。因此，通過對最終連接的核酸進行測序，可以確定該核酸處於暴露於第一、第二和第三條件的微滴或其它實體中。

然而，應當理解，在其它實施方案中，可能不需要確保核酸標籤以某一構型或順序連接在一起。諸如，如圖2B所示，核酸21、22和23可以以任何合適的順序連接在一起；並且可以分析所得的連接的核酸以確定核酸編碼由核酸21、22和23編碼的條件。

取決於應用，核酸標籤還可具有任何合適的長度或核苷酸數目。例如，核酸標籤可具有短於或長於10nt、30nt、50nt、100nt、300nt、500nt、1000nt、3000nt、5000nt或10000nt等的長度。在一些情況下，還可將核酸標籤的其它部分用於其它目的，例如除了編碼條件以外。例如，核酸標籤的部分可用於增加核酸標籤的體積(例如，使用特定序列或無義序列)，以便於處理(例如，標籤可包括多聚A尾巴)，以增加結合的選擇性(例如，如下所討論的)，以促進被酶(例如，合適的連接酶)識別，以促進鑑定等。

如上所述，在本發明的某些方面，可使用這樣的標籤編碼一種或多種條件，例如將標籤添加至暴露於這樣的條件的微滴或其它實體。因此，例如，可將微滴暴露於第一條件並將第一標籤添加至微滴，然後可將微滴暴露於第二條件並將第二標籤添加至微滴，然後可將微滴暴露於第三條件並將第三標籤添加至微滴，然後可將微滴暴露於第四條件並將第四標籤添加至微滴，等等。因此，可存在任何數量的條件，例如可將微滴或其它實體暴露於2個、3個、4個、5個、6個、7個、8個、9個、10個或更多個條件。還可將標籤組合在一起(例如，連接在一起)以產生編碼微滴或實體的來歷和/或身份的連接的標籤，如前所述。

任何合適的條件可由標籤編碼。例如，在一組實施方案中，可使用一個或多個標籤來編碼微滴或其它實體的身份。例如，每個微滴或實體可以被分配獨特的標籤或標籤的獨特組合。作為另一個實例，條件可以是微滴或其它實體在內部和/或外部所暴露於的物質種類。多種物質種類中的任一種可由合適的標籤編碼。例如，物質種類可以是藥物(或疑似藥物)、細胞、聚合物、肽、蛋白質、酶、激素、抗生素、維生素、碳水化合物、糖、抗體、試劑、氣體、染料、離子、病毒、細菌、pH水平(例如酸性或鹼性條件)等。因此，例如，可使用獨特的標籤或標籤的獨特組合來編碼多個細胞或多個細胞類型。取決於應用，可使用任何數量的標籤來編碼這樣的條件。例如，可存在至少10種、至少30種、至少50種、至少100種、至少300種、至少500種、至少1,000種、至少3,000種、至少5,000種、至少10,000種、至少30,000種、至少50,000種、至少100,000種或更多種獨特的標籤，例如，其基本上編碼相似數量的合適條件(諸如本文所述的那些條件中的任一個)。例如，作為第一條件，可編碼包含多個細胞或細胞類型的微滴文庫，以使得基本上每個微滴包含一個細胞或一種細胞類型，以及相關聯的標籤，諸如核酸。

另外，在一些情況下，條件還可以是外部物理條件。例如，可將微滴或其它實體暴露於外部物理條件，諸如某一或預定的溫度、壓力、電條件(例如，電流、電壓等)等，並且可在暴露於外部物理條件之前、期間或之後，將合適的標籤引入至微滴或實體中。作為另一個實例，條件可以是處理條件，例如過濾、沉降、離心等。

在一組實施方案中，條件可以是用於裂解可包含在微滴內的細胞的條件。例如，條件可以是暴露於裂解性化學物質(例如，純水、表面活性劑諸如Triton-X或SDS，酶諸如溶菌酶、溶葡萄球菌素、麥芽糖糊精酶、纖維素酶、變溶菌素、聚糖酶、蛋白酶、甘露聚糖酶等)或物理條件(例如，超聲、紫外光、機械攪拌等)。在一些情況下，裂解細胞將導致細胞釋放其內容物，例如細胞核酸、蛋白質、酶、糖等。在一些實施方案中，還可將一些細胞核酸連接至微滴內包含的一個或多個核酸。例如，在一組實施方案中，可釋放通常在細胞內產生的RNA轉錄物，然後將其與核酸標籤連接。

還設想了這些和/或其它條件中的任何一種的組合。例如，如上所述，可將微滴暴露於由第一標籤編碼的第一條件、由第二標籤編碼的第二條件、由第三標籤編碼的第三條件等。條件可以是相同或不同的。另外，可將微滴或其它實體暴露於任何數量的條件(諸如1個、2個、3個、4個、5個、6個等)，並且不同的微滴或實體不需要暴露於相同的條件或者相同數量的條件。另外，在一些實施方案中，可將多個微滴(或其它實體)隨機暴露於多個條件，例如，以使得不是所有的微滴都暴露於所有條件。如上所述，當微滴或其它實體暴露於條件時，可將編碼條件的核酸添加至微滴或實體，以使得微滴或實體的具體來歷不需要預先確定，並且可以被隨機確定。例如，可將多個初始的基本上相同的微滴(或其它實體)暴露於包含不同物質種類(和/或不同濃度的一種或多種物質種類)的多個第二微滴，以使得每個初始微滴隨機地融合至一個或多個第二微滴。

另外，在一些實施方案中，取決於各種性質，可將微滴或其它實體分離或分選至各組中，並且可將每組內的標籤一起操作和/或用於鑑定具有這樣的性質的這樣的微滴或實體。因此，作為非限制性實例，取決於是否在微滴內發生反應，可將微滴(或其它實體)分選至第一組或第二組中，可基於包含在微滴內的細胞或其它物質種類的性質分選液滴，等等。分選還可以發生在兩個或更多個組中。

在一些情況下，可以例如使用其中包含的標籤來分析微滴(或其它實體)的一些或全部組，以測定這些組內的微滴或實體的特性，和/或測定組內的將該組與其它組分開的微滴或實體的特性。例如，組的成員可共同具有將這些組成員與其它組成員分開的一個或多個標籤和/或標籤的一個或多個特定組合，例如，如上文參考圖1C所解釋的。這樣的標籤可用於例如鑑定或區分導致特定結果的一個或多個條件與不導致該結果的條件。

因此，在一組實施方案中，測定微滴或其它實體的性質，並且基於該性質對微滴或其它實體進行分選。該性質還可以是包含在微滴或實體內的物質種類(諸如細胞)的性質。該性質可以是可被測定的任何物理或化學性質。例如，可測定微滴或其它實體(或其中包含的物質種類)的性質，諸如螢光、透明度、密度、尺寸、體積等，並用於分選目的。在一些情況下，還可將一種或多種試劑加入到微滴或其它實體中，例如以起始或促進可被測定的反應，例如用於分選目的。

在一些情況下，微滴或其它實體可被破裂或破壞以獲得標籤。這可在任何合適的時間發生，例如，在將標籤連接或結合在一起之前或之後。例如，可使用技術諸如機械破碎或超聲破壞載流體中包含的微滴。類似地，表面上的實體可以使用暴露於化學試劑或表面活性劑來破壞，或對其進行洗滌或衝洗以收集標籤。

然後可以測定標籤以確定微滴(或其它實體)的身份和/或來歷，例如，以確定微滴或其它實體所暴露於的條件。可使用任何合適的方法來測定標籤，這取決於所使用的標籤的類型。例如，可使用螢光測量來測定螢光顆粒，或者可使用多種技術和儀器對核酸進行測序，其中許多技術和儀器是商業上容易獲得的。這些技術的實例包括但不限於鏈終止測序、通過雜交測序、Maxam-Gilbert測序、染料-終止子測序、鏈終止法、大規模平行籤名測序(Lynx Therapeutics)、polony測序、焦磷酸測序、連接測序、離子半導體測序、DNA納米球測序、單分子實時測序、納米孔測序、微流體Sanger測序、數字RNA測序(「數字RNA-seq」)等。

另外，在一些情況下，一種或多種其它物質種類可以與標籤締合(諸如共價結合或連接至其)。例如，如前所述，在一些情況下，可將由裂解的細胞釋放的核酸連接至一個或多個標籤。這些可以包括例如染色體DNA、RNA轉錄物、tRNA、mRNA、線粒體DNA等。除了對標籤本身進行測序之外，還可對這樣的核酸進行測序，這可產生關於可與標籤締合的細胞的核酸譜或相應的微滴或細胞所暴露於的條件的信息。因此，作為非限制性實例，可將來自細胞的RNA轉錄物連接至一個或多個標籤，可對其進行測序並使其與相應的微滴或細胞所暴露於的條件關聯，以確定信息諸如凋亡基因標誌、生長抑制標誌、免疫標誌、代謝基因集或賦予對其它已知藥劑的敏感性或抗性的基因的表達等。

標籤(諸如本文所述的那些)可以用於多種情形，例如作為高通量篩選技術用於篩選或生物勘探新藥物或其它治療，以研究各種暴露條件對細胞的影響等。另外，應當理解，本發明不僅限於細胞研究。例如，可將包含在微滴內的化學物質暴露於各種不同的條件(例如，潛在的反應物或催化劑、反應條件、引發劑等)和所述不同條件被標記以用於確定或優化所述化學物質能夠參與的反應。在一些情況下，化學物質可以是生物活性化學物質(例如，藥物、蛋白質、聚合物、碳水化合物等)，儘管在其它情況下，化學物質不需要是生物相關的。例如，化學物質可以是單體或聚合物、催化劑、半導體材料等。

作為非限制性實例，在一組實施方案中，可將多個基本相同的細胞任選地在各種物理條件(例如，各種溫度)下暴露於各種物質(例如，其它細胞、化學化合物、土壤樣品、天然存在的樣品等)，以確定任何物質是否對細胞具有有益的或有害的作用。例如，基本上相同的細胞可以是針對一小組物質篩選(以鑑定單獨或組合地具有抗癌或抗腫瘤性質的那些物質)的癌細胞，或基本上相同的細胞可以是免疫細胞或需要其某種活性的其它細胞。該小組可包括例如天然存在的化合物、合成化合物、來自文庫的化合物、共有某些性質的化合物等。在一些情況下，化合物還可以以不止一種濃度存在。可以如本文所討論地標記小組的每個成員，以使得在微滴(或其它實體)中的細胞暴露於小組成員後，添加適當的相應標籤。還可將標籤連接或以其它方式結合在一起。因此，例如，基本上相同的細胞可以暴露於各種組合的各種物質，隨後從死細胞中分選活細胞；可如本文所討論的，對來自含有活細胞(和/或死細胞)的微滴的標籤進行分離和測序，以確定能夠殺死細胞的那些條件或小組成員。另外，本發明不限於僅基本上相同的細胞。例如，在另一組實施方案中，可使用含有不同細胞(或其它物質種類，諸如化學物質)的微滴。

關於用於在微流體系統中操縱液滴的系統和方法的其它細節遵循例如用於測定液滴(或液滴內的物質)、分選液滴等。例如，用於篩選和/或分選液滴的各種系統和方法描述於由Link等人在2006年2月23日提交的題為「Electronic Control of Fluidic Species」的美國專利申請系列號11/360,845，其在2007年1月4日公開為美國專利申請公開號2007/000342，其通過引用將全部內容併入本文。作為非限制性實例，通過施加(或移除)第一電場(或其一部分)，液滴可被引導到第一區域或通道；通過將第二電場施加(或移除)到裝置(或其一部分)，可將液滴引導到第二區域或通道；通過將第三電場施加到裝置(或其一部分)，液滴可以被引導到第三區域或通道；等等，其中電場可以以某種方式不同，例如在強度、方向、頻率、持續時間等方面不同。

在本發明的某些實施方案中，提供傳感器，其可以以允許確定流體液滴的一個或多個特性的方式感測和/或確定流體液滴的一個或多個特性，和/或包含流體液滴的流體系統的一部分(例如，圍繞流體液滴的液體)的特性。本領域普通技術人員可以鑑定可相對於液滴確定並且可用於本發明的特性。這種特徵的非限制性實例包括螢光、光譜學(例如光學，紅外，紫外等)、放射性、質量、體積、密度、溫度、粘度、pH、物質諸如生物物質(例如，蛋白質，核酸等)的濃度等等。

在一些情況下，傳感器可以連接至處理器，處理器進而導致對流體液滴執行操作，例如通過對液滴進行分選、從液滴添加或去除電荷、使液滴與另一液滴融合、分割液滴、引起液滴內發生混合等，例如，如前所述的。例如，響應於流體液滴的傳感器測量，處理器可以使流體液滴分割、與第二流體液滴合併等。

一個或多個傳感器和/或處理器可以被定位成與流體液滴感測連通。如本文所使用的「感測連通」意味著傳感器可以定位在任何地方，以使得可以以某種方式感測和/或確定流體系統內(例如，通道內)的流體液滴和/或包含流體液滴的流體系統的一部分。例如，傳感器可以與流體液滴和/或包含流體液滴的流體系統的一部分流體地、光學地或視覺地、熱地、氣動地、電子地等感測連通。傳感器可以定位在流體系統附近，例如嵌入在通道的壁內或一體地連接至通道的壁，或者與流體系統分開定位，但是與流體系統進行物理、電和/或光通信，以便能夠感測和/或確定流體液滴和/或包含流體液滴的流體系統的一部分(例如，通道或微通道，包含流體液滴的液體等)。例如，傳感器可以沒有與包含液滴的通道的任何物理連接，但是可以定位成檢測從液滴或流體系統產生的電磁輻射，例如紅外線、紫外線或可見光。電磁輻射可以由液滴產生，和/或可以從流體系統的其它部分(或者流體系統的外部)產生，並且以例如通過吸收、反射、衍射、折射、螢光、磷光、極性變化、相變、相對於時間的變化等指示流體液滴的一個或多個特性的方式與流體液滴和/或包含流體液滴的流體系統的一部分相互作用。作為示例，雷射可以指向流體液滴和/或圍繞流體液滴的液體，並且可以確定流體液滴和/或周圍的液體的螢光。如本文所使用的「感測連通」還可以是直接或間接的。作為示例，來自流體液滴的光可以被引導到傳感器，或者在被引導到傳感器之前首先被引導通過光纖系統、波導等。

可用於本發明的傳感器的非限制性實例包括基於光學或電磁學的系統。例如，傳感器可以是螢光傳感器(例如，由雷射激發)、顯微鏡系統(其可以包括相機或其它記錄裝置)等。作為另一示例，傳感器可以是電子傳感器，例如能夠測定電場或其它電特性的傳感器。例如，傳感器可以檢測流體液滴和/或包含流體液滴的流體系統的一部分的電容、電感等。

如本文所使用的，「處理器」或「微處理器」是能夠從一個或多個傳感器接收信號、存儲信號和/或引導一個或多個響應(例如，如上所述)(例如，通過使用數學公式或電子或計算電路)的任何組件或設備。該信號可以是指示由傳感器確定的環境因素的任何合適的信號，例如氣動信號，電子信號，光信號，機械信號等。

在一組實施方案中，可以通過在液滴上產生電荷和/或電偶極子，並且使用施加的電場操縱液滴來引導流體液滴，施加的電場可以是AC場、DC場等。作為示例，可以根據需要選擇性地施加和移除電場(或者可以施加不同的電場，例如，反向電場)以將流體液滴引導到特定區域。在一些實施方案中，可以根據需要選擇性地施加和移除電場，而不實質上改變包含流體液滴的液體的流動。例如，液體可以在基本上穩態的基礎上(即，包含流體液滴的液體的平均流速偏離穩態流動或者液體流動相對於時間的預期值的小於20％或小於15％，並且在一些情況下，平均流速可以偏離小於10％或小於5％)或在其它預定的基礎上流動通過本發明的流體系統(例如，通過通道或微通道)，並且包含在液體內的流體液滴可以例如使用電場被引導到各個區域，而基本上不改變通過流體系統的液體的流動。

在一些實施方案中，可以通過改變包含液滴的液體的流動在本發明的流體系統內對流體液滴進行篩選或分選。例如，在一組實施方案中，可以通過將圍繞流體液滴的液體引導到第一通道、第二通道等中來引導或分選流體液滴

在另一組實施方案中，可以控制流體系統內例如不同通道內或通道的不同部分內的壓力，以引導流體液滴的流動。例如，液滴可以被引導朝向包括用於進一步的流動方向(例如，被引導朝向限定任選的下遊流動通道的通道中的分支或分叉)的多個選件的通道接合部。可控制一個或多個任選的下遊流動通道內的壓力以將液滴選擇性地引導到通道中的一個中，並且可以在連續的液滴到達接合部所需的時間量級上實現壓力變化，以使得可以獨立控制每個連續液滴的下遊流動路徑。在一種布置中，液體儲存器的膨脹和/或收縮可以用於將流體液滴引導或分選到通道中，例如通過引起包含流體液滴的液體的定向運動。液體儲存器可以定位成使得當被激活時，由激活的儲存器引起的液體的運動導致液體沿優選方向流動，從而在該優選方向上攜帶流體液滴。例如，液體儲存器的膨脹可以引起朝向儲存器的液體流動，而液體儲存器的收縮可以引起液體遠離儲存器流動。在一些情況下，液體儲存器的膨脹和/或收縮可以與其它流動控制裝置和方法(例如，如本文所述的)組合。能夠引起液體儲存器的膨脹和/或收縮的裝置的非限制性實例包括活塞和壓電部件。在一些情況下，壓電部件可能是特別有用的，因為它們具有相對快速的響應時間，例如響應於電信號。在一些實施方案中，流體液滴可以被分選到多於兩個通道中。

如上所述，某些實施方案總體上涉及用於分選液體中的流體液滴的系統和方法。例如，可以以某種方式(例如，如本文進一步描述的)感測和/或確定液滴的性質，然後可以將液滴引導朝向裝置的特定區域，例如微流體通道，例如，用於分選目的。在一些情況下，使用本發明的某些系統和方法可以實現高分選速度。例如，在一些情況下，可以確定和/或分選至少約10個液滴/秒，並且在其它情況下，可以確定和/或分選至少約20個液滴/秒，至少約30個液滴/秒，至少約100個液滴/秒，至少約200個液滴/秒，至少約300個液滴/秒，至少約500個液滴/秒，至少約750個液滴/秒，至少約1,000個液滴/秒，至少約1,500個液滴/秒，至少約2,000個液滴/秒，至少約3,000個液滴/秒，至少約5,000個液滴/秒，至少約7,500個液滴/秒，至少約10,000個液滴/秒，至少約15,000個液滴/秒，至少約20,000個液滴/秒，至少約30,000個液滴/秒，至少約50,000個液滴/秒，至少約75,000個液滴/秒，至少約100,000個液滴/秒，至少約150,000個液滴/秒，至少約200,000個液滴/秒，至少約300,000個液滴/秒，至少約500,000個液滴/秒，至少約750,000個液滴/秒，至少約1,000,000個液滴/秒，至少約1,500,000個液滴/秒，至少約2,000,000或更多個液滴/秒，或至少約3,000,000或更多個液滴/秒。

在一些方面，可以使用相對小的液滴的群體。在某些實施方案中，作為非限制性實例，液滴的平均直徑可以小於約1mm，小於約500微米，小於約300微米，小於約200微米，小於約100微米，小於約75微米，小於約50微米，小於約30微米，小於約25微米，小於約20微米，小於約15微米，小於約10微米，小於約5微米，小於約3微米微米，小於約2微米，小於約1微米，小於約500nm，小於約300nm，小於約100nm或小於約50nm。在某些情況下，液滴的平均直徑也可以為至少約30nm，至少約50nm，至少約100nm，至少約300nm，至少約500nm，至少約1微米，至少約2微米，至少約3微米，至少約5微米，至少約10微米，至少約15微米或至少約20微米。液滴群體的「平均直徑」是液滴直徑的算術平均值。

在一些實施方案中，取決於具體應用，液滴可以具有基本上相同的形狀和/或尺寸(即，「單分散」)或具有不同的形狀和/或尺寸。在一些情況下，液滴可以具有橫截面直徑的均勻分布，即液滴可以具有這樣的直徑分布，以使得不超過約5％，不超過約2％或不超過約1％的液滴具有小於約90％(或小於約95％，或小於約99％)和/或大於約110％(或大於約105％，或大於約101％)的多個液滴的總平均直徑的直徑。用於產生液滴的橫截面直徑的均勻分布的一些技術公開於由Link等人於2004年4月9日提交的題為「Formation and Control of Fluidic Species」的國際專利申請號PCT/US2004/010903，其於2004年10月28日公開為WO 2004/091763，其通過引用併入本文。

本領域普通技術人員將能夠例如使用雷射散射或其它已知技術確定液滴群體的平均直徑。如此形成的液滴可以是球形的，或在某些情況下是非球形的。在非球形液滴中的液滴的直徑可以被認為是具有與非球形液滴相同的體積的完美數學球體的直徑。

在一些實施方案中，可以通過在被液體包圍的流體上產生電荷來在通道內產生一個或多個液滴，這可以使流體分離在液體內的個體液滴中。在一些實施方案中，可以向流體施加電場以使液滴形成發生。流體可以作為在液體內的一系列單獨的帶電和/或電誘導的液滴存在。可以使用任何合適的技術在液體內的流體中產生電荷，例如通過將流體置於電場(可以是AC、DC等)內，和/或通過引起使流體具有電荷的反應發生。

在一些實施方案中，電場從電場發生器(即，能夠產生可施加到流體的電場的裝置或系統)產生。電場發生器可以產生AC場(即，相對於時間周期性變化的場，例如正弦波、鋸齒波、方波等)、DC場(即，相對於時間恆定的場)、脈衝場等。用於產生合適的電場(其可以是AC、DC等)的技術是本領域普通技術人員已知的。例如，在一個實施方案中，通過在一對電極上施加電壓來產生電場，所述電極可以位於通道附近，以使得電場的至少一部分與通道相互作用。電極可以由本領域普通技術人員已知的任何合適的電極材料形成，所述材料包括但不限於銀、金、銅、碳、鉑、銅、鎢、錫、鎘、鎳、銦錫氧化物(「ITO」)等，及其組合。

在另一組實施方案中，可以通過以能夠引起流體形成個體液滴的方式改變通道尺寸來從由通道內的液體包圍的流體產生流體液滴。通道可以例如是相對於流動方向變寬的通道，例如，以使得流體不粘附到通道壁而是形成個體液滴，或者相對於流動方向變窄的通道，例如，以使得流體被迫聚結成個體液滴。在一些情況下，通道尺寸可以以導致個體液滴的形成發生的方式相對於時間改變(例如，機械地或機電地，氣動地等)。例如，通道可以機械地收縮(「擠壓」)以引起液滴形成，或者流體流可以被機械地破壞(例如通過使用移動擋板、旋轉葉片等)以引起液滴形成。

某些實施方案總體上涉及用於將液滴分割成兩個或更多個液滴的系統和方法。例如，可以使用施加的電場來分割液滴。液滴可以具有比周圍液體更大的電導率，並且在一些情況下，液滴可以是中性電荷的。在某些實施方案中，在施加的電場中，可以促使電荷從液滴的內部遷移至待分布在其上的表面，從而可以消除液滴內部中經歷的電場。在一些實施方案中，液滴表面上的電荷也可能由於所施加的電場而經受力，這導致具有相反極性的電荷在相反的方向上遷移。在一些情況下，電荷遷移可導致液滴被拉開成兩個單獨的液滴。

本發明的一些實施方案總體上涉及用於將兩個或更多個液滴融合或聚結成一個液滴的系統和方法，例如，當兩個或更多個液滴例如由於組成、表面張力、液滴尺寸、表面活性劑的存在或不存在等而通常不能融合或聚結時。在某些情況下，相對於液滴尺寸，液滴的表面張力還可以防止發生液滴的融合或聚結。

作為非限制性實例，兩個液滴可以被給予相反的電荷(即，正電荷和負電荷，不一定具有相同的量級)，這可以增加兩個液滴的電相互作用，以使得液滴的融合或聚結由於它們相反的電荷而發生。例如，電場可以被施加到液滴，液滴可以通過電容器，化學反應可以使液滴變得帶電等。在一些情況下，液滴可能不能夠融合，即使施加表面活性劑以降低液滴的表面張力。然而，如果液滴以相反的電荷(其可以是但不一定是相同的量級)帶電，則液滴可以能夠融合或聚結。作為另一個實例，液滴可以不必須被給予相反的電荷(並且在一些情況下，可以不被給予任何電荷)，並且通過使用在液滴中誘導的導致液滴聚結的偶極子而融合。此外，允許聚結的兩個或更多個液滴不一定需要滿足「迎頭相對的」。只要初始發生液滴的至少一些融合，則任何接觸角度都是足夠的。還參見例如由Ahn等人於2007年1月24日提交的題為「Fluidic Droplet Coalescence」的美國專利申請系列號11/698,298，其於2007年8月23日公開為美國專利申請公開號2007/0195127，通過引用將其全部內容併入本文。

在一組實施方案中，流體可以被注入到液滴中。在一些情況下，可以例如使用微針或其它這樣的裝置將流體微注射到液滴中。在其它情況下，當液滴與流體通道接觸時，可以使用流體通道將流體直接注入到液滴中。流體注射的其它技術公開於例如由Weitz等人於2010年6月25日提交的題為「Fluid Injection」的國際專利申請號PCT/US2010/040006，其於2010年12月29日公開為WO 2010/151776；由Weitz等人於2009年12月18日提交的題為「Particle-Assisted Nucleic Acid Sequencing」的國際專利申請號PCT/US2009/006649，其於2010年7月15日公開為WO 2010/080134，這些專利申請通過引用整體併入本文。

根據本發明的某些方面，多種材料和方法可用於形成製品或組件(諸如本文所述的那些)，例如通道諸如微流體通道、腔室等。例如，各種製品或組件可以由固體材料形成，其中通道可以通過微加工、膜沉積工藝如旋塗和化學氣相沉積、雷射製造、光刻技術、蝕刻法包括溼化學或等離子體工藝等形成。參見，例如，Scientific American,248:44-55,1983(Angell等人)。

在一組實施方案中，本文所述製品的各種結構或組件可由聚合物形成，所述聚合物為例如彈性體聚合物，例如聚二甲基矽氧烷(「PDMS」)，聚四氟乙烯(「PTFE」或)等。例如，根據一個實施方案，可以通過使用PDMS或其它軟光刻技術單獨製造流體系統來實現微流體通道(適合於此實施方案的軟光刻技術的細節在Younan Xia和George M.Whitesides的題為「Soft Lithography」，公開於Annual Review of Material Science，1998，第28卷，第153-184頁以及George M.Whitesides，Emanuele Ostuni，Shuichi Takayama，Xingyu Jiang和Donald E.Ingber的題為「Soft Lithography in Biology and Biochemistry」，公開於Annual Review of Biomedical Engineering，2001，第3卷，第335-373頁的參考文獻中討論；這些參考文獻中的每一個通過引用併入本文)。

潛在合適的聚合物的其它實例包括但不限於聚對苯二甲酸乙二醇酯(PET)，聚丙烯酸酯，聚甲基丙烯酸酯，聚碳酸酯，聚苯乙烯，聚乙烯，聚丙烯，聚氯乙烯，環烯烴共聚物(COC)，聚四氟乙烯，氟化聚合物，矽酮諸如聚二甲基矽氧烷，聚偏二氯乙烯，雙苯並環丁烯(「BCB」)，聚醯亞胺，聚醯亞胺的氟化衍生物等。也設想了包括聚合物(包括上述的那些)的組合、共聚物或摻合物。裝置還可以由複合材料(例如，聚合物和半導體材料的複合材料)形成。

在一些實施方案中，製品的各種結構或部件由聚合和/或柔性和/或彈性體材料製成，並且可以方便地由可硬化流體形成，從而便於經由模製(例如複製成型、注射成型、鑄塑成型等等)製造。可硬化流體可以基本上是可以被誘導固化或自發固化成能夠容納和/或輸送預期用於流體網絡和與流體網絡一起使用的流體的固體的任何流體。在一個實施方案中，可硬化流體包括聚合物液體或液體聚合物前體(即「預聚物」)。合適的聚合物液體可包括例如熱塑性聚合物、熱固性聚合物、蠟、金屬或其在高於其熔點的溫度下加熱的混合物或複合物。作為另一個實例，合適的聚合物液體可以包括一種或多種聚合物在合適溶劑中的溶液，該溶液在除去溶劑(例如通過蒸發)後形成固體聚合物材料。可以例如從熔融狀態固化或通過溶劑蒸發固化的這種聚合物材料是本領域普通技術人員公知的。對於其中一個或兩個母模模具由彈性體材料組成的實施方案，各種聚合物材料(其中許多是彈性體的)是合適的，並且也適用於形成模具或母模模具。這種聚合物的實例的非限制性列表包括一般類別的矽酮聚合物、環氧聚合物和丙烯酸酯聚合物的聚合物。環氧聚合物的特徵在於存在通常被稱為環氧基團、1、2-環氧化物或環氧乙烷的三元環醚基團。例如，除了基於芳族胺、三嗪和脂環族主鏈的化合物之外，還可以使用雙酚A的二縮水甘油醚。另一個實例包括公知的酚醛清漆聚合物。適用於根據本發明使用的矽酮彈性體的非限制性實例包括由包括氯矽烷如甲基氯矽烷、乙基氯矽烷、苯基氯矽烷、十二烷基三氯矽烷等的前體形成的那些。

在某些實施方案中使用矽酮聚合物，例如，矽酮彈性體聚二甲基矽氧烷。PDMS聚合物的非限制性實例包括由Dow Chemical Co.,Midland,MI以商品名Sylgard銷售的那些，特別是Sylgard 182，Sylgard 184和Sylgard 186。包括PDMS的矽酮聚合物具有幾種使本發明的各種結構的製造簡化的有益性質。例如，這種材料便宜、容易獲得，並且可以通過用熱硬化而從預聚物液體固化。例如，PDMS通常通過將預聚物液體暴露於約例如約65℃至約75℃的溫度進行例如約1小時的暴露時間而硬化。此外，矽酮聚合物例如PDMS可以是彈性體的，因此可用於形成具有相對高的縱橫比的非常小的特徵，這在本發明的某些實施方案中是必需的。在這方面，柔性(例如，彈性體)模具或母模可以是有利的。

由矽酮聚合物(例如PDMS)形成結構諸如微流體結構或通道的一個優點是這些聚合物被氧化的能力，例如通過暴露於含氧等離子體如空氣等離子體，以使得氧化結構在其表面含有能夠與其它氧化的矽酮聚合物表面或與各種其它聚合和非聚合材料的氧化表面交聯的化學基團。因此，可以製造結構，然後氧化並且基本上不可逆地密封至其它矽酮聚合物表面，或者密封至與氧化的矽酮聚合物表面反應的其它基底的表面，而不需要單獨的粘合劑或其它密包封置。在大多數情況下，可以簡單地通過使氧化的矽酮表面與另一表面接觸來完成密封，而不需要施加輔助壓力以形成密封。也就是說，預氧化的矽酮表面用作針對合適的配合表面的接觸粘合劑。具體地，除了不可逆地密封自身之外，氧化的矽酮例如氧化的PDMS還可以不可逆地密封至除了自身之外的一系列氧化材料，包括例如玻璃、矽、氧化矽、石英、氮化矽、聚乙烯、聚苯乙烯、玻璃碳和環氧聚合物，它們以與PDMS表面類似的方式氧化(例如，通過暴露於含氧等離子體)。在本發明的上下文中有用的氧化和密封方法以及整體模製技術描述於本領域中，例如描述於題為「Rapid Prototyping of Microfluidic Systems and Polydimethylsiloxane」Anal.Chem.,70:474-480,1998(Duffy等人)的文章中，其通過引用併入本文。

因此，在某些實施方案中，製品的設計和/或製造可以相對簡單，例如通過使用相對公知的軟光刻和其它技術諸如本文所述的那些。另外，在一些實施方案中，製品的快速和/或定製設計(例如，在幾何形狀方面)是可能的。在一組實施方案中，製品可以被製成是一次性的，例如在制品與放射性、毒性、有毒、反應性、生物危害性等的物質一起使用的實施方案中，和/或當物質的性質(例如，毒理學性質、放射性性質等)是未知的時。從氧化的矽酮聚合物形成通道或其它結構(或內部、流體接觸表面)的另一個優點是這些表面比典型的彈性體聚合物的表面親水得多(當需要親水的內表面時)。因此，與由典型的未氧化的彈性體聚合物或其它疏水性材料構成的結構相比，這種親水性通道表面可以更容易地用水溶液填充和潤溼。

為了所有目的，以下文獻通過引用整體併入本文：Link等人的題為「Formation and Control of Fluidic Species」的國際專利申請公開號WO 2004/091763；Stone等人的題為「Method and Apparatus for Fluid Dispersion」的國際專利申請公開號WO 2004/002627；Weitz等人的題為「Method and Apparatus for Forming Multiple Emulsions」的國際專利申請公開號WO 2006/096571；Link等人的題為「Electronic Control of Fluidic Species」的國際專利申請公開號WO 2005/021151；Weitz等人的題為「Droplet Creation Techniques」的國際專利申請公開號WO 2011/056546；Weitz等人的題為「Creation of Libraries of Droplets and Related Species」的國際專利申請公開號WO 2010/033200；Weitz等人的題為「Fluid Injection」的美國專利申請公開號2012-0132288；Agresti等人的題為「Assay And Other Reactions Involving Droplets」國際專利申請公開號WO 2008/109176；和Weitz等人的題為「Fluid Injection」的國際專利申請公開號WO 2010/151776。

還通過引用整體併入本文的是Bernstein等人於2014年4月17日提交的題為「Systems and Methods for Droplet Tagging」的美國臨時專利申請系列號61/981,123。

雖然本文已經描述和示出了本發明的若干實施方案，但是本領域普通技術人員將容易想到用於執行本文描述的功能和/或獲得本文描述的結果和/或一個或多個優勢的各種其它工具和/或結構，並且這些變化和/或修改中的每一個被認為在本發明的範圍內。更一般地，本領域技術人員將容易地理解，本文描述的所有參數、尺寸、材料和構造意在是示例性的，並且實際參數、尺寸、材料和/或構造將取決於使用本發明的教導的具體應用。本領域技術人員將通過使用不超過常規實驗而認識到或者能夠確定本文所述的本發明的具體實施方案的許多等同物。因此，應當理解，前述實施方案僅以舉例的方式給出，並且在所附權利要求及其等同物的範圍內，本發明可以以不同於具體描述和請求保護的方式實施。本發明涉及本文所述的每個單獨的特徵、系統、製品、材料、試劑盒和/或方法。此外，如果這些特徵、系統、製品、材料、試劑盒和/或方法不相互矛盾，則兩個或更多個此類特徵、系統、製品、材料、試劑盒和/或方法的任何組合包括在本發明的範圍。

本文定義和使用的所有定義應理解為優先於字典定義、通過引用併入的文獻中的定義和/或所定義術語的普通含義。

除非清楚地相反指示，否則本文在說明書和權利要求書中使用的不定冠詞「一個」和「一種」應當被理解為是指「至少一個/一種」。

如在本文中在說明書和權利要求中所用，短語「和/或」應當被理解為意指所連接的元素的「任一個或兩者」，即元素在一些情況下結合地存在以及在其它情況下分離地存在。利用「和/或」列出的多個元素應當以相同的方式來解釋，即所連接的元素的「一個或多個」。除通過「和/或」從句明確確定的元素外，還可任選地存在其它元素，無論與明確確定的那些元素相關還是無關。因此，作為非限定性實例，對「A和/或B」的提及，當與開放性措辭諸如「包含/包括」結合使用時，在一個實施方案中可僅指A(任選地包括除B外的元素)；在另一個實施方案中可僅指B(任選地包括除A外的元素)；在另一個實施方案中，可指A和B(任選地包括其它元素)；依此類推。

如本文中在說明書和權利要求中所用，「或」應當被理解為具有與如上定義的「和/或」相同的含義。例如，當在列表中分開各項時，「或」或「和/或」應當被理解為是包含性的，即包含至少一個，但也包括許多個元素或一列元素中的多於一個，以及任選地，包括另外未列出的項。只有明確地指明相反的術語，例如「……中的僅一個」或「……中的恰好一個」或當用於權利要求中時的「由……組成」將指包含多個元素或一列元素中的正好一個元素。一般地，如本文中所用的術語「或」應當僅在冠有排他性的術語諸如「任一」、「……之一」、「……中的僅一個」或「……中的恰好一個」時被解釋為表示排他性選擇(即「一個或另一個但非兩個」)。「基本上由……組成」，當用於權利要求中時，應當具有其在專利法領域中使用的普通含義。

如本文中在說明書和權利要求中所用，關於一列一個或多個元素的短語「至少一個」應當被理解為意指選自一列元素中的任何一個或多個元素的至少一個元素，但不一定包括元素列表內明確列出的每一個元素的至少一個並且不排除元素列表中的元素的任何組合。該定義還允許可任選地存在除短語「至少一個」所指的元素列表內明確確定的元素外的元素，無論與那些明確確定的元素相關還是不相關。因此，作為非限定性實例，「A和B的至少一個」(或，等同地，「A或B的至少一個」或，等同地「A和/或B的至少一個」)可在一個實施方案中指至少一個(任選地包括不止一個)A而無B存在(且任選地包括除B外的元素)；在另一個實施方案中指至少一個(任選地包括不止一個)B而無A存在(且任選地包括除A外的元素)；在另一個實施方案中指至少一個(任選地包括不止一個)A和至少一個(任選地包括不止一個)B(且任選地包括其它元素)；依此類推。

還應當理解，除非明確地指明與之相反，否則在包括不止一個步驟或行為的本文請求保護的任何方法中，所述方法的步驟或行為的順序不必須地限定於其中敘述所述方法的步驟或行為的順序。

在權利要求中，以及在上述說明書中，所有過渡短語諸如「包含」、「包括」、「攜帶」、「具有」、「含有」、「擁有」、「牽涉」、「持有」、「由……組成」等被理解為開放性的，即意指包括但不限於。只有過渡短語「由……組成」和「基本上由……組成」應當分別是封閉性的或半封閉性的過渡短語，如美國專利局專利審查程序手冊第2111.03節中所示的。