多色光學編碼矽殼納米棒及其製備方法

2023-12-05 20:22:01 2

專利名稱：：多色光學編碼矽殼納米棒及其製備方法
技術領域：
：本發明涉及一種納米
技術領域：
光致發光材料及其製備方法，具體涉及一種可用於多元生物分析與螢光成像中信號編碼的光致發光材料及其製備方法。技術背景生命科學技術的迅速發展給分析技術提出了新的挑戰。面對分析對象的日益增多，需要有與之相適應的分析手段相配合，特別需要有能夠對同一樣品中多種組分進行同時測定的多元分析技術。在多元分析中，往往需要使用多種螢光標記物，最好是僅用一個波長的光就能有效激發出各個標記物的螢光，這要求被選用的標記物具有相近的最大激發波長和明顯不同的最大發射波長，然而這樣的染料並不多。此外，多數染料分子的螢光並不強，而且易於受到不可逆的光漂白作用。最近發展起來的光學編碼技術為多元分析提供了更為廣泛的螢光標記物。該技術通常在聚合物微球中包裹兩種或多種螢光染料或量子點，通過控制各種染料的比例來實現編碼。目前常用於光學編碼的材料主要有聚合物螢光編碼微球和量子點編碼微球。聚合物材料易於發生溶脹而引起染料洩露，親水性不好，在水溶液中易於團聚；量子點存在著製備條件苛刻，毒性大等問題。
發明內容本發明要解決的技術問題是克服現有技術的不足，提供一種染料洩露少、生物相容性好、親水性好、螢光強、性質穩定的多色光學編碼矽殼納米棒，還提供一種工藝簡單、染料包裹效率高的多色光學編碼矽殼納米棒的製備方法。為解決上述技術問題，本發明提出的技術方案為一種多色光學編碼矽殼納米棒，其特徵在於所述多色光學編碼矽殼納米棒為核殼型結構，其外殼材料為二氧化矽，內核材料為螢光編碼的多聚賴氨酸，螢光編碼的多聚賴氨酸含有螢光染料A和螢光染料B,螢光染料A和螢光染料B是螢光共振能量轉移供體-受體對;所述螢光編碼的多聚賴氨酸是螢光染料A和螢光染料B通過其各自所帶有的活性基團與多聚賴氨酸的胺基共價連接而成。上述螢光共振能量轉移供體-受體對可以為下表中所列的各螢光染料配對組合中的任意一種表一tableseeoriginaldocumentpage5上述螢光染料所帶有的活性基團為異硫氰酸酯基或琥珀醯亞胺酯基。本發明還提出一種上述多色光學編碼矽殼納米棒的製備方法，其特徵在於將螢光染料A和螢光染料B與多聚賴氨酸反應製備螢光編碼的多聚賴氨酸，以螢光編碼的多聚賴氨酸為內核材料，用反向微乳液法將內核材料包裹在二氧化矽基質中製備成多色光學編碼的矽殼納米棒。上述製備方法具體包括以下步驟(1)螢光編碼多聚賴氨酸的製備將螢光染料A和螢光染料B按要求的比例同時或依次與多聚賴氨酸在碳酸鹽緩衝液中於室溫下反應2~3h，用透析法除去過量的螢光染料，製得螢光編碼的多聚賴氨酸；(2)編碼多聚賴氨酸的包殼將7.2~7.5體積的環己垸、1.61.8體積的表面活性劑曲拉通X-100和1.6-1.8體積的正己醇混合均勻，往混合液中加入0.4-0.8體積的水作為分散相，攪拌均勻後形成反相微乳液；加入0.2~0.6體積4.0x10'5~8.0x10"4mol/L上述製得的螢光編碼多聚賴氨酸的水溶液，攪拌均勻後再加入0.2~0.4體積的正矽酸乙酯和0.1~0.2體積氨水(質量分數25~28%)，反應2024h後加入丙酮或乙醇破乳，離心收集納米棒，並依次用乙醇、水洗滌收集到的納米棒，最後得到多色光學編碼矽殼納米棒。上述碳酸鹽緩衝液的濃度為0.01~0.1mol/L。當螢光染料的活性基團為異硫氰酸酯基時，碳酸鹽緩衝液的pH值可以為9.09.5;當螢光染料的活性基團為琥珀醯亞胺酯基時，碳酸鹽緩衝液的pH值可以為8.0~8.5。在螢光染料A和螢光染料B與多聚賴氨酸反應製備螢光編碼多聚賴氨酸的過程中，當螢光染料A與螢光染料B所帶的活性基團相同時，螢光染料A與螢光染料B可以同時與多聚賴氨酸反應製備螢光編碼的多聚賴氨酸；當螢光染料A與螢光染料B所帶的活性基團不同時，應當將螢光染料A與螢光染料B依次與多聚賴氨酸反應製備螢光編碼的多聚賴氨酸。上述螢光染料A和螢光染料B的配比應當根據所要製備的光學編碼材料的要求進行確定，隨著螢光染料A和螢光染料B配比情況的變化，以供體染料的最大激發波長的光激發，所述納米顆粒可發出不同顏色的螢光，從而達到多色光學編碼的效果。本發明針對如何製備矽殼納米棒以及如何將多色光學編碼的思路融合於納米棒的製備的問題，設計了一種簡單易行的製備方案。與現有技術相比，本發明不僅克服了現有光學編碼材料易於溶脹引起染料洩露、親水性不好、毒性大等技術缺陷，也改進了現有製備工藝中常見的工藝過程複雜、製備條件苛刻等不足，提供了一種簡便易行、染料包裹效率高、染料洩露少的多色光學編碼矽殼納米棒的製備工藝。通過改變矽殼納米棒中各種染料的配比，而製得的系列性的多色光學編碼矽殼納米棒，在某一特定波長光的激發下，各個納米棒能發出不同顏色的螢光，光強度較高，具有較好的生物相容性和親水性，且性質較為穩定。此外，由於矽殼納米棒表面有矽網結構的存在，可以利用表面矽垸化修飾方法對本發明的矽殼納米棒表面進行進一步處理，使其帶上氨基、羧基等基團，以便於蛋白質、核酸等生物分子的接枝。因此，本發明的多色光學編碼矽殼納米棒在多基因表達分析、蛋白質多元分析、高通量篩選、多通道生物學測定、醫學診斷學和組合化學等方面都有著廣闊的應用前景。圖1為多色光學編碼矽殼納米棒(實施例中第c種矽殼納米棒)的透射電子顯微鏡成像圖；圖2為實施例中製備的七種多色光學編碼矽殼納米棒的螢光發射光譜圖；圖3為由活體螢光成像儀所拍攝到的七種多色光學編碼矽殼納米棒的螢光成像圖；其中每種矽殼納米棒所發出的螢光顏色在RGB顏色模式下的色值如下納米棒a的顏色(R:101，G:192，B:107);納米棒b的顏色(R:250,G:230,B:87);納米棒c的顏色(R:254，G:190,B:59);納米棒d的顏色(R:245,G:166，B:44);納米棒e的顏色(R:247,G:139，B:27);納米棒f的顏色(R:255，G:119,B:22);納米棒g的顏色(R:255，G:119，B:10)。具體實施方式實施例一種多色光學編碼矽殼納米棒，通過以下方法製備得到(1)將分子量為715萬的多聚賴氨酸溶解在pH8.3,0.1mol/L的碳酸氫鈉溶液中，配成40mg/mL的溶液A;將5-羧基四甲基羅丹明琥珀醯亞胺酯(5-TAMRA,SE)用無水二甲亞碸(DMSO)溶解，配製成9.0x1(T3mol/L的溶液B;取30pl溶液B加入到270pl溶液A中，迅速攪拌均勻，在室溫下持續輕微攪拌2h，用0.15mol/L的NaCl溶液透析除去過量的染料，再加入pH9.2,0.1mol/L的碳酸鹽緩衝液補足1250nl，得到溶液C;(2)取螢光素異硫氰酸酯(FITC)溶於無水DMSO中，分別配製成7.6xl(^mol/L、3.8xl0-4mol/L、1.9x10-4mol/L、9.5x10-5mol/L、4.8xl(T5mol/L的不同濃度的FITC/DMSO溶液；取45pl溶液A，加入162pl、pH值9.2、0.1mol/L的碳酸鹽緩衝液和23pl7.6xl0"4mol/LFITC/DMSO得到溶液a1;另取207pl溶液C，加入23plDMSO得到溶液g1;再取五個管，各加入207nl溶液C，然後在各管中分別加入7.6xl(^mol/L、3.8xl0"4mol/L、1.9xl(T4mol/L、9.5x10-5mol/L、4.8xl(T5mol/L的FITC/DMSO溶液，分別得到溶液bi、Cl、d卜ei、f1;將得到的溶液a廣gi在室溫下持續輕微攪拌3h，分別用0.15mol/L的NaCl溶液和超純水透析除去過量的FITC染料，得到溶液a2~g2;(3)在七個具塞廣口瓶中各加入環己垸7.5mL、表面活性劑曲拉通X-1001.8mL和正己醇1.8mL，混合均勻，加入400pL水作為分散相，攪拌均勻後形成反相微乳液，將溶液a2g2分別加入上述七個瓶中，攪拌均勻後加入200正矽酸乙酯和200質量分數為25~28%的氨水，反應24h後加入乙醇破乳，離心收集納米棒，依次用乙醇、水洗滌收集到的納米棒，由此可製得一套包含七種類型的多色光學編碼矽殼納米棒(ag)。(其中b~f為本發明的多色光學編碼矽殼納米棒)用透射電子顯微鏡來觀察製備得到的多色光學編碼矽殼納米棒的形貌(納米棒c)，得到如圖1所示的一個具有代表性的成像圖，由圖可見，該納米顆粒呈棒狀、有明顯的核殼結構，長度主要分布在100200nm之間，寬度約為70nm，殼厚度約為25nm，顆粒分散性好。用螢光分光光度計在相同的激發波長(460nm)下，對納米棒ag的發射光譜進行測定，如圖2所示，由圖可見，僅用一種激發波長就能有效激發出納米棒ag的螢光，各納米棒在520nm與580nm的發射峰的比值隨著FITC與TAMRA投料比的減小而減小，該比值可以用於編碼。用活體螢光成像儀以藍光同時對納米棒ag進行激發來觀察它們的螢光，如圖3所示，由圖3可見，僅用一個波長的光就能有效激發出各個納米棒的螢光，螢光強、各顆粒所激發出的螢光隨著FITC與TAMRA投料比的減小而由綠色逐漸過渡到橙紅色，這些不同的顏色也可以用來進行光學編碼。權利要求1、一種多色光學編碼矽殼納米棒，其特徵在於所述多色光學編碼矽殼納米棒為核殼型結構，其外殼材料為二氧化矽，內核材料為螢光編碼的多聚賴氨酸，螢光編碼的多聚賴氨酸含有螢光染料A和螢光染料B，螢光染料A和螢光染料B是螢光共振能量轉移供體-受體對；所述螢光編碼的多聚賴氨酸是螢光染料A和螢光染料B通過其各自所帶有的活性基團與多聚賴氨酸的胺基共價連接而成。2.根據權利要求1所述的多色光學編碼矽殼納米棒，其特徵在於所述螢光共振能量轉移供體-受體對為下述各螢光染料配對組合中的任意一種組合l:螢光染料A為螢光素異硫氰酸酯，螢光染料B為四甲基羅丹明異硫氰酸酯；組合2:螢光染料A為羧基螢光素琥珀醯亞胺酯，螢光染料B為羧基羅丹明6G琥珀醯亞胺酯；組合3:螢光染料A為羧基羅丹明6G琥珀醯亞胺酯，螢光染料B為羧基-X-羅丹明琥珀醯亞胺酯；組合4:螢光染料A為螢光素異硫氰酸酯，螢光染料B為5-羧基四甲基羅丹明琥珀醯亞胺酯；組合5:螢光染料A為Cy2,NHS，螢光染料B為Cy3,NHS;組合6:螢光染料A為Cy3，NHS，螢光染料B為Cy5，NHS;組合7:螢光染料A為AlexaFluor488dye,SE，螢光染料B為AlexaFluor555dye，SE;組合8:螢光染料A為AlexaFluor555dye,SE，螢光染料B為AlexaFluor647dye,SE;組合9:螢光染料A為BODIPYTR，SE，螢光染料B為BODIPY650/655-X,SE。3.根據權利要求l.所述的多色光學編碼矽殼納米棒，其特徵在於所述活性基團為異硫氰酸酯基或琥珀醯亞胺酯基。4.一種如權利要求1~3中任意一項所述的多色光學編碼矽殼納米棒的製備方法，其特徵在於將螢光染料A和螢光染料B與多聚賴氨酸反應製備螢光編碼的多聚賴氨酸，以螢光編碼的多聚賴氨酸為內核材料用反向微乳液法將其包裹在二氧化矽基質中製備成多色光學編碼矽殼納米棒。5.根據權利要求4所述的製備方法，其特徵在於具體包括以下步驟(1)螢光編碼多聚賴氨酸的製備將螢光染料A和螢光染料B按要求的比例同時或依次與多聚賴氨酸在碳酸鹽緩衝液中於室溫下反應2~3h，用透析法除去過量的螢光染料，製得螢光編碼的多聚賴氨酸；(2)編碼多聚賴氨酸的包殼將7.2~7.5體積的環己垸、1.61.8體積的表面活性劑曲拉通X-100和1.61.8體積的正己醇混合均勻，往混合液中加入0.4~0.8體積的水作為分散相，攪拌均勻後形成反相微乳液；加入0.2-0.6體積4.0xl(rs8.0xl0"4mol/L的螢光編碼多聚賴氨酸的水溶液，攪拌均勻後再加入0.2~0.4體積的正矽酸乙酯和0.1~0.2體積的氨水，反應20~24h後加入丙酮或乙醇破乳，離心收集納米棒並洗滌，最後得到多色光學編碼矽殼納米棒。6、根據權利要求5所述的製備方法，其特徵在於所述碳酸鹽緩衝液的濃度為0.01~0.1mol/L。7、根據權利要求6所述的製備方法，其特徵在於當螢光染料的活性基團為異硫氰酸酯基時，碳酸鹽緩衝液的pH值為9.09.5;當螢光染料的活性基團為琥珀醯亞胺酯基時，碳酸鹽緩衝液的pH值為8.0~8.5。8、根據權利要求4~7中任意一項所述的製備方法，其特徵在於當螢光染料A與螢光染料B所帶的活性基團不同時，將螢光染料A與螢光染料B依次與多聚賴氨酸反應製備螢光編碼的多聚賴氨酸。全文摘要本發明公開了一種多色光學編碼矽殼納米棒，該多色光學編碼矽殼納米棒為核殼型結構，其外殼材料為二氧化矽，內核材料為螢光編碼的多聚賴氨酸，螢光編碼的多聚賴氨酸含有螢光染料A和螢光染料B，螢光染料A和螢光染料B是螢光共振能量轉移供體-受體對。本發明還公開了一種多色光學編碼矽殼納米棒的製備方法，它是將螢光染料A和螢光染料B與多聚賴氨酸反應製備螢光編碼的多聚賴氨酸，以螢光編碼的多聚賴氨酸為內核材料採用反向微乳液法將其包裹在二氧化矽基質中製備成多色光學編碼矽殼納米棒。本發明的多色光學編碼矽殼納米棒具有螢光強、生物相容性好、親水性好、染料洩露少、性質穩定等優點。文檔編號C09K11/07GK101333436SQ200810032009公開日2008年12月31日申請日期2008年8月6日優先權日2008年8月6日發明者何曉曉,王柯敏,秦迪嵐,譚蔚泓申請人:湖南大學