一種雜交瘤細胞無血清高密度懸浮灌流培養工藝的製作方法
2023-12-10 03:18:16 1
專利名稱：一種雜交瘤細胞無血清高密度懸浮灌流培養工藝的製作方法
技術領域：
本發明屬於細胞工程領域的細胞工程技術，主要涉及雜交瘤細胞大規模培養及重組蛋白抗體生產，具體涉及一種雜交瘤細胞無血清高密度懸浮灌流培養工藝。
背景技術：
動物細胞培養工藝是動物細胞表達生物技術產品的生產工藝。這種工藝的研究， 是利用動物細胞的生物代謝過程，對其進行控制，解決工藝過程的共性與特性問題。該工藝研究的主要學科基礎是細胞生物學和生物化學工程。相關的學科有遺傳學、免疫學、分子生物學、生物化學、微生物學、化學工程學、應用物理和電子計算機等。它是一門由多學科基礎綜合組成而新興的生物技術。因此，從事該項技術研究開發的人員，要儘可能掌握較全面的知識，並強調各相關學科之間的密切聯繫。動物細胞培養工藝在醫藥工業中的應用，主要是對在基礎研究中獲得的有價值的產品細胞株加以開發，對細胞株進行優化篩選，解決細胞本身的穩定性、產物與表達產量等問題。建立相關的質量標準，在運用工程技術手段，對產品細胞進行放大，工藝研究，以獲得高效、高產量的生物醫藥產品。目前，在動物細胞工業化生產蛋白治療藥物中，較為成熟的工藝有流加培養工藝、 灌流培養工藝、批式培養工藝和反覆批式培養工藝。其中流加培養和灌流培養，是當前動物細胞培養中佔有主導優勢的工藝方式。1996年1月至2002年12月，在美國獲得批准的生物技術藥物的診斷和治療製劑產品共31種，其中用哺乳動物細胞培養生產的重組蛋白治療藥物的就有21種。在21種產品中，應用最多的動物細胞為CHO、SP2/0和NSO細胞。這些重組治療藥物主要是重組蛋白和抗體。在美國獲得批准產品的工藝應用中，最有代表性的需求是生產產量與質量；其培養工藝的生產形式，至少有70%的是採用攪拌式懸浮培養生物反應器系統；50%以上採用無血清培養條件。除了傳統的批式和流加生物反應器培養用於在重組細胞中生產治療性蛋白，恆化和高密度灌流生物反應器被應用于越來越多哺乳動物細胞培養過程中，因為包含幾個重要優點第一，不斷添加新鮮的培養基並且通過稀釋除去代謝副產物，如氨和乳酸(5，6)。第二，通過哺乳動物細胞外泌重組蛋白(相比於非外泌外源蛋白的細菌)無需等待批式培養結束後細胞破碎獲取分泌蛋白產品，在過程中通過灌流可以連續不斷獲得產物。第三，相對於不斷重複的批式培養過程，灌流培養可以保留對數生長期內的細胞， 以提高細胞活性和產能。第四，通過保留更多的活細胞，通過截流裝置，細胞可以達到一個非常高的密度， 同時帶白質的產率與細胞密度成正比，那麼維持高的細胞密度就可以在灌流後期獲得相對高的蛋白質產率。接下來，在細胞生長速率普遍低下的高密度灌流培養過程中，許多雜交瘤細胞系展現出高的比生產速率(單細胞)，從而使得蛋白質生產率顯著提高。最後，蛋白質在灌流生物反應器內短暫的停留時間的有利於儘量減少他們與死亡細胞釋放並積累蛋白酶，唾液酸酶及其他降解酶反應的時間，維持蛋白活性及產量。下表介紹灌流細胞培養產品發展的過程第一次工業規模灌流過程在20世紀80年代末，centocor生產用於治療敗血症的抗體藥物entoxin。在1991年，該藥品被核准在歐洲上市。但是在美國Centoxin未能通過臨床試驗隨後停產。Centocor後來研發reopro並獲得生產許可，並在1994年使用灌流技術大規模生產。同年Genzyme獲得Cerezyme生產許可並採用灌流工藝進行生產。還有其它灌流培養產品，如 Gonal-F(Serano)，Remicade (Centocor), Refacto (Wyeth)，Kogenate-FS (Bayer)，和 Zigris(Eli-Lily)不斷的上市。如表1所示，灌流培養生產的產品有龐大的市場。銷售灌流培養為基礎的藥物意義重大，他們是數百萬美元的藥物。remicade是一種年產上百公斤的單克隆抗體，年銷售額達到15億美元。表1 灌流系統生產的用於市場的藥品
ProductCompanyYearSales(SM/year)CentoxinCentocor1991n/aCerezymeGenzyme1994740ReoProCentocor1994400Gonal-FSerono1997600RemicadeCentocor19981500ReFactoWyeth2000224Kogenate-FSBayer2000424ZigrisEli Lilly2001160值得注意的是，單克隆抗體的生產在雜交瘤細胞中長期連續生物反應器培養時存在不穩定現象。不過，這種在緩慢生長的雜交瘤細胞中逐漸產生的不穩定的抗體與重組細菌表達快速產生的不穩定異源蛋白有相當顯著的差異。在哺乳動物細胞中生產的蛋白質會逐步損失，灌流生物反應器培養仍有足夠的穩定時間，這個時間也許超過數周或數月，同時在類似規模的生物反應器相對於批式培養可以生產更多的蛋白質。因此，如果在灌流工藝條件下蛋白質穩定性能夠得以保證，那麼灌流生物反應器培養將成為一種優越的哺乳動物細胞大規模生產治療性蛋白的運作模式。近些年，由於市場規模的擴大，灌流培養工藝由於其規模的限制，而逐步被流加培養工藝所取代。但是在抗體製備及藥品研發階段，灌流培養工藝仍因其獨到之處而存在著廣泛的應用價值。應用常規培養設備加裝內部或外部高效穩定的截留裝置，可以使得灌流培養在中試規模的發酵罐中獲得工業化生產規模的培養體積。而且通過工藝參數優化，尤其是高密度培養條件下的灌流參數優化，在維持高密度培養的情況下，同等條件下灌流培養工藝的產率遠高於流加培養，從而得到更多更好的產品。因而高效的灌流模型的開發成為了目前本領域的研究重點。Ozturk等人介紹了一種關於細胞灌流速率的理念，細胞特異性灌流速率(CSPR)。 通過應用底物產物平衡公式，設計、優化、控制灌流生物反應器。D 『 (S0-S) = qs · XD · (P-P0) = qp · X其中D是稀釋率，X是活細胞密度，S，P是底物和產品濃度；S。和Po分別為他們的起始濃度；qs和、表示底物利用速率和產物合成速率。將CSPR定義為CSPR = D/X，變換質量平衡方程為S = S0-qs/CSPRP = P0+qp/CSPR因此，如果csra作為一個常數，並且細胞活力不隨時間和細胞密度改變，那麼 CSI^R可以用於高密度生物反應器培養基組分衡定的操作控制，從而優化連續生產。使用csra模式控制的灌流生物反應器成功放大應用於中試規模。高度自動化的生物反應器控制系統使用光學密度電極監測細胞密度，實時測量氧消耗速率並結合測量對活細胞密度和細胞活力進行預估。然而該模式下運行的成本相對較高，對監測設備有相當高的要求。雜交瘤細胞在生長過程中對pH及滲透壓等環境參數十分敏感。鑑於其在融合階段所採用的細胞的特性，大規模高密度的細胞培養面臨著一系列的挑戰。我們知道在細胞培養過程中，葡萄糖作為主要碳源及能源物質，被連續攝入並且代謝，而代謝副產物乳酸對於培養環境的PH有巨大影響。在糖酵解代謝過程中，葡萄糖分解產生丙酮酸，在不完全氧化的情況下，生成乳酸。乳酸的大量堆積超過NaHCO3緩衝液的緩衝能力後，導致pH顯著下降。在培養過程中具體表現為細胞對數生長期葡萄糖濃度的急劇下降和PH的下降成正比例關係。在細胞大規模培養過程PH是非常重要的過程參數，其主要調控手段包括關聯補充 C02及NaOH進行酸鹼調控。而流加培養中也採用降低培養環境中葡萄糖濃度的策略，以促進糖酵解過程向完全氧化的方向進行，以降低乳酸的堆積。但是隨著NaOH的不斷加入將導致培養環境滲透壓的上升，同時後期糖消耗量不斷增大，降低糖濃度的代謝調控也將難以實現。而以CSI^R為基礎，結合底物消耗進行灌流培養，在實現低糖濃度培養的基礎上，通過不斷更新培養基，達到移除有害副產物及穩定培養環境的目標。但是以往的灌流培養，灌流培養基成分通常恆定不變，培養過程通過改變灌流速率來實現高密度恆化培養。而高密度培養條件下底物消耗成倍增加，培養狀態難以穩定。
發明內容
本發明的目的在於，提供一種用於雜交瘤細胞高密度培養重組抗體蛋白的無血清高密度懸浮灌流培養工藝，該工藝能夠在較低成本條件下實現細胞大規模高密度培養及抗體蛋白大量表達，同時可滿足抗體藥物生產工藝對於穩定性、可重現性及連續性的要求。為實現上述任務，本發明採用如下的技術解決方案
一種雜交瘤細胞無血清高密度懸浮灌流培養工藝，用於雜交瘤細胞高密度培養製備重組抗體蛋白，通過特異性灌流速率CSI^R計算控制灌流速率，同時通過關鍵產物比消耗速率的計算，在不同時期通過添加葡萄糖及穀氨醯胺濃縮培養基，改變灌流過程中的底物濃度，達到優化細胞生存條件，抑制副產物產出，提高產率。具體包括以下步驟1)用德國貝朗5L攪拌通氣式生物反應器進行雜交瘤細胞培養，起始接種密度 2X105cells/ml ；培養體積不大於4L ；維持培養溫度在37°C;pH在7. 2-6. 8之間；攪拌速率在60-150之間；溶氧濃度在40% -80%之間；2)過程參數檢測可通過在線及離線方式進行，在線檢測參數包括溫度、攪拌速率、 PH值、溶氧濃度、通氣量，離線檢測參數包括細胞密度X、葡萄糖濃度。、穀氨醯胺濃度Sgln 及乳酸濃度P ；3)將雜交瘤細胞復甦後在方瓶、搖瓶中一次傳代擴大培養，待細胞密度達到 0. 8-1. 2X106cells/ml時，轉入5L貝朗通氣攪拌生物反應器中，加入基礎灌流培養基 EX-CELL620-HSF (SAFC, 24621C)；待細胞密度達到1 X 106cells/ml後，起始灌流培養；灌流回收通過IOum內置旋轉截流裝置進行截流回收；檢測細胞密度X、葡萄糖濃度。、穀氨醯胺濃度Sgln及抗體濃度P各參數，維持葡萄糖濃度Sgl。不低於0. 5g/L、穀氨醯胺濃度Sgln不低於0. 5mM ；計算並預估底物消耗，獲得灌流培養基灌流速率，同時通過對灌流培養基內額外補加濃縮流加培養基進行分段控制，二次調整培養基灌流速率；在細胞密度達到3X106cellS/ml後，計算細胞結團率，根據結團率調整攪拌速率，每次增大攪拌速率不超過20rpm/天，最高攪拌速率不超過150rpm，維持結團率不超過 30% ；pH通過培養基灌流調整維持不低於6. 8 ；溶氧始終通過氧氣-空氣調節維持不低於 40% ；培養至細胞活性低於60%回收全部培養上清液，通過親和層析進行抗體回收。所述培養用雜交瘤細胞其批式培養條件下，主要參數比生長速率不高於1. 5CT1， 葡萄糖比消耗速率不高於0. 15g/cells · d· L，穀氨醯胺比消耗速率不高於0. ImM/ cells · d · L，乳酸比生成速率不超過0. ImM/cells · d · L。所述的2種濃縮流加培養基分別為基礎灌流培養基添加50g/L葡萄糖，基礎灌流培養基添加50mM穀氨醯胺。所述的基礎灌流培養基為EX-CELL 620-HSF培養基(SAFC，24621C)。本發明的雜交瘤細胞無血清高密度懸浮灌流培養工藝，通過優化csra培養模型， 建立了一種雜交瘤細胞無血清高密度懸浮灌流培養生產重組抗體蛋白的生產工藝，通過多種參數控制提高批次產出，批次周期20-25天內，細胞密度可達到1-1. 5X 107cells/ml, 最高抗體濃度可達到200j80mg/L，批次產量超過6g。過程控制檢測參數相對簡便，便於操作，且三批次數據顯示批次間差異小，可重複性及連續性強，可應用於抗體藥物商業化生產。
圖1是灌流培養細胞增值活性與抗體量；圖2是灌流培養無血清懸浮培養工藝中葡萄糖濃度及穀氨醯胺濃度；
圖3是灌流培養無血清懸浮培養灌流體積與葡萄糖消耗量及穀氨醯胺消耗量；圖4是灌流培養批次細胞抗體純度(產品還原電泳)；圖中的標記分別表示1_6、 3 批次產品樣品(IOug)，7、Marker (116kD)。圖5是批式培養中細胞密度與比生長速率；圖6是批式培養中比生長速率與葡萄糖比消耗速率；圖7是批式培養中比生長速率與穀氨醯胺比消耗速率；圖8是批式培養中比生長速率與乳酸比生成速率；圖9是本發明的工藝流程圖。以下結合附圖和發明人給出的具體實施方式
對本發明進一步詳細說明。
具體實施例方式針對現有條件及以往細胞大規模培養經驗，申請人對csra灌流培養模型進行了優化並且應用於雜交瘤細胞株(CYL-1結腸癌抗體表達細胞株)。其設計思路是在灌流控制基礎上，通過調節灌流培養基中主要底物(葡萄糖及穀氨醯胺)濃度，一方面避免了流加工藝中批次補加底物造成的底物濃度過高，副產物快速累積，另一方面通過灌流速率及底物流加量的相關控制，避免了大量灌流基礎培養基造成的細胞及產物的損失。在具體計算過程中，主要考量的控制參數為灌流速率及灌流培養基底物濃度，而底物濃度則是由濃縮培養基添加量來控制的。根據反應動力學理論，可以將細胞培養過程分為3個階段，即對數生長階段、平臺穩定階段和混合階段。不同的細胞株具有不同的生長特性，但是其群體生長過程均符合以上分類，差別在於時間的長短和類別數量大小。根據 CSI^R模型，需要在培養過程中分別確定底物比消耗速率及副產物的比生成速率。根據下面的公式，可以得到一個經驗常數，並且放大到5L規模。rs = qs · X = α μ X+β Xrp = qp · X = α ' μ X+β 『 X在擬穩態條件下，a、β為常數，rs、rp分別表示底物消耗速率及產物生成速率，X 表示活細胞密度，μ表示細胞比生長速率。在前期小規模培養中，我們可以模擬該條件下的細胞狀況進行實驗分析，作圖回歸得出不同細胞密度下的a、β常數。然後就可以在培養過程中對底物比消耗速率及副產物比生成速率進行模擬放大計算。而後利用CSI^R模型方程，計算在當前底物消耗量及產物生成量的情況下，調控底物及副產物濃度在適當的範圍。以下是申請人採用雜交瘤細胞CYL-1，該細胞是人結腸癌組織免疫BALB/c小鼠後經脾細胞與小鼠骨髓瘤SP2/0細胞融合後，篩選獲得的雜交瘤細胞株。該細胞能夠穩定表達抗人結腸癌相關抗原的單克隆抗體。本實施例主要通過貝朗B5L生物攪拌通氣式生物反應器，結合內部10 μ m筒形截留裝置，灌流培養後回收培養上清液；後使用擴張柱床技術一步回收純化大規模培養液中的單克隆抗體，經過硫酸銨沉澱及透析後進行分裝凍幹，獲得純度高於90%的抗體製品。其工藝過程參見圖9，主要分以下幾步1、種子細胞株復甦，首先用75cm2培養方瓶進行復甦，復甦後細胞密度約 3-5X105cellS/ml，復甦活性需大於90%，傳代培養2天後按照1 2比例在方瓶中擴大培養；
2、待方瓶培養體積至200ml，接種IL懸浮攪拌培養瓶，起始培養體積400ml，密度約3-5X 105cellS/ml，攪拌轉速不超過IOOrpm, 1 2比例擴大培養；3、待搖瓶體積至800ml，細胞密度達到0. 8-1. 2X 106cells/ml時，接種生物反應器，起始培養體積3L，在後期控制濃縮的營養物及灌流培養基，使細胞持續增長，達到高細胞密度和高產物量；4、回收純化培養液中的單克隆抗體並分裝凍幹。一、生物反應器(1) IL CellSpin細胞培養搖瓶機(IBS公司瑞士)，磁力變速變頻攪拌，適用於各類工程細胞懸浮培養。(2) 5L生物反應器(B. Braun Biotech德國)，無氣泡供氣系統，10 μ m Spinfilter ；細胞連續旋轉過濾器，溫度、pH、攪拌、溶氧PID全自動控制，四氣混合控制供氣系統，溶氧雙參數關聯、回收液流速。二、培養用液的配製1)基礎灌流培養基=EX-CELL 620-HSF 培養基 Q4621C，SAFC)。2)濃縮培養基:EX-CELL 620-HSF培養基添加50g/L葡萄糖和EX-CELL 620-HSF 培養基添加50mM穀氨醯胺。三、細胞的復甦與傳代(1)從生產細胞庫取出CYL-I雜交瘤細胞，置37°C水浴中迅速溶化，移入37°C預熱的基礎灌流培養基中，SOOrpm離心5分鐘，棄上清，重懸細胞於75cm2培養方瓶，細胞密度在 2-3X105cellS/ml，5%二氧化碳下37°C培養箱培養，觀察細胞生長狀態；0)2天內觀察細胞倍增時間及活性，按照1 2比例擴大培養，每個方瓶培養體積不超過20ml ；(3)待方瓶培養體積至200ml，接種IL IBS培養搖瓶中；(4)搖瓶起始培養體積400ml，密度約3X 105cellS/ml，設置轉角45°，攪拌轉速 65rpm，後期可適當增大轉速至70rpm，5%二氧化碳下37°C培養箱培養條件下1 2比例擴
大培養；三、生物反應器大規模培養(一 )培養過程(1)按規程完成生物反應器的安裝、校準和滅菌消毒，連接攪拌電機、pH電極導線、溶氧電極導線、溫度探頭、收液瓶、取樣管等，檢查無誤後，開機；(2)按照標準操作規程補充灌流培養基約2L進入生物反應器內，開機運行48小時，觀察溫度、攪拌速度、pH、溶氧等各項參數穩定狀況；(3)接種細胞，待搖瓶體積至800ml，細胞密度達到1. 1 X 106cells/ml時，接種生物反應器，起始培養體積約3L，起始細胞密度在2. 7X105cells/ml ；(4)起始培養條件溫度37°C，pH7. 2，溶氧控制60%，攪拌速度80rpm，空氣、氧氣、 氮氣和二氧化碳四氣控制系統；(5)每M小時取樣測定細胞密度、葡萄糖濃度、谷醯胺濃度，定期測定抗體濃度變化；(6)參數控制
A)灌流參數控制待細胞密度達到lX106cellS/ml後，起始灌流培養，灌流回收通過IOum內置旋轉截流裝置進行截流回收；根據公式分別計算灌流速率及濃縮培養基添加體積，具體計算及調控方式如下 檢測細胞密度X、葡萄糖濃度、。、穀氨醯胺濃度Sgln及乳酸濃度P ；S = S0-qs/CSPRP = P0+qp/CSPRrp = qs · X = α μ X+β Xrp = qp · X = α ' μ X+β 『 X其中csra定義為csra = D/X、D是稀釋率，X是活細胞密度，r為細胞單位時間單位體積底物消耗量或產物產出量；μ為細胞比生長速率；S，P分別是葡萄糖、穀氨醯胺及乳酸濃度；Stl和Ptl分別為當前濃度；qs和qp表示底物利用速率和產物合成速率；a、β是測定得到的培養常數，可以在小規模實驗中回歸計算得到；工藝過程中計算得出維持葡萄糖濃度不低於0. 5g/L、穀氨醯胺濃度Sgln不低於0. 5mM ；如附圖5所示，在批式細胞培養過程中，收集9天內細胞密度的變化數據，根據細胞對數生長期比生長速率計算公式計算其比生長速率變化趨勢，根據葡萄糖、穀氨醯胺及乳酸的濃度變化，根據分別計算葡萄糖比消耗速率、穀氨醯胺比消耗速率及乳酸比生成速率，然後取細胞對數生長期後的數據，如附圖6-8以比生長速率為χ軸，比消耗或比生成速率為y軸進行散點作圖，後添加趨勢線，回歸得到a、β值。在灌流培養放大階段，可根據當前細胞相對比生長速率進行葡萄糖、穀氨醯胺及乳酸消耗生成量的估算。將乳酸估算值代入csra相關公式，可計算得到灌流速率預期值， 然後根據穀氨醯胺及葡萄糖估算值可計算濃縮培養基添加體積。以添加濃縮培養基的灌流培養基進行灌流培養可在低限度補加底物的情況下，維持低乳酸濃度的培養環境。由於灌流作用，細胞培養環境及其它底物如胺基酸等消耗得到改善，細胞葡萄糖及穀氨醯胺消耗速率也將受到影響，但仍在工藝控制範圍內，仍可維持在設置參數的控制範圍。但隨細胞密度增大，消耗量逐漸增加，估算值也會倍增放大，當細胞密度高於 2X107cellS/ml後，灌流體積及濃縮液添加量將大大超過當前細胞現實消耗比例，造成細胞稀釋及過量添加，這樣將造成培養成本大大增加。同時，灌流速率的增大也將造成截流裝置阻塞，無法維持灌流培養。由此，在後期培養過程中，應在維持濃縮液適量補加的情況下， 降低灌流速率直至培養批次完成。而這樣也可最大程度上回收高濃度的抗體蛋白，達到增加收率的效果。B)攪拌參數控制在細胞密度達到3X106cellS/ml後，計算細胞結團率，即(消化前細胞密度-消化後細胞密度)/消化後細胞密度，根據結團率調整攪拌速率，結團率不超過30 %，每次增大攪拌速率不超過20rpm/天，最高攪拌速率不超過150rpm，；C)pH及溶氧調控pH基本可通過培養基灌流調整維持不低於6. 8 ；溶氧可通過氧氣-空氣調節維持不低於40% ；7)培養至細胞活性低於60%回收全部培養上清液，通過親和層析進行抗體回收。結果1、由圖1可以看出，在培養共進行23天，在培養第15天細胞密度達到最大值 1. 4X107cells/ml，抗體濃度達到 230mg/L。
2、由圖2可以看出，在培養第6天後通過灌流調節，主要底物葡萄糖及穀氨醯胺基本維持在設定區間的範圍內，在維持較低濃度的情況下未超過設定低限。3、由圖3可以看出，培養過程中，底物消耗量在一定時間內程線性增長態勢，細胞達到平臺期後，添加濃縮培養基量降低，由於稀釋作用，表現出消耗量逐步下降，符合方程模型描述。4、由圖4可以看出，在三批次培養過程中所表達的產品均一性、穩定性良好，由此可見本工藝批次間重複性、連續性良好，適用於蛋白抗體等大批量生產。
權利要求
1.一種雜交瘤細胞無血清高密度懸浮灌流培養工藝，其特徵在於，通過特異性灌流速率csra計算控制灌流速率，同時計算關鍵產物比消耗速率，在不同時期添加2種濃縮培養基，改變灌流過程中的底物濃度，達到優化細胞生存條件，抑制副產物產出，提高產率；具體包括以下步驟1)用5L攪拌通氣式生物反應器進行雜交瘤細胞培養，起始接種密度2X105cells/ml； 培養體積不大於4L ；維持培養溫度在37°C ；pH維持7. 2 6. 8之間；攪拌速率在60-150之間；溶氧濃度在40% -80%之間；2)過程參數檢測通過在線和離線方式進行，在線檢測參數包括溫度、攪拌速率、pH值、 溶氧濃度、通氣量；離線檢測參數包括細胞密度X、葡萄糖濃度。、穀氨醯胺濃度Sgln及乳酸濃度P ；3)雜交瘤細胞復甦後，在方瓶、搖瓶一次傳代擴大培養，待細胞密度達到 0. 8-1.2X106cells/ml時，轉入5L通氣攪拌生物反應器中；待細胞密度達到IXlO6Cells/ ml後，起始灌流培養；灌流回收通過IOum內置旋轉截流裝置進行截流回收；檢測細胞密度X、葡萄糖濃度。、穀氨醯胺濃度Sgln及抗體濃度P各參數，維持葡萄糖濃度Sgl。不低於 0. 5g/L、穀氨醯胺濃度不低於0. 5mM ；計算並預估底物消耗，獲得灌流培養基的灌流速率，同時通過對灌流培養基內額外補加濃縮流加培養基進行分段控制，二次調整培養基灌流速率；在細胞密度達到3X106cellS/ml後，計算細胞結團率，根據結團率調整攪拌速率，每次增大攪拌速率不超過20rpm/天，最高攪拌速率不超過150rpm，維持結團率不超過30% ；pH 通過培養基灌流調整維持不低於6. 8 ；溶氧始終通過氧氣-空氣調節維持不低於40%;培養至細胞活性低於60%回收全部培養上清液，通過親和層析進行抗體回收。
2.如權利要求1所述的工藝，其特徵在於，所述培養用雜交瘤細胞其批式培養條件下， 主要參數比生長速率不高於1. 5CT1，葡萄糖比消耗速率不高於0. 15g/cells · d · L，穀氨醯胺比消耗速率不高於0. ImM/cells · d · L，乳酸比生成速率不超過0. ImM/cells · d · L。
3.如權利要求1所述的工藝，其特徵在於，所述的2種濃縮培養基分別為基礎灌流培養基添加50g/L葡萄糖，基礎灌流培養基添加50mM穀氨醯胺。
4.如權利要求3所述的工藝，其特徵在於，所述的基礎灌流培養基為EX-CELL620-HSF 培養基，培養過程中無血清添加。
全文摘要
本發明公開了一種雜交瘤細胞高密度灌流培養生產重組抗體蛋白的生產工藝，該工藝主要針對雜交瘤細胞代謝特徵，篩選特定的培養成份進行灌流培養，在培養過程中充分補充代謝底物同時有效降低代謝副產物濃度，從而達到高效高產的目標。在過程控制方面，通過建立特異性灌流速率CSPR灌流培養計算模型，對培養參數進行實時計算，通過濃縮培養基分段流加，控制灌流速率，在補充葡萄糖及穀氨醯胺重要底物的同時，將副產物對培養的影響降低到最低。適用於雜交瘤細胞大規模培養製備生產用抗體蛋白，能夠在較短時間內提供大量蛋白抗體，且規模小、投資低，能夠在短時間內達到高效產出且批次差異低、可重複性高，能夠達到抗體藥物生產。
文檔編號C12P21/08GK102391995SQ20111037787
公開日2012年3月28日 申請日期2011年11月24日 優先權日2011年11月24日
發明者南剛, 姚西英, 孫秀璇, 屈穎, 張徵, 張陽, 徐力清, 王麗娟, 王彬 申請人:陳志南