一種新型抗腫瘤血管生成多肽的製作方法

2023-12-10 07:28:17 1

專利名稱：：一種新型抗腫瘤血管生成多肽的製作方法
技術領域：
：本發明涉及抗腫瘤藥物的研究，尤其是涉及一種新型抗腫瘤血管生成多肽。
背景技術：
：血管生成是在原有血管內皮細胞基礎上形成新血管的自然過程。血管生成在腫瘤生長和轉移過程中起著非常重要的作用，不僅可以為腫瘤生長和轉移提供必需的氧氣和營養物質，而且還可以帶走所產生的代謝廢物。許多與腫瘤血管生成相關的生長因子已經被鑑定出來，包括鹼性呈纖維生長因子(bFGF)、表皮生長因子(EGF)、血管內皮生長因子(VEGF)、胎盤生長因子、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、以及血管生成素(Ang)等。目前腫瘤血管生成相關因子的研究主要集中於VEGF家族和Ang家族。VEGF家族及其受體VEGFR在生理及病理性的血管與淋巴管的形成過程中起著非常重要的作用。VEGF家族包括六個成員，即VEGF-A,VEGF-B,VEGF-C,VEGF-D,VEGF-E和PIGF。在腫瘤血管生成的過程中，VEGF-A是最重要的調節者。VEGF-A是一個同源二聚體蛋白，能夠被選擇性地切割成為分別含有121、145、165、189和206個胺基酸殘基的片段。研究表明VEGF165在內皮細胞增殖、遷移和管狀形成過程中起著關鍵作用，VEGF165產生的信號優先通過酪氨酸激酶受體VEGFR-2(KDR)進行轉導，並且能夠通過與內皮細胞膜上的NRP-I相互作用形成包含VEGF165、KDR和NRP-I的三聚體複合物，從而使其信號轉導作用顯著增強。血管內皮細胞上另一個重要的特異性酪氨酸激酶受體是Tie-2，其通過與配體Ang-I和Ang-2結合來調節血管生成的功能。Ang-I是一個活性配體，它不僅能夠誘導Tie_2磷酸化，而且可以促進內皮細胞生存、遷移和血管穩定。Ang-2是Ang-I的天然拮抗劑，能夠抑制Tie-2的作用，從而導致血管去穩定。此外，研究表明同時抑制由VEGFR-2和Tie_2介導的信號通路比單獨抑制其中一條通路有更強的維持正常血管及腫瘤相關血管完整和穩定的能力。因此，理想的抗血管生成療法可能需要同時抑制VEGFR-2和Tie-2介導的信號通路，從而能夠顯著抑制腫瘤的生長和轉移。近年來，通過噬菌體展示文庫技術已經鑑定出許多內源性多肽，這些多肽在血管生成過程中起著重要的作用，其中包括兩條七肽，即ATWLPra(Vl)和NLLMAAS(V2)。ATWLPI3R通過與NRP-I特異性結合併選擇性抑制VEGF165與NRP-I結合來實現其體內外抗血管生成活性，從而抑制腫瘤的生長和轉移。而NLLMAAS則能夠以劑量依賴的方式來抑制Ang-I和Ang-2與Tie-2的結合併抑制Ang-I誘導的ERK活性，體內試驗表明NLLMAAS能夠抑制雞胚尿囊膜上的血管生成。因此，ATWLPPR、NLLMAAS及其它們的衍生物可能成為發展新型抗腫瘤血管生成和治療其他血管疾病的良好藥物。
發明內容本發明的目的在於提供一種能夠顯著抑制移植瘤生長和轉移的新型抗腫瘤血管生成多肽。為實現上述目的，本發明可採取下述技術方案本發明所述的新型抗腫瘤血管生成多肽，由17個胺基酸殘基組成，分子量為1683，胺基酸序列為Ala-Thr-Trp-Leu-Pro-Pro-Arg-Ala-Ala-Asn-Leu-Leu-Met-Ala-Ala-Sero所述多肽(V3肽)由Vl肽和V2肽通過柔性連接子Ala-Ala構建而成；所述Vl肽的胺基酸序列為Ala-Thr-Trp-Leu-Pro-Pro-Arg，分子量為840；所述V2肽的胺基酸序列為Asn-Leu-Leu-Met-Ala-Ala-Ser,分子量為717。本發明的優點在於首次將兩條具有抗血管生成活性的多肽，即Vl肽(ATWLPPR)和V2肽(NLLMAAS)通過柔性連接子Ala-Ala連接起來，從而構建一條新的多肽V3(ATffLPPRAANLLMAAS)。研究表明V3肽能夠顯著抑制S180和H22移植瘤的生長，並且隨著濃度的提高，抑瘤效果逐漸增強，呈現出明顯的劑量依賴性。此外，隨著V3肽濃度的升高，裸鼠移植瘤中的微血管數目逐漸減少，亦表現出一定的劑量依賴性。在相同濃度下，與VI、V2及V1+V2組相比，V3肽能夠表現出更強的抗腫瘤生長與抗腫瘤血管生成能力。同時，V3肽對裸鼠免疫系統及重要臟器無明顯毒性，給藥期間對裸鼠的體重增加沒有明顯影響。提示V3肽能夠成為一種有效的抗腫瘤候選藥物，從而為進一步的臨床研究與應用奠定堅實的基礎。圖1、圖2、圖3分別是V1、V2、V3肽的質譜鑑定圖。圖4al、圖4a2、圖4bl、圖4b2分別為裸鼠接種S180肉瘤與H22肝癌細胞前後對比圖。圖5al、圖5a2、圖5bl、圖5b2、圖5cl、圖5c2分別為VI、V2、V1+V2、V3肽對BALB/c裸鼠S180和H22移植瘤生長的影響示意圖。圖6al、圖6a2為BALB/c裸鼠皮下給藥VI、V2、V1+V2、V3肽7天的體重變化曲線圖。圖6bl、圖6b2為各組裸鼠在試驗開始和第七天的體重圖。圖7為顯微鏡下各組裸鼠腫瘤組織HE染色結果圖。圖8a為顯微鏡下各組移植瘤⑶34免疫組化染色結果圖。圖8bl、圖8b2為各組移植瘤中的微血管密度圖。具體實施例方式本發明所述的新型抗腫瘤血管生成多肽，該多肽由17個胺基酸殘基組成，分子量為1683，胺基酸序列為Ala-Thr-Trp-Leu-Pro-Pro-Arg-Ala-Ala-Asn-Leu-Leu-Met-Ala-Ala-Sero多肽(V3)由Vl肽和V2肽通過柔性連接子Ala-Ala構建而成；Vl肽的胺基酸序列為Ala-Thr-Trp-Leu-Pro-Pro-Arg，分子量為840；V2肽的胺基酸序列為Asn-Leu-Leu-Met-Ala-Ala-Ser，分子量為717；見表1。表1VI、V2、V3肽序列及其分子量tableseeoriginaldocumentpage5實驗方法和結果1、V1、V2、V3肽採用標準Fomc固相有機合成法進行合成。首先通過樹脂與目的多肽的第一位帶保護基的胺基酸在一定條件下進行縮合，隨後脫掉保護基，加入第二個胺基酸進行縮合。重複以上步驟，直到加入最後一個胺基酸，脫掉其保護基後，利用切割試劑把多肽從樹脂上切下得到粗肽。經過脫鹽處理，RP-HPLC分析純化，其純度大於95%，得到精肽。ESI-MS質譜分析並證實其分子量符合理論值。V1、V2、V3肽的質譜鑑定結果分別見圖1、圖2、圖3。2、建立裸鼠移植瘤模型。S180肉瘤與H22肝癌細胞接種於昆明小鼠腹腔，5-7天後無菌條件下抽取荷瘤小鼠乳白色腹水，0.2%臺盼蘭染色檢測細胞成活率>95%。用PBS洗滌3次後，常規培養於含10%胎牛血清和100IU/ml青黴素、100μg/ml鏈黴素的RPMI-1640培養基中，置於37°C，5%CO2及飽和溼度的培養箱中進行培養，每2-3天更換新培養基。當S180與H22細胞體外培養至對數生長期時，製成細胞懸液並用生理鹽水(NS)將細胞濃度調整至IXIO7個細胞/mL，常規消毒後將0.2mL細胞懸液(含2X106個細胞)接種於每隻裸鼠右前肢腋窩皮下，持續觀察皮下瘤體生長情況。S180肉瘤與H22肝癌細胞接種裸鼠後，經過1_2天潛伏期，可見皮下移植瘤出現，呈圓形或橢圓形結節，成瘤率為100%。大約7天左右，腫瘤直徑長至1.5-2.Ocm。裸鼠移植瘤早期為橢圓形，表面光滑，後期呈不規則形，有的表面可見結節呈菜花樣，富含血管。接種S180組裸鼠和接種H22組裸鼠相比，H22組裸鼠腫瘤生長較快，成瘤力較高。S180肉瘤與H22肝癌細胞接種前後裸鼠活動狀態分別見圖4al、圖4a2、圖4bl、圖4b2。3.裸鼠荷瘤實驗。接種後24h，分別將接種有S180肉瘤和H22肝癌細胞的裸鼠按體重隨機分為7組，每組8隻陰性對照組(生理鹽水NS)，陽性對照組Vl(320μg/kg/d)，陽性對照組V2(320μg/kg/d)，陽性對照組V1+V2(320μg/kg/d)，V3低劑量組(160μg/kg/d)，V3中劑量組(320μg/kg/d)，V3高劑量組(480μg/kg/d)，各組均採用皮下注射，給藥體積按照0.lmL/10g進行，共給藥7天，實驗期間裸鼠自由進食和飲水。每日測量裸鼠體重及腫瘤的長(a)短(b)徑，並按公式體積=π/6XaXb2計算腫瘤體積並繪製腫瘤生長曲線，如圖5al、圖5bl。裸鼠處死後，取出腫瘤並稱重，按下列公式計算腫瘤生長抑制率，腫瘤生長抑制率(Inhibitionrate,IR)=(1_給藥組平均瘤重/陰性對照組平均瘤重)X100%。裸鼠腫瘤體積增長曲線見圖5a2、圖5b2，腫瘤質量及各組藥物抑瘤率見圖5a3、圖5b3。結果表明，第一次給藥開始前對裸鼠腫瘤體積進行測量，各組之間統計學差異不顯著(P>0.05)。實驗期間，每日測量各組裸鼠腫瘤體積，實驗結束後，完整取出腫瘤。與陰性對照組相比，V3肽能夠顯著抑制S180和H22移植瘤生長(P<0.01)，隨著V3肽濃度的提高，抑瘤作用逐漸增強，在3180移植瘤模型中，160、320、48(^8/1^V3肽的抑瘤率分別為41.5%、48·0%、52·6%，而在Η22移植瘤模型中，160、320、480μg/kgV3肽的抑瘤率分別為36.0%、45.5%、56.8%，均呈現出明顯的劑量依賴性。在320μg/kg這一濃度下，與VI、V2和V1+V2肽相比，V3肽具有更強的抗腫瘤活性(P0.05)。在實驗期間，各組裸鼠體重均緩慢增長，但在S180和H22裸鼠移植瘤模型中，V3高劑量組裸鼠體重增加值均最低。在H22裸鼠移植瘤模型中，與陰性對照組相比，V3高劑量組裸鼠體重增加值有顯著性差異(P0.05)。這些結果表明，除V3高劑量組有輕微毒性外，其餘各組無明顯毒性。表2荷S180棉植瘤裸鼠皮下給藥7天後的白細胞數目和相對器官重量tableseeoriginaldocumentpage6表3荷H22移植瘤裸鼠皮下給藥7天後的白細胞數目和相對器官重量tableseeoriginaldocumentpage75.病理組織學檢查。裸鼠處死後取出腫瘤組織，經10%甲醛固定，做常規石蠟包埋，連續切片。切片厚度4μπι，HE染色，顯微鏡下觀察病理組織學改變並拍照，各組裸鼠腫瘤組織HE染色結果見圖7在移植瘤中出現中央壞死現象，隨著V3肽濃度的提高，壞死區域逐漸增大。對心、肝、脾、肺、腎也用同樣的方法進行了HE染色和病理學分析，各組藥物均沒有發現對這些臟器具有損傷作用。6.微血管密度(MVD)測定。採用鏈黴菌抗生素蛋白_過氧化酶連接法，即S-P法進行CD34免疫組化來檢測腫瘤組織中的微血管密度。計數方法每張染色切片先在低倍鏡下(Χ40)選擇微血管密度最高的腫瘤區域，即所謂的「熱點」，然後在200倍視野下隨機計數3個視野內微血管數，再求其平均值為微血管密度。計數時管腔直徑50μm或管壁含有肌層者不作為微血管計數，另外單個染色細胞或成群無管腔的染色細胞也作為獨立微血管計數。CD34免疫組化染色結果見圖8a，微血管內皮細胞與CD34抗體發生特異性反應，在顯微鏡下可觀察到其被染成棕色；移植瘤中MVD計數結果見圖8bl、圖8b2。結果顯示，與陰性對照組相比，VI，V2，V1+V2組中微血管密度較低(P<0.05)，V3低、中、高劑量組微血管密度逐漸降低，呈現出劑量依賴性。在320μg/kg這一濃度下，與VI，V2，V1+V2組相比，V3組微血管密度更低，具有統計學差異(P<0.05)，提示V3肽具有更強的抗腫瘤血管生成活性。權利要求一種新型抗腫瘤血管生成多肽，其特徵在於該多肽由17個胺基酸殘基組成，分子量為1683，胺基酸序列為Ala-Thr-Trp-Leu-Pro-Pro-Arg-Ala-Ala-Asn-Leu-Leu-Met-Ala-Ala-Ser。2.根據權利要求1所述的新型抗腫瘤血管生成多肽，其特徵在於所述多肽由VI肽和V2肽通過柔性連接子Ala-Ala構建而成；所述VI肽的胺基酸序列為Ala-Thr-Trp-Leu-Pro-Pro-Arg，分子量為840；所述V2肽的胺基酸序列為Asn-Leu-Leu-Met-Ala-Ala-Ser,分子量為717。全文摘要本發明公開了一種新型抗腫瘤血管生成多肽，分子量為1683，胺基酸序列為ATWLPPRAANLLMAAS。該V3肽由V1肽和V2肽通過柔性連接子Ala-Ala構建而成；V1肽的序列為ATWLPPR；V2肽的序列為NLLMAAS。本發明的優點在於首次將兩條具有抗血管生成活性的多肽連接成新的多肽V3。V3肽能夠顯著抑制移植瘤的生長，隨著濃度的提高，抑瘤效果逐漸增強，呈現出明顯的劑量依賴性。且隨著V3肽濃度的升高，裸鼠移植瘤中的微血管數目逐漸減少，表現出一定的劑量依賴性。在相同濃度下，V3肽能夠表現出更強的抗腫瘤生長與抗腫瘤血管生成能力。同時，V3肽對裸鼠免疫系統及重要臟器無明顯毒性，為進一步的臨床研究與應用奠定堅實的基礎。文檔編號C07K7/08GK101830971SQ20101017222公開日2010年9月15日申請日期2010年5月14日優先權日2010年5月14日發明者吳東棟,康巧珍,王海麗,祁元明,翟明霞,陳鯉翔,高豔鋒申請人:鄭州大學