一種枸杞無菌苗及其誘導愈傷的獲得方法
2023-12-05 03:36:06
一種枸杞無菌苗及其誘導愈傷的獲得方法
【專利摘要】本發明公開了一種枸杞無菌苗及其誘導愈傷的獲得方法，屬於植物組織培養【技術領域】，它包括以下步驟：果實幹燥，種子消毒：用含有70%乙醇、0.1%TritonX-100(聚乙二醇辛基苯基醚)的無菌蒸餾水進行種子消毒，種子萌發：先置於4℃的冰箱中，靜置2天，然後移至溫度為25±2℃，每日光照14小時的培養室培養20±2天，愈傷繼代培養：將種子放置於繼代培養基上，25±2℃條件下，每日光照16小時的培養室中培養，每兩周更換培養基。該方法在獲得枸杞無菌苗的同時獲得了枸杞的誘導愈傷組織，簡化了枸杞愈傷組織誘導過程中對其進行物理創傷的這一步驟，縮短了獲得枸杞愈傷組織的周期。
【專利說明】一種枸杞無菌苗及其誘導愈傷的獲得方法
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種組織培養愈傷組織誘導的方法，尤其是一種枸杞無菌苗及其誘導愈傷的獲得方法。
【背景技術】 [0002]枸杞(Lycium)為一種多分枝、多刺灌木，其果實在中國有很多民間叫法，如苟起子、枸杞紅實、甜菜子、西枸杞、狗奶子。枸杞子被衛生部列為「藥食兩用」品種，枸杞子可以加工成各種食品、飲料、保健酒、保健品等。枸杞子主要成分含甜菜鹼(betane)，阿託品(atropine),天仙子胺(gyoscyamine),枸杞多糖和枸杞色素。其中又以枸杞多糖的免疫調節和抗腫瘤作用的研究最多。現已有很多研究表明，枸杞具有促進免疫、抗衰老、抗腫瘤、預防動脈粥樣硬化、清除自由基、抗疲勞、抗輻射、保肝、生殖功能保護和改善等作用。
[0003]枸杞喜冷涼溼潤的肥沃土壤，耐寒，耐旱，耐風雨，但不耐高溫，在貧瘠的路、溝、渠旁也能正常生長，山坡、荒地、田野、庭院等向陽乾燥的地方都可種植。對土壤要求不嚴，但以砂質壤土最好，低洼積水的地方不宜栽種。但是傳統種植方法一般為自然萌發出苗，發芽率不高，一般為60%，且容易受氣候和季節影響，不能全天候萌發。同時在自然條件下，幼苗的成苗率也偏低。這些不利因素都影響了枸杞的大規模種植和商業化運作。
[0004]當枸杞的外植體為苗、莖和葉片等植物器官時，枸杞愈傷的獲得一般均需先對其外植體進行物理創傷，然後通過一定的特殊培養基對創傷的外植體進行誘導培養，方可使外植體產生愈傷。並且，如果外植體取自自然環境，也需要考慮季節的因素，例如，如果選用葉片進行愈傷誘導，則冬季就很難進行。如果外植體取自自然環境，一般要先對外植體進行無菌處理，之後方可進行愈傷的誘導工作，而無菌處理一般使用0.1%的升汞，其對外植體的毒性高，傷害較大，致死率較高，從而導致愈傷誘導率較低；此外還可在無菌環境下直接對枸杞無菌苗進行物理創傷處理，從而誘導枸杞愈傷產生，但是同樣的，需要先行對枸杞種子進行無菌處理，同樣需要使用0.1%的升汞，其對種子毒性高，致死率較高，致使枸杞發芽率降低。無論使用何種方法，都面臨這同樣的問題，即外植體的愈傷組織的誘導率較低，方法繁瑣。
【發明內容】
[0005]本發明提供了一種組織培養愈傷組織誘導的方法，該方法可以高效、快速、簡單的獲得枸杞無菌苗及其愈傷，該方法不僅能夠獲得無菌的枸杞無菌苗，方便快捷的同時獲得了枸杞的誘導愈傷組織。
[0006]本發明解決技術問題所採取的技術方案是:
一種枸杞無菌苗及其誘導愈傷的獲得方法，其特徵在於，包括以下步驟:
(O果實幹燥:將收集到的枸杞果實放於尼龍網袋中，吊置於乾燥通風的房間中，20-25°C條件下，放置14天左右，每隔一天翻動一次，直至果實完全乾燥；
(2)種子消毒:當種子和果皮容易分開時，取出種子，無菌條件下放置於無菌的藍蓋擰口試劑瓶中，加入處理液，將藍蓋擰口試劑瓶置于震蕩搖床上，20-25°C條件下，快速震蕩2分鐘，然後將種子和處理液一併倒在乾燥的無菌濾紙上，無菌條件下，乾燥處理；
所述處理液為含有70%(v/v)乙醇、0.1%(v/v) Triton X-100 (聚乙二醇辛基苯基醚)的無菌蒸餾水，所述無菌蒸餾水的電阻率≥0.1 XlO6 Ω._(歐?釐米)；
(3)種子萌發:將經過步驟(2)處理的種子輕輕的均勻撒在預處理培養基上，將放有種子的預處理培養基放置於4°C的冰箱中，靜置2天，然後移至溫度為25±2°C，每日光照14小時的培養室，連續培養20±2天，直至帶有愈傷組織的枸杞幼苗出現；
(4)愈傷繼代培養:在無菌條件下將枸杞愈傷與幼苗分離，放置於繼代培養基上，置於培養室中，在溫度為25±2°C條件下，每日光照16小時，連續培養，期間每兩周換至新的繼代培養基上。
[0007]優選的，所述預處理培養基為pH5.8的基本的MS培養基，所述的MS培養基中含有6-BA (6-苄氨基嘌呤)2-3mg/L, NAA ( α -萘乙酸)0.1-0.3mg/L,激動素(6-糖基氨基嘌呤)1-3 mg/L,赤黴素 0.5-1 mg/L, 二苯脲 0.5_2mg/L, 20g/L 鹿糖,8g/L 瓊脂。NAA 為植物生長激素，促進細胞增殖生長。6-BA為細胞分裂素，促進芽的形成，也可以誘導愈傷組織發生。激動素為細胞分裂素，可誘導離體組織的細胞分裂和調節分化。赤黴素，可刺激葉和芽的生長。二苯脲，具有細胞分裂素作用。幾者的組合可以一方面促進種子的發芽，減少種子的休眠時間提高出芽率，同時促進枸杞苗的根冠薄壁細胞愈傷組織的形成，提高愈傷組織的誘導率和增殖速率；
繼代培養基為PH5.8的基本的MS培養基，所述的MS培養基中含有6-BA(6-苄氨基嘌呤)3-5mg/L, ΝΑΑ( α -萘乙酸)0.3-0.5mg/L,激動素(6-糖基氨基嘌呤)2_5mg/L，二苯脲l-3mg/L,20g/L鹿糖，8g/L瓊脂。適當的增加幾種激素的濃度並調節適當的比例，減少赤黴素的用量，能夠迅速並且顯著地提高愈傷組織的增殖速率。在溫度為25±2°C，每日光照16小時，連續培養，期間每2周換至新的繼代培養基上。
[0008]優選的，所述步驟(2)中，種子和處理液的質量體積比為1:30 (g:ml)，種子和溶液的總體積為藍蓋擰口試劑瓶體積的10%，所述質量體積比為g:mL。
[0009]優選的，所述步驟(2)中，震蕩搖床轉速為300rpm。
[0010]本發明的有益效果:
(I)本發明通過6-BA (6-苄氨基嘌呤)、NAA ( α -萘乙酸)、激動素((6-糖基氨基嘌呤)、赤黴素、二苯脲的組合對枸杞苗的根冠薄壁細胞作用，不通過任何的物理創傷，能夠直接獲得根部帶有愈傷組織的無菌苗，並且，後期愈傷的存活率可達到97.5±2%。該方法在獲得枸杞無菌苗的同時獲得了枸杞的誘導愈傷組織，簡化了枸杞愈傷組織誘導過程中對其進行物理創傷的這一步驟，縮短了獲得枸杞愈傷組織的周期。
[0011](2)本發明不用莖杆、葉子等進行愈傷，直接採取種子愈傷，一年四季都可以進行誘導愈傷，克服了莖杆、葉子等進行愈傷的季節選擇性問題。
[0012](3)本發明採用含有70%乙醇和0.l%Triton X-100的處理液對種子消毒，得到的枸杞苗的無菌率可達97.4±1%。
[0013](4)本發明採用種子和處理液的質量體積比在1:30 (g:ml)，種子和處理液的總體積為藍蓋擰口試劑瓶體積的10%，因此得到的枸杞苗的無菌率進一步提高，可達98.6±1%。
[0014](5)普通的組織誘導一般要經過水洗、酒精洗、升汞處理等等步驟，一般需時2小時以上；本發明採用震蕩搖床轉速為300rpm，處理時間為2分鐘，因此得到的枸杞苗的無菌率大大提高，同時處理時間大大的減少。
[0015](6)本發明採用枸杞誘導愈傷培養基配方中激素6-BA 2-3mg/L, NAA 0.1-0.3mg/L,激動素l_3mg/L,赤黴素0.5-1 mg/L, 二苯脲0.5_2mg/L,因此縮短了枸杞種子的低溫處理時間，在獲得枸杞苗的同時得到了其誘導愈傷組織，簡化了枸杞愈傷組織誘導的實驗步驟，同時保證 誘導率高達51.7±2%。
[0016](7)本發明採用了枸杞誘導愈傷的繼代培養中6-BA 3-5mg/L, NAA 0.3-0.5mg/L，激動素2-5mg/L，二苯脲l_3mg/L，因此枸杞愈傷組織得到了快速的增長，增殖率為89.8±2%，明顯高於同樣生長周期中的一般培養基。
【具體實施方式】
[0017]實施例1
(O果實幹燥:將收集到的枸杞果實放於尼龍網袋中，吊置於乾燥通風的房間中，20-25°C條件下，放置14天左右，每隔一天翻動一次，直至果實完全乾燥；
(2)種子消毒:當種子和果皮容易分開時，取出種子，無菌條件下放置於無菌的藍蓋擰口試劑瓶中，加入處理液，將藍蓋擰口試劑瓶置于震蕩搖床上，20-25°C條件下，快速震蕩2分鐘，然後將種子和處理液一併倒在乾燥的無菌濾紙上，無菌條件下，乾燥處理；所述處理液為含有70%(v/v)乙醇、0.1%(v/v)Triton X-100聚乙二醇辛基苯基醚)的無菌蒸餾水，蒸餾水的電阻率≥0.1 XlO6 Ω ?(^(歐^釐米)。
[0018]將實施例1步驟(2)中處理液變為含有70%乙醇的無菌蒸餾水，得到的枸杞苗的無菌率降為84 ±5%。
[0019]將上述步驟(2)中種子和處理液的質量體積比控制在1:30 (g:mL)，種子和處理液的總體積為藍蓋試劑瓶體積的10%，得到的枸杞苗的無菌率提高到98.6±1%。
[0020]將上述步驟(2)中震蕩搖床的轉速調為O~400rpm，震蕩時間控制為O~20分鐘，發現當震蕩搖床轉速大於等於300rpm，震蕩時間大於等於2分鐘時，獲得的枸杞苗的無菌率無明顯變化。
[0021]上述結果具體見下表1和表2。
[0022]表1用不同的處理液對種子消毒後的無菌率變化
【權利要求】
1.一種枸杞無菌苗及其誘導愈傷的獲得方法，其特徵在於，包括以下步驟: (1)果實幹燥:將收集到的枸杞果實放於尼龍網袋中，吊置於乾燥通風的房間中，20-25°C條件下，放置14天左右，每隔一天翻動一次，直至果實完全乾燥； (2)種子消毒:當種子和果皮容易分開時，取出種子，無菌條件下放置於無菌的藍蓋擰口試劑瓶中，加入處理液，將藍蓋擰口試劑瓶置于震蕩搖床上，20-25°C條件下，快速震蕩2分鐘，然後將種子和處理液一併倒在乾燥的無菌濾紙上，無菌條件下，乾燥處理； 所述處理液為含有70%(v/v)乙醇、0.l%(v/v) Triton X-100 (聚乙二醇辛基苯基醚)的無菌蒸餾水，所述無菌蒸餾水的電阻率≥0.1 XlO6 Ω._(歐?釐米)； (3)種子萌發:將經過步驟(2)處理的種子輕輕的均勻撒在預處理培養基上，將放有種子的預處理培養基放置於4°C的冰箱中，靜置2天，然後移至溫度為25±2°C，每日光照14小時的培養室，連續培養20±2天，直至帶有愈傷組織的枸杞幼苗出現； (4)愈傷繼代培養:在無菌條件下將枸杞愈傷與幼苗分離，放置於繼代培養基上，置於培養室中，在溫度為25±2°C條件下，每日光照16小時，連續培養，期間每兩周換至新的繼代培養基上。
2.根據權利要求1所述的枸杞無菌苗及其誘導愈傷的獲得方法，其特徵在於， 所述預處理培養基為PH5.8的基本的MS培養基，所述的MS培養基中含有6-BA(6-苄氨基嘌呤)2-3mg/L，ΝΑΑ(α-萘乙酸)0.1_0.3mg/L，激動素(6-糖基氨基嘌呤)1-3 mg/L,赤黴素0.5-1 mg/L, 二苯脲0.5_2mg/L，20g/L蔗糖，8g/L瓊脂；繼代培養基為pH5.8的基本的MS培養基，所述的MS培養基中含有6-BA(6-苄氨基嘌呤)3_5mg/L，ΝΑΑ(α -萘乙酸)0.3-0.5mg/L,激動素(6-糖基氨基嘌呤)2_5mg/L, 二苯脲 l_3mg/L, 20g/L 鹿糖，8g/L瓊脂，在溫度為25±2°C，每日光照16小時，連續培養，期間每2周換至新的繼代培養基上。
3.根據權利要求1所述的枸杞無菌苗及其誘導愈傷的獲得方法，其特徵在於，所述步驟(2)中，種子和處理液的質量體積比為1:30 (g:mL)，種子和處理液的總體積為藍蓋擰口試劑瓶體積的10%。
4.根據權利要求1所述的枸杞無菌苗及其誘導愈傷的獲得方法，其特徵在於，所述步驟(2)中，震蕩搖床轉速為300rpm。
【文檔編號】A01H4/00GK103609451SQ201310619028
【公開日】2014年3月5日 申請日期:2013年11月29日 優先權日:2013年11月29日
【發明者】丁漢鳳, 王俊峰, 李潤芳, 李娜娜, 餘華, 賈文斌 申請人:山東省農作物種質資源中心