用於表達花組織中轉基因的lis啟動子的製作方法

2023-12-10 04:36:41 2

專利名稱：用於表達花組織中轉基因的lis啟動子的製作方法
技術領域：
本發明涉及植物基因工程。更明確地說，本發明涉及一種衍生自S芳樟醇合酶基因的經分離的啟動子，其能夠引導植物的至少一朵花中的可操作性地連結到所述啟動子的至少一個多核苷酸或選定的基因的高水平表達；涉及在植物的至少一朵花中優先表達的轉基因；和含有所述轉基因的轉化植物。
背景技術：
植物組織中轉基因的表達需要存在可操作性連結的啟動子，其在該植物內可起作用。啟動子序列的選擇決定了在植物內表達該(該等)轉基因的時間和地點。在所屬領域中已知許多不同類型的啟動子，如，組成性、可誘導性及組織特異性啟動子。當想要連續的轉基因表達遍及植物的細胞時，使用組成性啟動子(constitutive promoter)。所屬領域中已知的組成性啟動子包括(但不限於)稻子肌動蛋白1(Wang等人，Molecular andCellular Biology，12(8)3399-3406(1992))，美國專利第5,641,876號)、花椰菜花葉病毒(Cauliflower Mosaic Virus)(CaMV)35S RNA(Odell等人，Nature，313810-812(1985))、CaMV 19S RNA(Lawton等人，Plant Mol.Biol，4995-106(1987))、nos(Ebert等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，845745-5749(1987))、Adhl(Walker等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，846624-6628(1987))及類似物。當需要回應於刺激的基因表達時，使用誘導性啟動子。在所屬領域中已知的誘導性啟動子包括(但不限於)脫落酸ABA和膨壓誘導性啟動子、生長素結合蛋白基因的啟動子(Schwob等人，Plant J.，4(3)423-432(1993))、UDP葡萄糖類黃酮糖基轉移酶基因啟動子(Ralston等人，Genet，119(1)185-197(1988))及類似物。當想要在特定組織或器官中表達時，使用組織特異性啟動子。所屬領域中已知的組織特異性啟動子的實例包括(但不限於)凝集素(Vodkin等人，Cell，341023(1983)，Lindstron等人，Developmental Genetics，11160(1990))、豌豆小亞單元RuBP羧化酶(Poulsen等人，Mol.Gen.Genet.，205(2)193-200(1986)，Cashmore等人，Gen.Eng.of Plants，Plenum Press，New York 29-38(1983))、Ti質粒甘露氨酸合酶(plasmidmannopine synthase)(Langridge等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，863219-3223(1989))、矮牽牛花查爾酮異構酶(petunia chalcone isomerase)(Van Tunen等人，EMBO J.，71257(1988))及類似物。
儘管在所屬領域中已知許多不同類型的啟動子，但是需要發現具有有利表達特徵的新型啟動子，例如具有引導轉基因植物中外源基因的高水平表達的能力。

發明內容
在一實施例中，本發明涉及一種編碼啟動子的經分離的多核苷酸。本發明的啟動子能引發植物的至少一朵花中至少一個可操作性連結的多核苷酸或選定的基因的轉錄。此經分離的多核苷酸具有選自由以下各序列組成的群組的序列SEQ ID NO2及在嚴格條件下與SEQ ID NO2雜交的序列。本發明也涵蓋具有上述序列的片段和變體。一序列能與SEQ ID NO2進行雜交的嚴格條件可以是低嚴格條件或高嚴格條件。低嚴格條件包括於42℃在2X SSC、0.5％(w/v)SDS溶液中洗滌30分鐘並且接著重複所述洗滌。高嚴格條件包括於65℃在2X SSC、0.5％(w/v) SDS溶液中洗滌30分鐘並且接著重複所述洗滌。
在另一實施例中，本發明涉及一種包含一編碼啟動子的序列的經分離的多核苷酸，該啟動子較佳在引發植物的至少一朵花中至少一種可操作性連結的多核苷酸或選定的基因的轉錄中具有活性。此經分離的多核苷酸具有選自由以下各序列組成的群組的序列SEQ ID NO2及在嚴格條件下與SEQ ID NO2結合的序列。本發明也涵蓋上述序列的片段和變體。一序列能與SEQ ID NO2進行雜交的嚴格條件可以是低嚴格或高嚴格。低嚴格條件包括於42℃在2X SSC、0.5％(w/v)SDS溶液中洗滌30分鐘並且接著重複所述洗滌。高嚴格條件包括於65℃在2X SSC、0.5％(w/v)SDS溶液中洗滌30分鐘並且接著重複所述洗滌。
在又一實施例中，本發明涵蓋一種包含上述經分離的啟動子的表達盒。本發明的表達盒包含可操作性地連結到多核苷酸序列的上述啟動子。此啟動子能夠引發用所述表達盒轉化的植物的至少一朵花中的所述多核苷酸的轉錄和表達。可操作性地連結到啟動子的多核苷酸以正義或反義方向將插入所述表達盒中。
在又一實施例中，本發明涵蓋包含上述表達盒的表達載體。
在又一實施例中，本發明涵蓋用上述表達盒穩定轉的植物或植物部分。可得以轉化的植物部分包括(但不限於)細胞、原生質體、細胞組織培養物、愈傷組織(callus)、細胞塊、胚芽、花粉、胚珠、花瓣、花柱、雄蕊、葉子、根、根尖和花葯(anther)。可被轉化的植物可以是單子葉或雙子葉植物。單子葉植物的實例包括(但不限於)石蒜科(Amaryllidaceae)(蔥屬(Allium)、水仙屬(Narcissus))；禾本科(Graninae或Poaceae)，(燕麥屬(Avena)、大麥屬(Horedum)、稻屬(Oryza)、黍屬(Panicum)、狼尾草屬(Pennisetum)、早熟禾屬(Poa)、甘蔗屬(Saccharum)、黑麥屬(Secale)、高梁屬(Sorghum)、小麥屬(Triticum)、玉米屬(Zea))。雙子葉植物實例包括(但不限於)夾竹桃科(Apocynaceae)(長春花屬(Catharanthus))；紫菀科(Asteraceae)或菊科(Compositae)(紫菀屬(Aster)、金盞花屬(Calendula)、翠菊屬(Callistephus)、菊苣屬(Cichorium)、金雞菊屬(Coreopsis)、大麗花屬(Dahlia)、菊屬(Dendranthema)、雜色菊屬(Gazania)、非洲菊(Gerbera)、向日葵屬(Helianthus)、蠟菊屬(Helichrysum)、萵苣屬(Lactuca)、金光菊屬(Rudbeckia)、萬壽菊屬(Tagetes)、百日菊屬(Zinnia))；鳳仙花科(Balsaminaceae)(鳳仙花屬(Impatiens))；秋海棠科(Begoniaceae)(秋海棠屬(Begonia))；石竹科(Caryophyllaceae)(石竹類屬(Dianthus))；藜科(Chenopodiaceae)(甜菜屬(Beta)、皂莢(Spinada))；葫蘆科(Cucurbitaceae)(西瓜屬(Citrullus)、南瓜屬(Curcurbita)、甜瓜屬(Cucumis))；十字花科(Cruciferae)(庭薺屬(Alyssum)、芸苔屬(Brassica)、糖芥屬(Erysimum)、紫羅蘭屬(Matthiola)、蘿蔔屬(Raphanus))；龍膽科(Gentinaceae)(洋桔梗(Eustoma))；牻牛兒苗科(Geraniaceae)(天竺葵屬(Pelargonium))；大戟科(Euphorbiaceae)(大戟屬(Poinsettia))；唇形科(Labiatae)(鼠尾草屬(Salvia))；豆科(Leguminosae)(大豆屬(Glycine)、山黧豆屬(Lathyrus)、苜蓿屬(Medicago)、菜豆屬(Phaseolus)、豌豆屬(Pisum))；百合科(Liliaceae)(百合屬(Lilium))；半邊蓮科(Lobeliaceae)(半邊蓮屬(Lobelia))；錦葵科(Malvaceae)(秋葵屬(Abelmoschus)、棉屬(Gossypium)、錦葵屬(Malva))；藍雪科(Plumbaginaceae)(補血草屬(Limonium))；花荵科(Polemoniaceae)(福祿考屬(Phlox))；報春花科(Primulaceae)(仙客來屬(Cyclamen))；毛茛科(Ranunculaceae)(烏頭屬(Aconitum)、銀蓮花屬(Anemone)、耬鬥菜屬(Aquilegia)、驢蹄草屬(Caltha)、翠雀屬(Delphinium)、毛茛屬(Ranunculus))；薔薇科(Rosaceae)(薔薇屬(Rosa))；茜草科(Rubiaceae)(繁星花(Pentas))；玄參科(Scrophulariaceae)(天使花屬(Angelonia)、金魚草屬(Antirrhinum)、倒地蜈蚣屬(Torenia))；茄科(Solanaceae)(辣椒屬(Capsicum)、番茄屬(Lycopersicon)、菸草屬(Nicotiana)、矮牽牛屬(Petunia)、茄屬(Solatium))；傘形科(Umbelliferae)(芹屬(Apium)、胡蘿蔔屬(Daucus)、歐防風屬(Pastinaca))；馬鞭草科(Verbenaceae)(馬鞭草屬(Verbena)、馬櫻丹屬(Lantana))；堇菜科(Violaceae)(堇菜屬(Viola))。
在又一實施例中，本發明也涵蓋由上述含有上述表達盒的植物所產生的種子。
在又一實施例中，本發明涵蓋一種包含嵌合啟動子的表達盒，所述啟動子可操作性地連結到多核苷酸序列。此表達盒中所用的嵌合啟動子包括(a)一第一多核苷酸，其能夠引發植物的至少一朵花中至少一個可操作性連結的多核苷酸或相關的選定的基因的轉錄，其中所述多核苷酸具有選自由以下各序列組成的群組的序列SEQ ID NO2及在嚴格條件下與SEQ ID NO2雜交的序列及其該等序列的片段和變體；及(b)至少一個第二多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列能夠引發植物中多核苷酸序列或選定的基因的轉錄。視情況，造成該嵌合啟動子的第二多核苷酸序列具有選自由以下各序列組成的群組的序列SEQ ID NO2及在嚴格條件下與SEQ ID NO2雜交的序列。這些序列的片段和變體也涵蓋在本發明的範圍內。可將可操作性地與該嵌合啟動子連結的多核苷酸以正義方向或反義方向插入該表達盒中。
在又一實施例中，本發明涉及一種表達載體，其包含一表達盒，包含上述含有該嵌合啟動子的表達盒。
在又一實施例中，本發明涉及植物或植物部分，其通過上述含有該嵌合啟動子的表達盒來得以穩定轉化。可進行轉化的植物部分包括(但不限於)細胞、原生質體、細胞組織培養物、愈傷組織、細胞塊、胚芽、花粉、胚珠、花瓣、花柱、雄蕊、葉子、根、根尖和花葯。能進行轉化的植物可以是單子葉植物或雙子葉植物。單子葉植物的實例包括(但不限於)石蒜科(Amaryllidaceae)(蔥屬(Allium)、水仙屬(Narcissus))；禾本科(Graninae或Poaceae)(燕麥屬(Avena)、大麥屬(Horedum)、稻屬(Oryza)、黍屬(Panicum)、狼尾草屬(Pennisetum)、早熟禾屬(Poa)、甘蔗屬(Saccharum)、黑麥屬(Secale)、高梁屬(Sorghum)、小麥屬(Triticum)、玉米屬(Zea))。雙子葉植物實例包括(但不限於)夾竹桃科(Apocynaceae)(長春花屬(Catharanthus))；紫菀科(Asteraceae)或菊科(Compositae)(紫菀屬(Aster)、金盞花屬(Calendula)、翠菊屬(Callistephus)、菊苣屬(Cichorium)、金雞菊屬(Coreopsis)、大麗花屬(Dahlia)、菊屬(Dendranthema)、雜色菊屬(Gazania)、非洲菊(Gerbera)、向日葵屬(Helianthus)、蠟菊屬(Helichrysum)、萵苣屬(Lactuca)、金光菊屬(Rudbeckia)、萬壽菊屬(Tagetes)、百日菊屬(Zinnia))；鳳仙花科(Balsaminaceae)(鳳仙花屬(Impatiens))；秋海棠科(Begoniaceae)(秋海棠屬(Begonia))；石竹科(Caryophyllaceae)(石竹類屬(Dianthus))；藜科(Chenopodiaceae)(甜菜屬(Beta)、皂莢(Spinada))；葫蘆科(Cucurbitaceae)(西瓜屬(Citrullus)、南瓜屬(Curcurbita)、甜瓜屬(Cucumis))；十字花科(Cruciferae)(庭薺屬(Alyssum)、芸苔屬(Brassica)、糖芥屬(Erysimum)、紫羅蘭屬(Matthiola)、蘿蔔屬(Raphanus))；龍膽科(Gentinaceae)(洋桔梗(Eustoma))；牻牛兒苗科(Geraniaceae)(天竺葵屬(Pelargonium))；大戟科(Euphorbiaceae)(大戟屬(Poinsettia))；唇形科(Labiatae)(鼠尾草屬(Salvia))；豆科(Leguminosae)(大豆屬(Glycine)、山黧豆屬(Lathyrus)、苜蓿屬(Medicago)、菜豆屬(Phaseolus)、豌豆屬(Pisum))；百合科(Liliaceae)(百合屬(Lilium))；半邊蓮科(Lobeliaceae)(半邊蓮屬(Lobelia))；錦葵科(Malvaceae)(秋葵屬(Abelmoschus)、棉屬(Gossypium)、錦葵屬(Malva))；藍雪科(Plumbaginaceae)(補血草屬(Limonium))；花荵科(Polemoniaceae)(福祿考屬(Phlox))；報春花科(Primulaceae)(仙客來屬(Cyclamen))；毛茛科(Ranunculaceae)(烏頭屬(Aconitum)、銀蓮花屬(Anemone)、耬鬥菜屬(Aquilegia)、驢蹄草屬(Caltha)、翠雀屬(Delphinium)、毛茛屬(Ranunculus))；薔薇科(Rosaceae)(薔薇屬(Rosa))；茜草科(Rubiaceae)(繁星花(Pentas))；玄參科(Scrophulariaceae)(天使花屬(Angelonia)、金魚草屬(Antirrhinum)、倒地蜈蚣屬(Torenia))；茄科(Solanaceae)(辣椒屬(Capsicum)、番茄屬(Lycopersicon)、菸草屬(Nicotiana)、矮牽牛屬(Petunia)、茄屬(Solatium))；傘形科(Umbeiliferae)(芹屬(Apium)、胡蘿蔔屬(Daucus)、歐防風屬(Pastinaca))；馬鞭草科(Verbenaceae)(馬鞭草屬(Verbena)、馬櫻丹屬(Lantana))；堇菜科(Violaceae)(堇菜屬(Viola))。
在又一實施例中，本發明還涵蓋由上述植物所產生的種子，這些種子含有上述包含該嵌合啟動子的表達盒。
在又一實施例中，本發明涉及一種經包含啟動子的DNA分子穩定轉化的轉基因植物細胞，所述啟動子能引導植物的至少一朵花中的轉錄。該啟動子包含選自由以下各序列組成的群組的序列的多核苷酸SEQ ID NO2及在嚴格條件下與SEQ ID NO2雜交的序列。這些序列的片段和變體也涵蓋在本發明內。用於轉化該植物細胞的DNA分子進一步包含一可操作性地與所述啟動子連結的選定編碼區。此選定編碼區處於正義方向或反義方向。另外，該選定編碼區可對以下蛋白進行編碼抗昆蟲性蛋白、抗細菌疾病性蛋白、抗真菌疾病性蛋白、抗病毒疾病性蛋白、花青甙生物合成酶、類胡蘿蔔素生物合成酶、花香生物合成蛋白、可篩選的標記蛋白或提升花壽命的蛋白。若選定編碼區對可篩選的標記物進行編碼，則所述可篩選標記物可選自由以下各物組成的群組β-葡糖苷酸酶、β-內醯胺酶、β-半乳糖苷酶、螢光素酶、水母發光蛋白和綠色螢光蛋白。若選定編碼區對花青甙生物合成酶進行編碼，則所述花青甙生物合成酶能夠產生以下化合物天竺葵色素(pelargonidin)、矢車菊色素(cyanidin)、翠花素(delphinidin)、芍藥色素(peonidin)、錦葵色素(malvidin)和矮牽牛素(petunidin)。若選定編碼區對類胡蘿蔔素生物合成酶進行編碼，則所述類胡蘿蔔素生物合成酶能夠產生以下化合物八氫番茄紅素、六氫番茄紅素、ζ-胡蘿蔔素、鏈孢紅素(neurosporene)、番茄紅素、γ-胡蘿蔔素、β-胡蘿蔔素、α-隱黃素、β-隱黃素、角黃素、辣椒紅素、辣椒玉紅素、玉米黃素、堇菜黃素、新葉黃素、花葯黃質、葉黃素和蝦青素、阿東尼紅素(adonirubin)和金盞花黃素(adonixanthin)。
一序列可與SEQ ID NO2雜交的該嚴格條件可以是低嚴格條件或高嚴格條件。低嚴格條件包括於42℃在2X SSC、0.5％(w/v)SDS溶液中洗滌30分鐘並且接著重複所述洗滌。高嚴格條件包括於65℃在2X SSC、0.5％(w/v)SDS溶液中洗滌30分鐘並且接著重複所述洗滌。
在又一實施例中，本發明涉及一種用於選擇性地表達轉基因植物的至少一朵花中第一多核苷酸序列的方法。該方法包括以下步驟用包含一表達盒的表達載體來轉化植物或植物細胞，所述表達盒包含一啟動子和一可操作性地與所述啟動子連結的第一多核苷酸，其中該啟動子能夠引發轉錄並引導植物的至少一朵花中所述第一多核苷酸序列的表達，並且包括具有一選自由以下各序列組成的群組的序列的多核苷酸SEQ ID NO2及在嚴格條件下與SEQ ID NO2雜交的序列。這些序列的片段和變體也涵蓋在本發明的範圍之內。將該第一多核苷酸以正義方向或反義方向插入到該表達盒中。
一序列可與SEQ ID NO2雜交的該嚴格條件可以是低嚴格條件或高嚴格條件。低嚴格條件包括於42℃在2X SSC、0.5％(w/v)SDS溶液中洗滌30分鐘並且接著重複所述洗滌。高嚴格條件包括於65℃在2X SSC、0.5％(w/v)SDS溶液中洗滌30分鐘並且接著重複所述洗滌。
插入該表達盒中的第一多核苷酸序列可編碼以下蛋白抗昆蟲性蛋白、抗細菌疾病性蛋白、抗真菌疾病性蛋白、抗病毒疾病性蛋、花青甙生物合成酶、類胡蘿蔔素生物合成酶、花香生物合成蛋白、可篩選的標記蛋白或提升花壽命的蛋白。若該第一多核苷酸序列對可篩選的標記蛋白進行編碼，則所述可篩選的標記蛋白可選自由以下各物組成的群組β-葡糖苷酸酶、β-內醯胺酶、β-半乳糖苷酶、螢光素酶、水母發光蛋白和綠色螢光蛋白。若該第一多核苷酸序列對花青甙生物合成酶進行編碼，則所述花青甙生物合成酶能夠產生以下化合物天竺葵色素、矢車菊色素、翠花素、芍藥色素、錦葵色素和矮牽牛素。若所述第一多核苷酸序列對類胡蘿蔔素生物合成酶進行編碼，則該類胡蘿蔔素生物合成酶能夠產生以下化合物八氫番茄紅素、六氫番茄紅素、ζ-胡蘿蔔素、鏈孢紅素(neurosporene)、番茄紅素、γ-胡蘿蔔素、β-胡蘿蔔素、α-隱黃素、β-隱黃素、角黃素、辣椒紅素、辣椒玉紅素、玉米黃素、堇菜黃素、新葉黃素、花葯黃質、葉黃素和蝦青素、阿東尼紅素(adonirubin)和金盞花黃素(adonixanthin)。
被轉化的植物或植物細胞可來自於單子葉植物，其包括(但不限於)石蒜科(Amaryllidaceae)(蔥屬(Allium)、水仙屬(Narcissus))；禾本科(Graninae或Poaceae)，(燕麥屬(Avena)、大麥屬(Horedum)、稻屬(Oryza)、黍屬(Panicum)、狼尾草屬(Pennisetum)、早熟禾屬(Poa)、甘蔗屬(Saccharum)、黑麥屬(Secale)、高梁屬(Sorghum)、小麥屬(Triticum)、玉米屬(Zea))。或者，被轉化的植物或植物細胞可來自於雙子葉植物，其包括(但不限於)夾竹桃科(Apocynaceae)(長春花屬(Catharanthus))；紫菀科(Asteraceae)或菊科(Compositae)(紫菀屬(Aster)、金盞花屬(Calendula)、翠菊屬(Callistephus)、菊苣屬(Cichorium)、金雞菊屬(Coreopsis)、大麗花屬(Dahlia)、菊屬(Dendranthema)、雜色菊屬(Gazania)、非洲菊(Gerbera)、向日葵屬(Helianthus)、蠟菊屬(Helichrysum)、萵苣屬(Lactuca)、金光菊屬(Rudbeckia)、萬壽菊屬(Tagetes)、百日菊屬(Zinnia))；鳳仙花科(Balsaminaceae)(鳳仙花屬(Impatiens))；秋海棠科(Begoniaceae)(秋海棠屬(Begonia))；石竹科(Caryophyllaceae)(石竹類屬(Dianthus))；藜科(Chenopodiaceae)(甜菜屬(Beta)、皂莢(Spinada))；葫蘆科(Cucurbitaceae)(西瓜屬(Citrullus)、南瓜屬(Curcurbita)、甜瓜屬(Cucumis))；十字花科(Cruciferae)(庭薺屬(Alyssum)、芸苔屬(Brassica)、糖芥屬(Erysimum)、紫羅蘭屬(Matthiola)、蘿蔔屬(Raphanus))；龍膽科(Gentinaceae)(洋桔梗(Eustoma))；牻牛兒苗科(Geraniaceae)(天竺葵屬(Pelargonium))；大戟科(Euphorbiaceae)(大戟屬(Poinsettia))；唇形科(Labiatae)(鼠尾草屬(Salvia))；豆科(Leguminosae)(大豆屬(Glycine)、山黧豆屬(Lathyrus)、苜蓿屬(Medicago)、菜豆屬(Phaseolus)、豌豆屬(Pisum))；百合科(Liliaceae)(百合屬(Lilium))；半邊蓮科(Lobeliaceae)(半邊蓮屬(Lobelia))；錦葵科(Malvaceae)(秋葵屬(Abelmoschus)、棉屬(Gossypium)、錦葵屬(Malva))；藍雪科(Plumbaginaceae)(補血草屬(Limonium))；花荵科(Polemoniaceae)(福祿考屬(Phlox))；報春花科(Primulaceae)(仙客來屬(Cyclamen))；毛茛科(Ranunculaceae)(烏頭屬(Aconitum)、銀蓮花屬(Anemone)、耬鬥菜屬(Aquilegia)、驢蹄草屬(Caltha)、翠雀屬(Delphinium)、毛茛屬(Ranunculus))；薔薇科(Rosaceae)(薔薇屬(Rosa))；茜草科(Rubiaceae)(繁星花(Pentas))；玄參科(Scrophulariaceae)(天使花屬(Angelonia)、金魚草屬(Antirrhinum)、倒地蜈蚣屬(Torenia))；茄科(Solanaceae)(辣椒屬(Capsicum)、番茄屬(Lycopersicon)、菸草屬(Nicotiana)、矮牽牛屬(Petunia)、茄屬(Solatium))；傘形科(Umbelliferae)(芹屬(Apium)、胡蘿蔔屬(Daucus)、歐防風屬(Pastinaca))；馬鞭草科(Verbenaceae)(馬鞭草屬(Verbena)、馬櫻丹屬(Lantana))；堇菜科(Violaceae)(堇菜屬(Viola))。
在又一實施例中，本發明涉及一種用來表達轉基因植物的至少一朵花中的選定蛋白質的方法。該方法的第一步涉及獲得包含一選定編碼區的表達載體，該編碼區可操作性地與能引發植物花中轉錄的啟動子相連結。該啟動子包含具有一選自由以下各序列組成的群組的序列的多核苷酸SEQ ID NO2及在嚴格條件下與SEQ ID NO2雜交的序列。這些序列的片段和變體也涵蓋在本發明的範圍之內。第二步涉及用所述載體轉化受體植物細胞。第三步涉及從所述受體植物細胞再生表達所述選定蛋白的轉基因植物。
在該表達盒中所施用的選定編碼區可處以正義方向或反義方向。一序列可與SEQ IDNO2雜交的該嚴格條件可以是低嚴格條件或高嚴格條件。低嚴格條件包括於42℃在2X SSC、0.5％(w/v)SDS溶液中洗滌30分鐘並且接著重複所述洗滌。高嚴格條件包括於65℃在2X SSC、0.5％(w/v)SDS溶液中洗滌30分鐘並且接著重複所述洗滌。
可使用所屬領域中已知的技術來進行植物細胞的轉化，這些技術包括(但不限於)粒子槍法(microproiectile bombardment)、聚乙二醇介導的原生質體的轉化、電穿孔和土壤桿菌介導的轉化。被轉化的受體植物細胞可來自單子葉植物或雙子葉植物。單子葉植物的實例包括(但不限於)石蒜科(蔥屬(Allium)、水仙屬(Narcissus))；禾本科(Graninae或Poaceae)，(燕麥屬(Avena)、大麥屬(Horedum)、稻屬(Oryza)、黍屬(Panicum)、狼尾草屬(Pennisetum)、早熟禾屬(Poa)、甘蔗屬(Saccharum)、黑麥屬(Secale)、高梁屬(Sorghum)、小麥屬(Triticum)、玉米屬(Zea))。雙子葉植物實例包括(但不限於)夾竹桃科(Apocynaceae)(長春花屬(Catharanthus))；紫菀科(Asteraceae)或菊科(Compositae)(紫菀屬(Aster)、金盞花屬(Calendula)、翠菊屬(Callistephus)、菊苣屬(Cichorium)、金雞菊屬(Coreopsis)、大麗花屬(Dahlia)、菊屬(Dendranthema)、雜色菊屬(Gazania)、非洲菊(Gerbera)、向日葵屬(Helianthus)、蠟菊屬(Helichrysum)、萵苣屬(Lactuca)、金光菊屬(Rudbeckia)、萬壽菊屬(Tagetes)、百日菊屬(Zinnia))；鳳仙花科(Balsaminaceae)(鳳仙花屬(Impatiens))；秋海棠科(Begoniaceae)(秋海棠屬(Begonia))；石竹科(Caryophyllaceae)(石竹類屬(Dianthus))；藜科(Chenopodiaceae)(甜菜屬(Beta)、皂莢(Spinada))；葫蘆科(Cucurbitaceae)(西瓜屬(Citrullus)、南瓜屬(Curcurbita)、甜瓜屬(Cucumis))；十字花科(Cruciferae)(庭薺屬(Alyssum)、芸苔屬(Brassica)、糖芥屬(Erysimum)、紫羅蘭屬(Matthiola)、蘿蔔屬(Raphanus))；龍膽科(Gentinaceae)(洋桔梗(Eustoma))；牻牛兒苗科(Geraniaceae)(天竺葵屬(Pelargonium))；大戟科(Euphorbiaceae)(大戟屬(Poinsettia))；唇形科(Labiatae)(鼠尾草屬(Salvia))；豆科(Leguminosae)(大豆屬(Glycine)、山黧豆屬(Lathyrus)、苜蓿屬(Medicago)、菜豆屬(Phaseolus)、豌豆屬(Pisum))；百合科(Liliaceae)(百合屬(Lilium))；半邊蓮科(Lobeliaceae)(半邊蓮屬(Lobelia))；錦葵科(Malvaceae)(秋葵屬(Abelmoschus)、棉屬(Gossypium)、錦葵屬(Malva))；藍雪科(Plumbaginaceae)(補血草屬(Limonium))；花荵科(Polemoniaceae)(福祿考屬(Phlox))；報春花科(Primulaceae)(仙客來屬(Cyclamen))；毛茛科(Ranunculaceae)(烏頭屬(Aconitum)、銀蓮花屬(Anemone)、耬鬥菜屬(Aquilegia)、驢蹄草屬(Caltha)、翠雀屬(Delphinium)、毛茛屬(Ranunculus))；薔薇科(Rosaceae)(薔薇屬(Rosa))；茜草科(Rubiaceae)(繁星花(Pentas))；玄參科(Scrophulariaceae)(天使花屬(Angelonia)、金魚草屬(Antirrhinum)、倒地蜈蚣屬(Torenia))；茄科(Solanaceae)(辣椒屬(Capsicum)、番茄屬(Lycopersicon)、菸草屬(Nicotiana)、矮牽牛屬(Petunia)、茄屬(Solatium))；傘形科(Umbelliferae)(芹屬(Apium)、胡蘿蔔屬(Daucus)、歐防風屬(Pastinaca))；馬鞭草科(Verbenaceae)(馬鞭草屬(Verbena)、馬櫻丹屬(Lantana))；堇菜科(Violaceae)(堇菜屬(Viola))。


圖1A顯示具有寡核苷酸引物(BHX30及BHX36)的LIS1啟動子的多核苷酸序列。圖1A中所示的多核苷酸序列長為1048個鹼基對並且在核苷酸3-8含有Hind III位點且在核苷酸1040-1045含有Sma I位點。
圖1B顯示具有寡核苷酸引物BHX30的核苷酸序列。此引物構成圖1A中所示多核苷酸序列的核苷酸1-29。
圖1C顯示寡核苷酸引物BHX36的核苷酸序列。此引物與圖1A中所示多核苷酸序列的核苷酸1018-1048反向互補。
圖2顯示用含有LIS1啟動子的質粒與用含有35S RNA組成性啟動子的質粒所轉化的轉基因矮牽牛花株之間GUS表達的差異照片。
圖3顯示來自於經含有LIS1::crtB::nos的pBHX112轉化的植物中的矮牽牛花斷片的RNA凝膠墨點分析(RNA gel blot analysis)。
具體實施例方式
引言本發明涉及一種衍生自S-芳樟醇合酶基因的多核苷酸序列作為啟動子引發特定組織如植物的至少一朵花的轉錄的用途。本發明的多核苷酸序列可用於表達植物的至少一朵花中相關的蛋白質。
定義本文所提供的標題並不限制可參照本說明書作為一個整體的本發明的各個方面或實施例。因此，以下即將定義的該等術語將參照本說明書作為一個整體得到更詳細的定義。
本文所用短語「外源編碼區」或「選定編碼區」是指一被引入或再引入有機體內的(多個)多核苷酸或(多個)選定基因的編碼區。舉例來說，如果為類胡蘿蔔素葉黃素編碼的編碼區(來自(多個)多核苷酸或(多個)選定基因)被引入或再引入有機體(例如，植物，如金盞花)，那麼將其視作一外源編碼區或選定編碼區。
本文所用術語「表達」是指細胞內過程的組合，包括編碼用DNA分子如結構基因或多核苷酸為產生多肽所經歷的轉錄或翻譯。
本文所用術語「表達盒」是指為通過基因轉化引入宿主基因組而設計的嵌合DNA分子。本發明的優選表達盒包含為引導選定基因或多核苷酸序列的表達所必需的所有遺傳成分。本發明的該(該等)表達盒包括LIS1啟動子或LIS1嵌合啟動子。
本文所用術語「表達載體」是指一包含至少一個表達盒的基於DNA的載體。
本文所用術語「基因」是指染色體DNA、質粒DNA、cDNA、合成DNA，或用於編碼肽、多肽、蛋白質或RNA分子及位於基因調控所涉及的編碼用序列兩側的區域的其他DNA。
本文所用術語「(多個)宿主」是指細菌、整個植物、小植物、或植物部分，諸如植物細胞、原生質體、愈傷組織、根、塊莖、繁殖體、種子、秧苗、花粉和植物組織。
本文所用術語「經分離的」是指如多核苷酸或蛋白質的物質，其為(a)大體上或基本上不含如在天然發生環境中所發現的通常伴隨該物質或與該物質相互作用的組分；或(b)如果該物質在其天然環境中，那麼使該物質通過對組合物進行蓄意人類幹預加以改變及/或將其安置在細胞中除該物質天然軌跡(locus)外的軌跡處。
本文所用術語「標記基因」是指一種賦予表達該標記基因的細胞獨特顯型並且允許已轉化的細胞區別於不具有該標記基因的細胞的基因。這些基因可對能通過觀察或測試來識別的可篩選標記物(即，例如通過篩選，如綠色螢光蛋白)進行編碼。
本文所用術語「組織優選的」是指在執行特定功能的細胞的任何群組中具有最高水平的多核苷酸或選定基因表達。在所屬領域中已知用於測定細胞群組中最高水平的(多個)多核苷酸或(多個)基因表達的技術，且包括(但不限於)組織化學分析和螢光分析。
本文所用術語「花優選的」是指植物的至少一朵花中至少一個多核苷酸或經選定基因的有利表達。
本文所用術語「花瓣優選的」是指在花的花瓣組織中具有最高水平的多核苷酸或選定基因表達。在所屬領域中已知用於測定細胞群組中最高水平的多核苷酸或基因表達的技術，且包括(但不限於)組織化學分析和螢光分析。
本文所用術語「(多個)植物部分」或「植物的(多個)部分」是指細胞、原生質體、細胞組織培養物、(多個)愈傷組織、細胞塊、胚芽、花粉、胚珠、花瓣、花柱、雄蕊、葉子、根、根尖和花葯。
本文所用術語「多核苷酸」是指任何長度的核苷酸的聚合形式，或為核糖核苷酸或為脫氧核糖核苷酸。此術語包括雙股和單股DNA以及雙股和單股RNA。也包括多核苷酸的修飾(例如甲基化或封端(capping))和未修飾形式。
本文所用術語「啟動子」是指在為多核苷酸或選定基因提供表達控制元素的DNA序列或DNA序列群組上的且可特異結合RNA聚合酶並引發該基因的轉錄(RNA合成)的識別位點。啟動子通常是由轉錄起始、調控和效率中所涉及的幾個調控元素組成，其可能是接近於轉錄起始位點的上百或者甚至上千個核苷酸。這些調控元素包括(但不限於)TATA盒子、增強子、下遊活化序列等。
本文所用術語「選定基因」是指在轉基因植物、植物細胞或植物部分中待表達的基因。選定基因對宿主基因組而言可以是天然的或是外來的。當該選定基因存在於宿主基因組中時，其包括不同於該基因的(多個)天然複本的一個或多個調控或功能元素。
本文所用術語「轉化細胞」是指通過引入外源DNA分子(即，外源編碼區)來改變其互補DNA的細胞。該「外源DNA分子」包括(1)原本不存在於該細胞中的(多個)序列；和(2)對該被轉化的細胞而言是天然的且被再引入到所述細胞中的序列。
本文所用術語「轉基因」是指已經被併入宿主基因組或能在宿主細胞中自主複製並能引起一個或多個細胞產物的表達的DNA片段。
本文所用術語「轉基因植物」是指植物或具有自其衍生的任何後代的植物的後裔(progeny)，其中該植物的DNA或其後裔含有在相同菌株的非轉基因植物中原本不存在的經引入的外源DNA分子。該轉基因植物也含有對轉化植物而言天然的序列，但是其中該「外源」基因已被修改以改變該基因的表達水平或模式。
本文所用術語「轉運肽」是指能夠將多肽引入細胞內特定細胞器或其他位置的多肽序列。
本文所用術語「載體」是指能夠在宿主細胞中複製並且/或者可使另一DNA分子與其可操作性連結以引起所附著的片段的複製的DNA分子。質粒是載體的一個實例。
序列表本申請案也含有5種多核苷酸和/或胺基酸序列。對於該等多核苷酸序列，由下列鹼基密碼來表示鹼基對


本申請案中所示胺基酸為L型且由下列胺基酸-三字母縮寫來表示


優選實施例描述在一實施例中，本發明涉及一種衍生自編碼啟動子的S芳樟醇合酶(LIS)基因的經分離的多核苷酸序列的用途。本文所述多核苷酸序列能引導植物的至少一朵花中相關的可任意可操作性連結的(多個)多核苷酸或(多個)選定基因的表達。已發現該表達不僅為花優選的，而且更明確地說是為花瓣優選的。
編碼本發明啟動子的多核苷酸序列顯示在圖1的SEQ ID NO2和核苷酸7-1033中(下文稱為「LIS1啟動子」)。此多核苷酸序列是衍生自從山字草(Clarkia brewerii)得到的S-芳樟醇合酶基因(SEQ ID NO1)。從山字草得到的S-芳樟醇合酶基因的完整多核苷酸和胺基酸序列在Genbank Accession AF067601(SEQ ID NO1)和Cseke，L.等人的Mol.Biol.Evol，151491-1498(1998)中有描述。該S-芳樟醇合酶基因為S-芳樟醇合酶、催化S芳樟醇生成的花香生物合成酶、揮發性類單萜進行編碼(Dudareva等人，The PlantCell，81137-1148(1996))。
另一種花香化合物苯甲酸羧基甲基轉移酶是苯甲酸甲酯生物合成中的最後產物酶，且已知是金魚草花中最豐富的香味化合物。在金魚草中，已發現大部分BAMT基因活性是在花冠的上葉片和下葉片中(Dudareva等人，The Plant Cell，12949-961(2000))。一實例證明了來自該BAMT基因的啟動子不引導轉基因矮牽牛花花瓣組織中的外源基因表達。因此，不能假定此啟動子在其他種類中是花瓣優選的啟動子。
本發明的啟動子可用於以其他啟動子序列與本發明啟動子序列的同源性為基礎使用所屬領域中已知的常規技術來從其他有機體中分離出其他啟動子。在這些技術中，將本發明的全部或部分啟動子用作探針，其選擇性地與獨特的且較佳為至少約10個核苷酸長及最佳至少約20個核苷酸長的其它序列進行雜交。這些探針可用於利用聚合酶鏈反應(「PCR」)來增強來自所選有機體的相應啟動子。此技術可用於將額外啟動子自所要的有機體分離開來或者作為測定有機體中啟動子的存在的診斷分析。實例包括經鍍積的DNA庫的雜交篩選(斑片或菌落；參看例如Innis等人，PCR Protocols，A Guide to Methodsand Applications，eds.，Academic Press(1990))。
本發明也包括對應於本發明啟動子並與本發明啟動子雜交且與所揭示的序列至少50％同源、70％同源、85％同源、90％同源、95％同源且甚至99％同源的序列。也就是說，探針與目標之間的序列相似性可能在至少約50％、約70％、約85％、約90％、約95％且甚至約99％序列相似性的範圍內。
排列用於比較的序列的方法在所屬領域中已為人熟知。可通過在用於預設參數下實施BLAST(Basic Local Alignment Search Tool；Altschul，S.F.等人，J.Mol.Biol.215403-410(1993)；同時參看www.ncbi.nlm.gov/BLAST/)研究在BLAST「GENEMBL」資料庫中所含的序列的同一性來加以測定。可在預設參數下使用BLASTN算法來分析一個序列與GENEMBL資料庫中所含全部公開可得DNA序列的同一性。本發明序列的同一性是指多核苷酸序列具有至少50％序列同一性、更佳至少70％序列同一性、更佳至少70％序列同一性、更佳至少80％序列同一性、更佳至少85％序列同一性、更佳至少90％序列同一性、更佳至少95％序列同一性且最佳至少99％序列同一性，其中序列同一性百分比是基於該整個啟動子。
可利用所屬領域中常規技術例如通過使用嚴格條件來鑑別與本發明多核苷酸序列(SEQ ID NO2)雜交的多核苷酸序列。本文所用術語「嚴格條件」或「嚴格雜交條件」包括對探針將與其目標序列進行雜交至比其它序列在可探測性上具有更大程度(例如，超過背景至少兩倍)的條件的參考。嚴格條件是依賴於目標序列的且視多核苷酸的結構而不同。通過控制雜交和/或洗滌條件的嚴格性，可鑑別出與探針(此類型探測被稱為「同源探測」)100％互補的目標序列。或者，可調節嚴格條件以允許序列中的某些錯配以便探測到低程度的相似性(此類型探測被稱為「異源探測」)。一般來說，此類型的探針在約100個核苷酸長到約250個核苷酸長的範圍之內。
在Tijssen的Laboratory Techniques in Biochemistry and MolecularBiology-Hybridization with Nucleic Acid Probes，第I部分，第2章，″Overview of principlesof hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays″，Elsevier，N.Y.(1993)；和Current Protocols in Molecular Biology，第2章，Ausubel等人編，Greene Publishing andWiley-Initerscience，New York(1995)中發現了核酸雜交的廣泛指導。同時參閱Sambrook等人的Molecular CloningA Laboratory Manual(第2版.Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.(1989))。
特異性通常是雜交後洗滌的功能，臨界因素為離子強度和最終洗滌溶液的溫度。一般來說，將嚴格洗滌溫度條件選擇為比在所定義離子強度和pH值下特定序列的熔點(Tm)低約5℃到約2℃。DNA的熔點或變性發生在狹窄溫度範圍內並且代表雙螺旋分裂為其互補的單股。通過轉變中點的溫度Tm(也叫熔解溫度)來描述此過程。用於確定熔解溫度的公式在所屬領域中是已知的。
用於本發明啟動子的優選雜交條件包括在42℃下在50％(w/v)甲醯胺、6x標準鹽水檸檬酸鹽(「SSC」)、0.5％(w/v)十二烷基硫酸鈉(「SDS」)、100μg/ml鮭魚精子DNA中進行雜交。示例性低嚴格洗滌條件包括在42℃下在2X SSC、0.5％(w/v)SDS的溶液中雜交30分鐘並重複。示例性中度嚴格條件包括在50℃下在2X SSC、0.5％(w/v)SDS中洗滌30分鐘並重複。示例性高嚴格條件包括在65℃下在2X SSC、0.5％(w/v)SDS中洗滌30分鐘並重複。利用所有上述條件可獲得對應於本發明啟動子的序列。
本發明也涵蓋衍生自本發明啟動子(即，SEQ ID NO2)的片段和變體。本文所用「(多個)片段」是指多核苷酸序列的部分。本發明的該(等)片段包括SEQ ID NO2的一部分。這些片段可保留生物活性並因此包括能引導植物的至少一朵花中可操作性連結的(多個)多核苷酸或(多個)選定基因的表達的片段。本發明啟動子的多核苷酸片段包括至少20、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1010個核苷酸，或高達本文所揭示的全長LIS1啟動子中所存在的核苷酸的數目。該等多核苷酸片段通常將包括特定啟動子序列的TATA識別序列(也叫做TATA盒子)。該等片段可通過以下手段而獲得利用限制酶分裂本文所揭示的啟動子的多核苷酸序列；通過從天然發生啟動子DNA序列合成多核苷酸序列；或可通過使用PCR技術而獲得。特別參閱Mullis等人的Methods Enzymol.155335-350(1987)和Erlich，第1版.(1989)PCR Technology(Stockton Press，N.Y.(1989))。
如以上簡述，本發明也涵蓋本發明啟動子(SEQ ID NO2)的變體。本文所用術語「(多個)變體」是指大體上相似的序列。利用所屬領域中已知的常規技術(如聚合酶鏈反應)可鑑別出天然發生的變體。變異的多核苷酸序列也包括以合成方式衍生出的多核苷酸序列，例如通過定點突變所產生的多核苷酸序列，其在下面有更詳細的描述。生物學上的活性變體也包括在本發明的範圍內。
可利用所屬領域中已知的常規技術通過插入、缺失或變異SEQ ID NO2來產生本發明啟動子的變體。舉例來說，如上簡述，這些變體包括由SEQ ID NO2的定位突變而產生的序列。用於執行定點突變的技術在Mikaelian等人的Nucl.Acids Res.，20376(1992)、Zhou等人的Nucl.Acids Res.，196052(1991)中有描述。另外，本發明包括達到轉錄起始位點附近的TATA盒子的啟動子的5′部分的變體，該部分可缺失而不消除啟動子活性，如Zhu等人The Plant Cell 71681-89(1995)中所述。該等變體應保留引導在植物的至少一朵花中的表達的能力。
本發明的多核苷酸序列可用於引導在植物的至少一朵花中來自於編碼特定蛋白或多肽產物或RNA分子的可操作性連結的(多個)多核苷酸和/或(多個)選定基因的選定編碼區的表達。與用於受體植物細胞的轉化的LIS1啟動子聯合使用的特定選定編碼區的選擇將取決於轉化的目的。植物轉化的主要目的之一是增加植物商業上所要的、農藝上或園藝上重要的性狀。這些性狀包括(但不限於)昆蟲抗性或耐性、疾病抗性或耐性(病毒、細菌、真菌)、顏色(例如(1)花青甙(例如通過花青甙生物合成酶的產生或增加的表達，此酶產生花青甙化合物，如(但不限於)天竺葵色素、矢車菊色素、翠花素、芍藥色素、錦葵色素、矮牽牛素和其類似物(對產生上述化合物的花青甙生物合成酶進行編碼的多核苷酸和基因序列在所屬領域中是已知的並且在Holton等人的ThePlant Cell，71071-1083(1995)中有所描述)，和/或(2)類胡蘿蔔素(例如通過類胡蘿蔔素生物合成酶的產生或增加的表達，此酶產生化合物如(但不限於)八氫番茄紅素、六氫番茄紅素、ζ-胡蘿蔔素、鏈孢紅素、番茄紅素、γ-胡蘿蔔素、β-胡蘿蔔素、α-隱黃素、β-隱黃素、角黃素、辣椒紅素、辣椒玉紅素、玉米黃素、堇菜黃素、新葉黃素、花葯黃質、葉黃素、蝦青素、阿東尼紅素(adonirubin)、金盞花黃素(adionixanthin)和其類似物(對產生上述類胡蘿蔔素化合物的類胡蘿蔔素生物合成酶進行編碼的多核苷酸和基因序列在所屬領域中是已知的並且在WO 00/32788和美國專利第5,684,238號、第5,530,188號、第5,429,939號及第5,618,988號，Cunningham and Gantt，Breeding forOrnamentalsClassical and Molecular Approaches，ed.A.Vainstein(Kluwer AcademicPublishers，Dordrecht(2002))，Chamovitz等人，FEBS Lett，296(3)305-310(1992)，Chappell，J.，Ann.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol，46521-547(1995)，Cunningham等人，FEBS Lett，328(1-2)130-138(1993)，Hugueney等人，Eur.J.Biochem.，209(1)399-407(1992)，Hundle等人，FEBS Lett，315(3)329-334(1993)，Kajiwara等人，Plant Mol.Biol，29(2)343-352(1995)，Kuntz等人，Plant J.，2(1)25-34(1992)，Linden等人，Plant Mol.Biol，24(2)369-79(1994)，Lotan等人，FEBS Lett，364(2)125-128(1995)，Math等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89(15)6761-6764(1992)，Misawa等人，J.Bacteriol，172(12)6704-6712(1990)，Misawa等人，J.Biochem.(Tokyo)，116(5)980-985(1994)，Sandmann，G.，FEMS MicrobiolLett，69(3)253-257(1992)，Sandmann等人，FEMS Microbiol Lett，59(1-2)77-82(1990)及Kajiwara等人，Biochem.J.，324421-426(1997))中有所描述))、花香、花壽命等。該選定編碼區可在正義方向或反義方向上與本發明的啟動子一起使用。
在另一實施例中，本發明涉及一種嵌合啟動子，其可用於引導在植物的至少一朵花中來自於編碼特定蛋白或多肽產物或RNA分子的可操作性連結的(多個)多核苷酸和/或(多個)選定基因的選定編碼區的表達。更具體地說，可使用所屬領域中已知的常規技術使本發明的多核苷酸或其片段或變體可操作性地連結到另一啟動子以形成嵌合啟動子(下文稱為「LIS1嵌合啟動子」)。舉例來說，可使本發明的啟動子可操作性地連結到CaMV35S啟動子的特定區域以引導在植物的至少一朵花中可操作性地連結到所述嵌合啟動子的至少一個多核苷酸或選定基因的高水平表達。用於製造LIS1嵌合啟動子的啟動子連同本發明的LIS1啟動子不僅僅必須引導在植物的花中多核苷酸或選定基因的表達。事實上，此啟動子並不必須僅是組織特異性啟動子。視情況，所述啟動子可以是組成性啟動子或所屬領域中為人熟知的誘導性啟動子。
與用於轉化的LIS1嵌合啟動子聯合使用的特定選定編碼區的選擇將取決於轉化的目的。植物轉化的主要目的之一是增加植物商業上所要的、農藝上或園藝上重要的性狀。這些性狀包括(但不限於)昆蟲抗性或耐性、疾病抗性或耐性(病毒、細菌、真菌)、顏色(例如(1)花青甙(例如通過花青甙生物合成酶的產生或增加的表達，此酶產生花青甙化合物如(但不限於)天竺葵色素、矢車菊色素、翠花素、芍藥色素、錦葵色素、矮牽牛素和類似物)，和/或(2)類胡蘿蔔素(例如通過類胡蘿蔔素生物合成酶的產生或增加的表達，此酶產生類胡蘿蔔素化合物如(但不限於)八氫番茄紅素、六氫番茄紅素、ζ-胡蘿蔔素、鏈孢紅素、番茄紅素、γ-胡蘿蔔素、β-胡蘿蔔素、α-隱黃素、β-隱黃素、角黃素、辣椒紅素、辣椒玉紅素、玉米黃素、堇菜黃素、新葉黃素、花葯黃質、葉黃素、蝦青素、阿東尼紅素(adonirubin)、金盞花黃素(adonixanthin)和其類似物))、花香、花壽命等。該特定選定的編碼區可在正義方向或反義方向上與LIS1嵌合啟動子一起使用。
在另一實施例中，本發明涵蓋具有不止一個轉化構造的受體細胞的轉化。可利用獨特的選定蛋白編碼用載體，或者使用合併有兩個或兩個以上多核苷酸或選定基因序列的單一載體在單一轉化事件中創造出兩個或兩個以上的轉基因。可按需要採用任何描述的任何兩個或兩個以上的轉基因，例如那些賦予(例如)昆蟲或疾病(病毒、細菌、真菌)抗性、對顏色或花香或花壽命的改變(降低或增加)的轉基因。
在又一實施例中，本發明涵蓋使用兩個(2)或兩個以上載體的植物或植物細胞的共轉化。可使用含有標記物和一種或多種多核苷酸或相關的選定基因的載體來實現共轉化。或者，不同載體(例如(但不限於)質粒)可含有不同的多核苷酸或相關的選定基因，且該等質粒可被同時傳送到受體宿主細胞。根據此方法，假定一定百分數的細胞(其中已引入標記物)也已經接收了相關的其它多核苷酸或選定基因。因此，並非所有憑藉標記物所選定的細胞都將表達已被同時呈現給該等細胞的相關的其它蛋白質。
適用於植物轉化的任何載體可用於本發明中。這些載體包括(但不限於)質粒、柯斯質粒(cosmid)、酵母人工染色體(「YAC」)、細菌人工染色體(「BAC」)或其它任何合適的克隆系統。我們預期利用具有巨大插入容量的克隆系統將會允許引入包含不止一個的選定基因的巨大DNA序列。通過使用BAC、YAC或植物人工染色體可便於該等序列的引入。
從先前所述的載體分離出的表達盒可用於轉化。用於使植物細胞轉化的DNA分子通常將包含cDNA或者待引入並在受體宿主細胞中表達的一個或多個選定基因或多核苷酸。除LIS1啟動子或LIS1嵌合啟動子外，該等DNA分子可進一步包括以下結構如增強子、多接頭(polylinker)、內含子、終止子或影響基因表達的其它調控元素或基因。用於使植物細胞轉化的DNA分子可以正義方向或反義方向插入到表達盒中並將通常對蛋白質進行編碼，該蛋白質將被表達在所得的重組細胞中導致可篩選的或可選擇的性狀且/或將賦予所得轉基因植物經改良的顯型。但是，情況並非總是如此，並且本發明也包括轉基因植物或植物部分，其合併有未經表達的轉基因或非編碼用RNA(例如，反義RNA分子、編碼核糖酶的多核苷酸或者能夠促進核糖核酸酶P介導的目標RNA分子分裂的多核苷酸)。
如上所述，增強子序列可被包括在含有LIS1啟動子或LIS1嵌合啟動子的轉化構造中並且可操作性地連結到一相關的多核苷酸或選定基因的編碼區。可在真核細胞中起作用的啟動子中5′到轉錄起始發現增強子序列。有時，在內含子內發現這些增強子序列。增強子序列可於前向或反向方向5′或3′插入到相關的多核苷酸或選定基因的編碼序列。根據本發明可使用的增強子實例包括來自CaMV 35S RNA啟動子和章魚鹼合酶基因的增強子序列(Ellis等人，EMBO J.，6(11)3203-3208(1987))。
當增強子與LIS1啟動子或LIS1嵌合啟動子聯合用於選定蛋白質的表達時，該增強子優選為啟動子和相關的可操作性連結的(多個)多核苷酸或(多個)基因的編碼區的起始密碼子的上遊。但是，也可以使用相對於相關的多核苷酸或(多個)選定基因的其它編碼區而言不同增強子排列，以獲得由該增強子賦予的有利特性。舉例來說，可將增強子安置在啟動子的5′(在該啟動子內)在相關的(多個)多核苷酸或(多個)選定基因的編碼區內(包括在可能存在的任何其它內含子序列內)或者該編碼區的3′。
除增強子序列外，未翻譯的前導序列(leader sequence)也可用在含有LIS1啟動子或LIS1嵌合啟動子的轉化構造中。可用在該等構造中的優選前導序列包括那些具有可引導相關可操作性連結的(多個)多核苷酸或(多個)選定基因所附著的編碼區的最佳表達的序列(即，包括優選一致的前導序列，其可增加或維持mRNA穩定性、預防翻譯的錯誤起始、或促進更有效的翻譯起始)的序列。所屬領域的技術人員可容易地確定可用於轉化構造中的未翻譯前導序列。
根據本發明製備的轉化構造也可含有充當3′末端處理的信號的3′末端DNA序列，並且允許通過可操作性連結到LIS1啟動子或LIS1嵌合啟動子的編碼用序列而產生的mRNA的聚腺苷醯化作用。可與LIS1啟動子或LIS1嵌合啟動子聯合使用的聚腺苷醯化區域包括(但不限於)那些來自為核酮糖-1，5-雙磷酸酯羧基酶-加氧酶(rbcS)的小亞單元進行編碼的基因的區域、來自根瘤土壤桿菌(Agrobacterium tumefacien)的胭脂鹼合酶基因的終止子(nos 3′末端)(Bevan等人，Nucleic Acids Research 11(2)369-385(1983))、用於自根瘤土壤桿菌的章魚鹼合酶基因T7轉錄的終止子，和來自馬鈴薯或西紅柿的蛋白酶抑制劑I或II基因的3′末端。
本發明的轉化構造可進一步採用轉運肽和信號序列。與待表達的多核苷酸或選定基因的編碼序列相接合的並可在翻譯後自初始翻譯產物移除且便利於蛋白質運輸到或穿過細胞內或細胞外膜的序列被稱為轉運肽(這些肽便利於蛋白質轉運到空胞、泡囊、質體和其它細胞內細胞器中)和信號序列(這些肽便利於運輸到內質網、高爾基體和細胞膜外部中)(美國專利第5,728,925號描述了一種葉綠體轉運肽及美國專利第5,510,471號描述了一種經優化的轉運肽)。通過便利於蛋白運輸到細胞內部和外部的隔室中，該等序列可通過保護基因產物免於解蛋白降解而增加其累積。該等序列也允許來自高表達基因的額外mRNA序列附著到該等基因的編碼序列。因為由核糖體翻譯的mRNA比不可翻譯的mRNA更穩定，因此先於多核苷酸或基因而存在的可翻譯mRNA可增加基因的mRNA轉錄的總體穩定性且因而增加多核苷酸或基因產物的合成。由於轉運和信號序列通常在翻譯後被從初始翻譯產物中除去，所以該等序列的使用允許增加可能不出現在最終多肽中的額外翻譯序列。我們進一步預期可能需要靶向特定的蛋白質以增強蛋白的穩定性(參閱美國專利第5,545,818號)。
本發明的LIS1啟動子或LIS1嵌合啟動子也可用於引導可操作性連結的可篩選標記基因的表達。可用在本發明中的可篩選標記基因的編碼區實例包括(但不限於)下表1中所示的編碼區。
表1

1Dellaporta等人Chromosome Structure and FunctionImpact of New Concepts，18thStadler Genetics Symposium，11263-383(1988).
2Sutcliffe，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，75337-3741(1978).
3Ow等人，Science，234856-859(1986).
4Prasher等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.，126(3)1259-1268(1985).
5Sheen等人，Haseloff等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94(6)2122-2127(1997)；Reichel等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93(12)5888-5893(1996)；Tian等人，Plant Cell.Rep.，16267-271(1997)；WO 97/41228。
在另一實施例中，本發明涉及一種用於植物中選定蛋白質有效表達的方法和組合物。本發明的LIS1啟動子或LIS1嵌合啟動子可用於在任何類型的植物和植物部分如單子葉植物或雙子葉植物中表達一選定蛋白質。其中可使用LIS1啟動子或LIS1嵌合啟動子的單子葉植物的實例包括(但不限於)石蒜科(蔥屬(Allium)、水仙屬(Narcissus))；禾本科(Graninae或Poaceae)，(燕麥屬(Avena)、大麥屬(Horedum)、稻屬(Oryza)、黍屬(Panicum)、狼尾草屬(Pennisetum)、早熟禾屬(Poa)、甘蔗屬(Saccharum)、黑麥屬(Secale)、高梁屬(Sorghum)、小麥屬(Triticum)、玉米屬(Zea))。其中可使用LIS1啟動子或LIS1嵌合啟動子的雙子葉植物的實例包括(但不限於)夾竹桃科(Apocynaceae)(長春花屬(Catharanthus))；紫菀科(Asteraceae)或菊科(Compositae)(紫菀屬(Aster)、金盞花屬(Calendula)、翠菊屬(Callistephus)、菊苣屬(Cichorium)、金雞菊屬(Coreopsis)、大麗花屬(Dahlia)、菊屬(Dendranthema)、雜色菊屬(Gazania)、非洲菊(Gerbera)、向日葵屬(Helianthus)、蠟菊屬(Helichrysum)、萵苣屬(Lactuca)、金光菊屬(Rudbeckia)、萬壽菊屬(Tagetes)、百日菊屬(Zinnia))；鳳仙花科(Balsaminaceae)(鳳仙花屬(Impatiens))；秋海棠科(Begoniaceae)(秋海棠屬(Begonia))；石竹科(Caryophyllaceae)(石竹類屬(Dianthus))；藜科(Chenopodiaceae)(甜菜屬(Beta)、皂莢(Spinada))；葫蘆科(Cucurbitaceae)(西瓜屬(Citrullus)、南瓜屬(Curcurbita)、甜瓜屬(Cucumis))；十字花科(Cruciferae)(庭薺屬(Alyssum)、芸苔屬(Brassica)、糖芥屬(Erysimum)、紫羅蘭屬(Matthiola)、蘿蔔屬(Raphanus))；龍膽科(Gentinaceae)(洋桔梗(Eustoma))；牻牛兒苗科(Geraniaceae)(天竺葵屬(Pelargonium))；大戟科(Euphorbiaceae)(大戟屬(Poinsettia))；唇形科(Labiatae)(鼠尾草屬(Salvia))；豆科(Leguminosae)(大豆屬(Glycine)、山黧豆屬(Lathyrus)、苜蓿屬(Medicago)、菜豆屬(Phaseolus)、豌豆屬(Pisum))；百合科(Liliaceae)(百合屬(Lilium))；半邊蓮科(Lobeliaceae)(半邊蓮屬(Lobelia))；錦葵科(Malvaceae)(秋葵屬(Abelmoschus)、棉屬(Gossypium)、錦葵屬(Malva))；藍雪科(Plumbaginaceae)(補血草屬(Limonium))；花荵科(Polemoniaceae)(福祿考屬(Phlox))；報春花科(Primulaceae)(仙客來屬(Cyclamen))；毛茛科(Ranunculaceae)(烏頭屬(Aconitum)、銀蓮花屬(Anemone)、耬鬥菜屬(Aquilegia)、驢蹄草屬(Caltha)、翠雀屬(Delphinium)、毛茛屬(Ranunculus))；薔薇科(Rosaceae)(薔薇屬(Rosa))；茜草科(Rubiaceae)(繁星花(Pentas))；玄參科(Scrophulariaceae)(天使花屬(Angelonia)、金魚草屬(Antirrhinum)、倒地蜈蚣屬(Torenia))；茄科(Solanaceae)(辣椒屬(Capsicum)、番茄屬(Lycopersicon)、菸草屬(Nicotiana)、矮牽牛屬(Petunia)、茄屬(Solatium))；傘形科(Umbelliferae)(芹屬(Apium)、胡蘿蔔屬(Daucus)、歐防風屬(Pastinaca))；馬鞭草科(Verbenaceae)(馬鞭草屬(Verbena)、馬櫻丹屬(Lantana))；堇菜科(Violaceae)(堇菜屬(Viola))。
如先前簡述，本發明提供一種用於在植物和植物部分中經選定蛋白質表達的LIS1啟動子和LIS1嵌合啟動子。依照本發明用於植物宿主細胞中表達的選定蛋白質的選擇將取決於轉化的目的。農作物轉化的主要目的之一是增加植物商業上所要的、農藝上或園藝上重要的性狀。這些性狀包括(但不限於)昆蟲抗性或耐性；疾病抗性或耐性(病毒、細菌、真菌)、顏色(花青甙(例如(但不限於)天竺葵色素、矢車菊色素、翠花素、芍藥色素、錦葵色素、矮牽牛素和類似物)和/或類胡蘿蔔素(例如(但不限於)八氫番茄紅素、六氫番茄紅素、ζ-胡蘿蔔素、鏈孢紅素、番茄紅素、γ-胡蘿蔔素、β-胡蘿蔔素、α-隱黃素、β-隱黃素、角黃素、辣椒紅素、辣椒玉紅素、玉米黃素、堇菜黃素、新葉黃素、花葯黃質、葉黃素、蝦青素和類似物))、花香、花壽命等。
在本發明的另一實施例中，用相關的一個以上的多核苷酸和/或選定基因來執行受體植物細胞的轉化。在單一轉化事件中使用獨特的轉基因編碼載體或者使用合併有兩個或兩個以上編碼序列的單一載體也可提供來自於相關的一個或多個多核苷酸或選定基因的兩個或兩個以上外源編碼區。舉例來說，認為在會聚、發散或共線方向上帶有bar和aroA表達單元的質粒尤其適用。如需要可採用任何描述的任何兩個或兩個以上轉基因，例如，那些賦予昆蟲、疾病(病毒、細菌、真菌)或顏色(花青甙例如(但不限於)天竺葵色素、矢車菊色素、翠花素、芍藥色素、矮牽牛素和類似物)和/或類胡蘿蔔素(例如(但不限於)八氫番茄紅素、六氫番茄紅素、ζ-胡蘿蔔素、鏈孢紅素、番茄紅素、γ-胡蘿蔔素、β-胡蘿蔔素、α-隱黃素、β-隱黃素、角黃素、辣椒紅素、辣椒玉紅素、玉米黃素、堇菜黃素、新葉黃素、花葯黃質、葉黃素、蝦青素和類似物))、花香、花壽命的轉基因。
在另一實施例中，為了將可操作性連結的(多個)多核苷酸或(多個)選定基因引入植物以用來表達RNA分子(轉錄)(它們影響植物顯型但是未被翻譯成蛋白質)的目的，可採用本發明的LIS1啟動子或LIS1嵌合啟動子。通過使用反義RNA、叫做核糖酶的RNA酶，或者通過產生能促進核糖核酸酶P介導的目標mRNA分子分裂的RNA轉錄可影響此一目的。反義RNA、核糖酶或核糖核酸酶P介導的目標mRNA分裂可用於減少或消除轉化植物中天然或引入的植物基因的表達。
使用所屬領域中已知的常規技術可將至少一個反義RNA分子的表達用於抑制目標分子的表達。更明確地說，本發明涵蓋一種表達盒構造，其中本發明的啟動子可操作性地連結到對一互補多核苷酸單元(例如反義RNA分子)進行編碼的多核苷酸序列。此互補多核苷酸單元與目標分子的結合可是受抑制的。舉例來說，如果目標分子是mRNA分子，那麼RNA、互補多核苷酸單元的結合將導致雜交和目標蛋白質翻譯的停滯。
或者，本發明的啟動子可操作性地連結到編碼核糖酶的多核苷酸序列。更明確地說，本發明涉及一種表達盒構造，其中本發明的啟動子可操作性地連結到編碼核糖酶的多核苷酸序列。在所屬領域中已知可設計該等核糖酶以表達針對mRNA分子中特定目標序列的核酸內切酶活性。舉例來說，通過菸草原生質體中的核糖酶實現了新黴素磷酸轉移酶基因表達的高達100％抑制(參閱Steinecke等人，EMBO J.，111525(1992))。在本發明中，用於核糖酶的合適的目標RNA分子的實例包括mRNA種類，其編碼在植物生化途徑中發現的生物合成酶。
在另一實施例中，本發明的啟動子可用於引導能促進核糖核酸酶P介導的目標mRNA分子分裂的RNA分子(轉錄)的產生。更具體地說，本發明進一步涵蓋一種表達盒構造，其中本發明的啟動子引導能促進核糖核酸酶P介導的目標mRNA分子分裂的RNA轉錄的產生。在此方法之下，可構建一外部指導序列用來將內源核糖酶、核糖核酸酶P引導到一特定種類的mRNA，其隨後通過細胞核糖酶進行分裂(參閱美國專利第5,168,053號；Yuan等人，Science，2631269(1994))。
本發明進一步涉及LIS1啟動子或LIS1嵌合啟動子可用於引入至少一個多核苷酸或經選定基因以產生轉基因植物，這些轉基因植物經由共抑制而具有天然基因產物的減少的表達。如在菸草、西紅柿和矮牽牛花中所示(Goring等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，881770-1774(1991)，Smith等人，Mol.Gen.Genet.，224447-481(1990)，Napoli等人，Plant Cell，2279-289(1990)，van der Krol等人，Plant Cell，2291-299(1990))，天然基因正義轉錄的表達可以與對反義基因所觀察到的相似方式減少或消除天然基因的表達。所引入的基因可對全部或部分目標天然基因進行編碼；但是，為減少天然基因水平起見不需要它的翻譯。
本發明進一步涵蓋使用所屬領域中已知的一種或多種分析以確定或測定轉基因表達的功效。舉例來說，分析可用於測定當與各種不同的增強子序列、終止子或其它調控元素聯合使用時，LIS1啟動子或LIS1嵌合啟動子在引導植物的至少一朵花中蛋白質表達的功效。分析也可用於測定LIS1啟動子或LIS1嵌合啟動子的各種缺失突變體在引導蛋白質表達中的功效。
待分析的生物樣品可以是使用所屬領域中已知的分子生物技術從任何植物材料的細胞中分離出來的多核苷酸(Sambrook等人，在Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989中)。該多核苷酸可以是染色體組DNA或經分餾的或完整的細胞RNA。使用RNA時，若合適，可將其轉變為DNA。
可用在本發明中的各種分析的實例包括螢光原位雜交(「FISH」)、直接DNA定序、脈衝場凝膠電泳(「PFGE」)分析、RNA或DNA凝膠墨點分析、單鏈構象分析(「SSCA」)、核糖核酸酶保護分析、等位基因特異性寡核苷酸分析法(「ASO」)、點墨分析(dot blotanalysis)、變性梯度凝膠電泳和限制性片段多態性分析(「RFLP」)。
為了測定用以表達特定轉基因的功效，要提純並量化由該轉基因所表達的多肽。提純蛋白質的技術在所屬領域中是已知的。這些技術包括(但不限於)離子交換色譜法、親合色譜法、排除色譜法、凝膠電泳、等電子聚焦、快速蛋白質液相色譜法或高性能液相色譜法。此外，免疫程序也可用於蛋白質探測。方法包括(但不限於)酶聯免疫吸附分析(「ELISA」)、西方墨點和放射免疫分析(「RIA」)。
與本發明相聯繫而使用的適用於植物轉型化的方法包括任何可將DNA引入宿主細胞的方法，其包括(但不限於)在下表2中所述的方法。
表2

可培養通過任何上述轉化技術轉化的植物細胞以再生具有轉化顯型的整個植物。這些再生技術依賴於組織生長培養基中某些植物激素的操縱，通常依賴於標記基因，其與LIS1啟動子或LIS1嵌合啟動子和來自於相關的多核苷酸或選定基因的編碼區一起被引入。在Evans等人，Protoplasts Isolation and Culture，Handbook of Plant Cell Culture，第124-176頁，Macmillan Publishing Company，New York，1983；和Binding；Regeneration ofPlants，Plant Protoplasts，第21-73頁，CRC Press，Boca Raton，1985中描述了從經培養的原生質體的植物再生。也可以從植物愈傷組織、外植體、器官或其部分獲得再生。該等再生技術在Klee等人的Ann.Ref.of Plant Phys.38467-486(1987)中得以廣泛描述。
本發明的方法尤其適用於以不被自然發現的方式並此情況下將各種相關的多核苷酸或選定基因併入轉化植物。詳言之，可不時地或者以天然植物的非特徵性數量對各種多核苷酸或選定基因進行表達。
所屬領域的技術人員公認在轉化構造被穩定地併入到轉基因植物中並證明具有可操作性之後，可通過有性交叉將其引入其它植物。可使用若干標準的繁殖技術中的任何一個，這取決於待交叉的種類。
現在通過舉例且不帶限制性的方式給出本發明的實例。
實例1pBHX質粒pBHX109分離由與GFP基因(可從哥倫布的Arabidopsis Biological Resource Center，OH得到的質粒pCD3-327中所含有的sm-RSGFP型式)相融合的Arabidospis UBQ3聚合泛素基因(1.3kb)的含啟動子區域和含nos polyA信號區域組成的2.4Kb Hind III-EcoR I片段。然後將此片段連接到先前已用Hind III和EcoR I消化的T-DNA二元載體以產生pBHX109。
PBHX113分離由與GFP基因(可從哥倫布的Arabidopsis Biological Resource Center，OH得到的質粒pCD3-327中所含有的sm-RSGFP型式)相融合的Clarkia brewerii LIS1基因的含啟動子區域(在pBHX103中所發現的相同區域)和含nos polyA信號區域組成的Hind III-EcoR I片段。然後將此片段連接到先前已用Hind III和EcoR I消化的T-DNA二元載體以產生pBHX113。
pBHX94從密西根大學(University of Michigan)獲得了含有Clarkia brewerii LIS1基因5′側區的質粒。使用引物BHX30CCAAGCTTATCTAATAATGTATCAAAATC(SEQ ID NO3)和BHX31GGCCATGGTTGTCTTGTTTAAGGTGG(SEQ ID NO5)通過PCR合成了含有該LIS1 5′側區的～1kb片段。設計這些引物以使在一個末端處且在3′末端的5′未翻譯前導區內的5′側區退火。用限制性酶Hind III和Nco I來消化該PCR產物，這些酶分別分裂在該片段的5′末端和3′末端。該Nco I位點與LIS1蛋白編碼區的起始密碼子重疊。對該經消化的片段進行凝膠提純並隨後在框內(in-frame)將其融合到含有質粒的無啟動子的gusA::nos轉基因(先前用Hind III和Nco I消化)以產生LIS1::gusA::nos轉基因(命名為pBHX94)。
pBHX99用Hind III和EcoR I消化質粒pBHX94以解放含有LIS1::gusA::nos轉基因的片段。然後將此片段連接進先前用Hind III和EcoR I消化的T-DNA二元載體以產生pBHX99。
pBHX103從密西根大學獲得了含有Clarkia brewerii LIS1基因5′側區的質粒。使用引物BHX30CCAAGCTTATCTAATAATGTATCAAAATC(SEQ ID NO3)和BHX36GGCCATGGTTGTCTTGTTTAAGGTGG(SEQ ID NO4)通過PCR合成含有LIS1 5′側區的～1kb片段。設計這些引物以使在一個末端處且在3′末端的5′未翻譯前導區內的5′側區退火。用限制性酶Hind III和Sma I來消化該PCR產物，這些酶可分別分裂該片段的5′末端和3′末端。對該經消化的片段進行凝膠提純並隨後將其插入到含有多克隆位點區(MCS)接著是含nos polyA信號區的經Hind III-和Sma I-消化的質粒，以產生LIS1::MCS::nos轉基因(命名為pBHX103)。
pBHX107將來自質粒pATC921(含有crtB基因，具有與crtB蛋白編碼區的N末端相融合的rbsS轉運肽)的1.5kb Hinc II片段以正義方向插入到位於質粒pBHX103的LIS1啟動子與nos片段之間的Sma I位點以產生pBHX107。
pBHX112用Hind III和EcoR I消化的質粒pBHX107以解放含有LIS1::crtB::nos轉基因的片段。然後將該片段連接到先前已用Hind III和EcoR I消化的T-DNA二元載體中以產生pBHX112。
實例2對含有LIS1啟動子或組成性UBQ3啟動子的質粒所轉化的轉基因矮牽牛花株中的基因表達的評估為使用LIS1啟動子來評估花組織中的基因表達，用LIS1::GFP::nos(pBHX113)或UBQ3::GFP::nos(pBHX109)構造來轉化「米切爾(Mitchell)」矮牽牛花。UBQ3是所屬領域中為人熟知的組成性啟動子。產生矮牽牛花轉化株。一旦在溫室中建立了有花植物，就使用自螢光顯微鏡產生的藍光來評估每個植物樣本花的GFP表達。採用主觀分級制(subjective rating system)，0表明無可見表達，最高的4表示最高表達。
結果顯示在下表3中。LIS1引導的GFP表達在花瓣和花冠喉(throat)花組織中最為明顯。所測試的LIS1和UBQ3轉基因植物中，僅兩株含有LIS1啟動子的植物在雌蕊組織中具有GFP表達。UBQ3引導的GFP表達在整個花組織中更為一致，正如組成型啟動子所預期的那樣。結果顯示了LIS1啟動子與UBQ3組成性啟動子在花瓣組織中的可比GFP表達。
表3GFP表達


實例3用對含有來自CaMV的LIS1啟動子或35S啟動子的質粒所轉化的轉基因矮牽牛花株中的基因表達的評估生成了十一個(11)含有質粒LIS1::gusA::nos(pBHX99)的轉基因「Dreams White」矮牽牛花株(「Dreams White」可購自PanAmerican Seed Company，622 Town Road，WestChicago，IL)和三個含有35S::gusA::nos構造(pBI121)的轉基因植物株。一旦在溫室中建立了開花植物，就用5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖醛酸、環己基銨鹽溶液(X-gluc)來以組織化學方法為來自每株植物的樣本花和嫩葉著色並對其評估在各組織中的GUS表達(參看下表4)。採用主觀分級制，0表明無可見表達，最高的3表示最高表達。
在下表4中，幾個植物株顯示了花優選的表達。相反，所有三個(3)35S::gusA::nos(pBI121)植物株都顯示了在所有測試的組織中的中到高GUS表達(參看下表4)。這些結果顯示LIS1::gusA::nos(pBHX99)轉基因植物株中有一些展示了在葉子組織中的GUS表達，表明了在接入矮牽牛花基因組的特定區域後，該LIS1啟動子可被不適當地表達(所謂的「位置效應」)。但是，所識別的大部分(六個(6))LIS1::gusA::nos(pBHX99)植物株顯示了在花瓣和其它花組織中的中到高表達，而在葉子中不具有可見GUS表達。照片顯示在圖2中，顯示了在含有LIS1::gusA::nos或35S::gusA::nos(pBI121)構造的轉基因矮牽牛花株之間GUS表達的差別。
表4GUS表達


為獲得在LIS1::gusA::nos(pBHX99)轉化植物中相比35S::gusA::nos(pBI121)轉化株的GUS活性的定量測量，用甲基傘形基-β-D-葡糖苷酸(MUG)作為基質來執行利用來自各種植物組織的無細胞粗提取物的GUS表達的螢光探測。實行雙重分析，且結果顯示在表5中。
全部LIS1::gusA::nos轉化植物顯示了在花瓣中高於在對照物中的GUS表達，並且除一株植物(1700-1-6)以外，比在35S::gusA::nos轉化植物的任何花瓣中的表達都高。此外，對於所有LIS1::gusA::nos轉化植物而言，花瓣中的GUS表達顯著高於葉子和花萼組織。矮牽牛花株1700-1-14A展示了在花瓣組織中的最高表達，其具有2160.4+/-626.3nmol/min/g[fw]的水平。此水平的GUS活性比CaMV 35S RNA啟動子(已知雙子葉植物中極具活性的啟動子)高28倍。由此可推斷該LIS1啟動子引導矮牽牛花花瓣中的最高水平表達。
表5GUS表達nmol/min/g(fw)+/-標準偏差


為說明LIS1啟動子提供了在其它矮牽牛花品種中的花優選基因表達，測量了在「Mitchell」矮牽牛花的轉化株中的GUS活性。執行了雙重分析，且結果顯示在下表6中。儘管相比轉基因「Dreams White」的花瓣而言LIS1::gusA::nos「Mitchell」矮牽牛花的花瓣中的總體GUS表達更低，但是趨勢是相同的。在LIS1::gusA::nos轉基因「Mitchell」矮牽牛花花瓣中的GUS表達在61到419nmol/min/g[fw]範圍內變化，而35S::gusA::nos植物株的花瓣中達到了63nmol/min/g[fw]的水平，這表明LIS1::gusA::nos轉基因「Mitchell」矮牽牛花花瓣中基因表達水平與對35S::gusA::nos植物株的表達一樣高或更高(比99A-2700-1-5植物株高6倍)。相反，在葉子和花萼組織中，LIS1::gusA::nos轉基因植物株中的GUS表達水平分別在0.7到7.3和1.9到20.5nmol/min/g[fw]範圍變化。35S::gusA::nos轉基因植物株中的GUS表達在葉子組織中達到了104nmol/min/g[fw]且在花萼組織中達到了93.9nmol/min/g[fw]。由於35S是已知的組成性啟動子，因此預期著在35S::gusA::nos轉基因植物株的不同組織中GUS表達的一致性。「Dreams Whire」和「Mitchell」矮牽牛花在LIS1::gusA::nos轉基因植物株中獲得的比較結果清楚地顯示了用LIS1啟動子的花優選的表達。
因此，針對GUS活性的組織化學分析和螢光分析是一致的且表明該LIS1啟動子能引導矮牽牛花花組織中的高水平基因表達。
表6GUS表達nmol/min/g[fw]+/-標準偏差

實例4對含有LIS1啟動子的質粒所轉化的轉基因矮牽牛花的花部分和正開放的花瓣中的基因表達的評估將含有質粒LIS1::gusA::nos的命名為1700-1-14A的轉基因「Dreams White」識別為在花瓣組織中具有最高GUS表達的植物株(參看上表5)。將此植物株進一步用於研究中以檢測如通過花蕾或花長所測定的花齡對GUS表達的影響並測定在成熟花的特定花部分中的GUS表達。
對從花萼到花瓣邊沿測量為2到5cm長中選擇出來的1700-1-14A花測量了花瓣中的GUS活性。花蕾關閉階段通常是2cm，而5cm是完全開放的花。下表7中所示的結果揭示從花蕾到成熟花中GUS表達有174倍的增加，表明隨著花的成熟，GUS表達增強。
表7

對1700-1-14A完全開放的花測定了花部分中的GUS活性。所測的花部分包括花瓣尖(末梢)、花瓣底、花葯/花粉和雌蕊。實行雙重分析，且結果顯示在下表8中。在所有花組織中觀察到了GUS表達，以在雌蕊中的GUS表達最高。雌蕊GUS表達比在末梢花瓣組織中高14倍。因此，可推斷LIS1啟動子引導整個矮牽牛花花組織中的高水平表達。
表8

實例5對含有LIS1啟動子的質粒所轉化的轉基因金盞花株中的基因表達的評估為測定LIS1啟動子是否能引導在第二異種植物種類中的高水平GUS表達，用LIS1::gusA::nos(pBHX99)構造來轉化金盞花(萬壽菊)植物PanAmerican Seed專有繁殖株13819並且回收一個被鑑別為99A-3300-1-10株的轉化株。對此植物株的不同植物組織執行螢光分析以探測GUS表達。如在LIS1::gusA表達的矮牽牛花中所發現的，GUS表達(nmol/min/g[fw])在花組織中較高，但在花萼和葉子中不高。這些結果表明LIS1啟動子引導金盞花中花優選的基因表達。
利用探測GUS活性的螢光分析來評估用LIS1::gusA::nos(pBHX99)轉化的PAS繁殖株13819的其它轉基因植物。也評估了來自上述與對照父本PanAmerican Seed專有的繁殖株13819所交叉的99A-3300-1-10株的後裔。實行雙重分析，且結果顯示在下表9中。在包括雌蕊、花瓣和正發展種子的金盞花的花組織中觀察到了相對高水平的由LIS1引導的GUS表達。在雌蕊中觀察到高達351nmol/min/g[fw]的GUS表達。此水平可比得上在「Mitchell」矮牽牛花的花瓣組織中所觀察到的LIS1引導的GUS表達。在葉子組織中觀察到更低水平表達或無表達。在所測試的六個花託的兩個中，觀察到了高水平表達。
使用轉基因99A-3300-1-10的交叉後的後裔99A-10-2、99A-10-3、99A-10-17和99A-10-18的分析表明轉基因在性別上可遺傳。另外，該等後裔中的兩個(99A-10-17和99A-10-18)在所觀察到的最高花瓣表達當中。
花組織中LIS1引導的GUS表達水平高於在對照植物的花中觀察到的水平，並且除所測試的三個植物株以外，花組織中LIS1引導的GUS表達高於35S::gusA::nos轉化植物。因此，可推斷LIS1啟動子在金盞花中是可遺傳的並且可引導金盞花以及矮牽牛花花組織中的高水平轉基因表達。
表9GUS表達nmol/min/g[fw]


實例6對含有LIS1啟動子和crtB的質粒轉化的轉基因矮牽牛花株的評估分析來自用含有LIS1::crtB::nos的pBHX112轉化的兩株「Mitchell」矮牽牛花植物的花，以確定基因表達是否局限於特定的花載體。crtB基因對酶八氫番茄紅素合酶進行編碼，該酶產生八氫番茄紅，是一種早期在類胡蘿蔔素生物合成途徑中發現的無色類胡蘿蔔素中間物。將植物鑑別為112-3200-1-45和112-3200-1-59，並將花分成三部分花瓣、上花冠喉和下花冠喉。從每部分提取總RNA並實行RNA凝膠墨點分析。顯示在圖3中的結果表明crtB mRNA以中等水平呈現在花瓣和上花冠喉組織中並在較少程度上呈現在下花冠喉組織中，證明可探測在轉錄水平的基因表達。
為進一步證實花瓣組織中的基因活性，使用用LIS1::crtB::nos(pBHX112)構造轉化的「Mitchell」矮牽牛花株來實行HPLC分析。為了HPLC分析，在進行花瓣組織提取程序之前，實行用於在乾燥植物材料中提取胡蘿蔔素和葉黃素的法定方法(參閱，OfficialMethods of Analysis(1980)第13版，AOAC，Arlington，VA，sec.43.018-43.023)。提取過程中未使組織皂化。
HPLC設備包含裝配有冷凍自動取樣器、柱狀加熱器的和Waters Photodiode Array996探測器(Waters Corp.，Milford，MA)的Alliance 2690。用具有相同材料保護柱的3μm、2.0×150mm的YMC C30柱得以分離。從新澤西的薩默維爾的ICC Indofine Chemicals並從丹麥的Horsholm的DHI-WaterEnvironment得到標準。將乾燥樣品再懸浮在甲基第三丁基醚和甲醇中得到200微升的總體積並過濾。用梯度法分離類胡蘿蔔素。初始梯度條件為在每分鐘0.4微升流速的90％甲醇∶5％水∶5％甲基第三丁基醚。從0到15分鐘，流動相從初始條件變為80甲醇∶5水∶15甲基第三丁基醚，從15到60分鐘變為20甲醇∶5水∶75甲基第三丁基醚。對於隨後的10分鐘，該流動相恢復到初始條件並使該柱平衡額外15分鐘。將柱溫維持在27℃。注射液為10μL。在450nm時將峰面積用作總面積的百分數來表示下表10中所示的類胡蘿蔔素的值。以光譜特徵為基礎鑑別八氫番茄紅素，且從最大圖塊測定八氫番茄紅素麵積。數據表示成標準化的峰面積且括號中的數字表示每種類胡蘿蔔素貢獻給總的類胡蘿蔔素峰面積的百分數。
花瓣組織中LIS1啟動子活性所觀察的在β胡蘿蔔素水平上相比對照物而言超過10倍的增加中是明顯的。在轉基因中也觀察到了八氫番茄紅素的存在，其在對照花瓣組織中未能探測到。玉米黃素和葉黃素含量與對照物無顯著不同。
表10
平行的試驗中，同樣的雜交緩反應是將DNA用EB緩衝液10倍和100稀釋以檢測該技術的靈敏度。
實施例36.2對照組對照樣品同時按照下列方式製備A.比較HLA-DR試劑盒將10μl按照實施例5描述的方法用PCR擴增得到的DNA與20μl對-Bio-EG3-PDAM在60℃培養30min。標記後DNA用QIAquick柱純化，將最終洗脫下來的物質溶解到50μl EB緩衝液中。將45μl這種洗脫液用4.5μl試劑R4在室溫下培養5min使之變性，然後用4.5μl試劑R5中和。混合物中加入450μl雜交緩衝液R6和45μl檢測寡核苷酸。將100μl上述製備液加入到試劑盒提供的Strip R1的陽性對照孔(被擴增基因的一致序列捕獲)中，或鏈親和素包被的Combiplate 8平板中，或者對照Maxisorb平板中。
B.雜交所用DNA不與特異性探針雜交將10μl按照實施例5描述的方法用PCR擴增得到的DNA與20μl對-Bio-EG3-PDAM在60℃培養30min。樣品的其他處理方法與上面實施例A描述的相同。
C.無DNA對照將10μl試劑R6(雜交緩衝液)和100μl試劑R7(檢測寡核苷酸)加入到試劑盒提供的Strip R1的陽性對照孔中，或鏈親和素包被的Combiplate 8平板中，或者對照Maxisorb平板中。
將上述所有試驗中的Strips在37℃培養1h 30min，然後用100μl PBS Tween緩衝液(試劑盒的Color 0 HLA試劑)洗滌三次，加入100μl顯色試劑(Color 2試劑，PBS pH7.0；1％ Tween，0.2g/l BND；0.01g/l Ciproflaxacin)在暗處培養20min可以看到特異性檢測探針的存在，然後用50μl H2SO2(1.8N Color 3試劑)終止反應。然後測量反應介質在492nm處的吸光度值。
結果



a112A-3200-1-53×6923-1b112A-3200-1-45×Carpet Butter Cream實例7在用含有BAMT啟動子和gusA的質粒轉化的轉基因矮牽牛花株中的GUS表達的評估為使用BAMT啟動子評估花組織中的基因表達，用BAMT::gusA::nos構造轉化「Mitechell」矮牽牛花。苯甲酸羧甲基轉移酶BAMT是在苯甲酸甲酯生物合成中最後產物酶，苯甲酸甲酯是一種揮發性酯，已知是在金魚草花中最豐富的香味化合物。生成矮牽牛花轉化株。一旦在溫室中建立了開花植物，就用X-gluc溶液來著色來自十七株個體植物的樣本花和嫩葉以探測GUS活性。採用主觀分級制，0表明無可見表達，最高的4表示最高表達。
如下表12所示，對於任何矮牽牛花轉化株沒有在花瓣組織中探測到GUS表達。在金魚草中，大多數BAMT基因活性是在花冠的上下葉片中發現(Dudareva等人，The PlantCell，12949-961(2000))。因此，不能預測從花瓣組織中所表達的基因取得的啟動子可用於引導外來基因的花瓣表達。
表12GUS表達


*可能的弱表達**u未分析所參考的所有文獻和專利以引用的方式併入本文。
本專利藉助於前文的描述和實例得以說明。欲將前文的描述作為非限制性說明，因為對所屬領域的技術人員而言許多變更是顯而易見的。欲藉此將所有該等變化包括在隨附權利要求的範圍和精神內。
在不發散本發明概念和範圍的情況下，可對本發明方法的組合物、操作和排列進行改變。
序列表110鮑爾園藝公司(Ball Horticulturai company)120用於表達花組織中轉基因的LIS啟動子130BAL6019P0391PCT150US60/361，1921512002-03-011605170PatentIn version 3.121012113708212DNA213Clarkia brewerii220
221misc_feature222(448)..(448)223N＝A或C或G或T/U220
221misc_feature222(472)..(472)223N＝A或C或G或T/U4001aaatatccac aaaatttatt ttatctaata atgtatcaaa atctaaaata aaatttaggt60taagaagtgg gtgcaatttg ttaggcaccc acttcttaat gatccatgtg taatgtttgt120taggcacgct aagctggagt gcacattatt tgttggcttt gtcttgatgt ggtaatttta180tttttgccaa attatcacgt atatttgccc gatcgggcat tctaatatct aatctaaaaa240tataatttta agttagataa taatatctta cgaaataaac atttataata tttaaaacta300atattaactt ttgtccttca aatatttatt atcgtgtctt acgtaacaca cgaggtgatt360atatataaat ttaaaacgaa tcacagaaaa atttatgtca ttaaataatt attgatatat420attttattta atttactata atattatnta ctcgaatcat aattttttta angtattttg480atttacaaac ggtttatttc aagtaaaaaa cattttggaa tgaacatgga ttatataaca540
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220
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1.一種編碼啟動子的經分離的多核苷酸，其包含選自由以下各序列組成的群組的序列SEQ ID NO2及在嚴格條件下與SEQ ID NO2雜交的序列及其片段和變體。
2.根據權利要求1所述的多核苷酸，其中該等嚴格條件具有低嚴格性。
3.根據權利要求1所述的多核苷酸，其中該等嚴格條件具有高嚴格性。
4.一種經分離的多核苷酸，其包括在植物的至少一朵花中能引發轉錄的序列，其中所述序列是選自由以下各序列組成的群組SEQ ID NO2及在嚴格條件下與SEQ ID NO2雜交的序列及其片段和變體。
5.根據權利要求4所述的多核苷酸，其中該等嚴格條件具有低嚴格性。
6.根據權利要求4所述的多核苷酸，其中該等嚴格條件具有高嚴格性。
7.一種能夠引導植物花中轉錄的經分離的啟動子，其中所述啟動子包含具有選自由以下各序列組成的群組的序列的多核苷酸SEQ ID NO2及在嚴格條件下與SEQ ID NO2雜交的序列及其片段和變體。
8.根據權利要求7所述的多核苷酸，其中該等嚴格條件具有低嚴格性。
9.根據權利要求7所述的多核苷酸，其中該等嚴格條件具有高嚴格性。
10.一種表達盒，其包含根據權利要求7所述的啟動子和可操作性地與所述啟動子連結的多核苷酸序列，其中所述啟動子能夠引發所述多核苷酸序列在用所述表達盒轉化的植物的花中的轉錄和表達。
11.根據權利要求10所述的表達盒，其中該多核苷酸序列以正義方向插入該表達盒中。
12.根據權利要求10所述的表達盒，其中該多核苷酸序列以反義方向插入該表達盒中。
13.一種表達載體，其包含根據權利要求10所述的表達盒。
14.一種植物或植物部分，其用根據權利要求10所述的表達盒穩定地加以轉化。
15.根據權利要求14所述的植物部分，其中該等植物部分是選自由以下各部分組成的群組細胞、原生質體、細胞組織培養物、愈傷組織、細胞塊、胚芽、花粉、胚珠、花瓣、花柱、雄蕊、葉子、根、根尖及花葯。
16.根據權利要求14所述的植物，其中該植物是單子葉植物。
17.根據權利要求16所述的植物，其中所述單子葉植物是選自由以下各植物組成的群組石蒜科、禾本科(Graminae及Poaceae)。
18.根據權利要求14所述的植物，其中該植物是雙子葉植物。
19.根據權利要求18所述的植物，其中所述雙子葉植物是選自由以下各植物組成的群組夾竹桃科、紫菀科、菊科、鳳仙花科、秋海棠科、石竹科、藜科、葫蘆科、十字花科、龍膽科、牻牛兒苗科、大戟科、唇形科、豆科、百合科、半邊蓮科、錦葵科、藍雪科、花荵科、報春花科、毛茛科、薔薇科、茜草科、玄參科、茄科、傘形科、馬鞭草科及堇菜科。
20.根據權利要求14所述的植物種子，在其基因組內包含所述表達盒。
21.一種包含嵌合啟動子和多核苷酸序列的表達盒，其中所述多核苷酸序列可操作性地與所述嵌合啟動子連結，且其中所述嵌合啟動子包含(a)在植物花中具有啟動子優選活性的第一多核苷酸，其中所述多核苷酸具有選自由以下各序列組成的群組的序列SEQID NO2及在嚴格條件下與SEQ ID NO2雜交的序列及其片段和變體；及(b)至少一第二多核苷酸序列，其中所述多核苷酸能夠引發在植物中多核苷酸序列的轉錄。
22.根據權利要求21所述的表達盒，其中該嵌合啟動子包含在植物的花中具有啟動子優選活性的至少一第二多核苷酸序列。
23.根據權利要求21所述的表達盒，其中該嵌合啟動子包含在植物花中具有啟動子優選活性的第二多核苷酸序列。
24.根據權利要求21所述的表達盒，其中該嵌合啟動子包含(a)在植物的花中具有啟動子優選活性的第一多核苷酸，其中所述多核苷酸具有選自由以下各序列組成的群組的序列SEQ ID NO2及在嚴格條件下與SEQ ID NO2雜交的序列及其片段和變體；及(b)在植物的花中具有啟動子優選活性的第二多核苷酸，其中所述第二多核苷酸具有選自由以下各序列組成的群組的序列SEQ ID NO2及在嚴格條件下與SEQ ID NO2雜交的序列及其片段和變體。
25.根據權利要求21所述的表達盒，其中該可操作性地與嵌合啟動子連結的多核苷酸序列以正義方向插入該表達盒中。
26.根據權利要求21所述的表達盒，其中該可操作性地與嵌合啟動子連結的多核苷酸序列以反義方向插入該表達盒中。
27.一種表達載體，其包含根據權利要求21所述的表達盒。
28.一種植物或植物部分，其用根據權利要求21所述的表達盒穩定地加以轉化。
29.根據權利要求28所述的植物部分，其中該等植物部分是選自由以下各部分組成的群組細胞、原生質體、細胞組織培養物、愈傷組織、細胞塊、胚芽、花粉、胚珠、花瓣、花柱、雄蕊、葉子、根、根尖及花葯。
30.根據權利要求28所述的植物，其中該植物是單子葉植物。
31.根據權利要求30所述的植物，其中所述單子葉植物是選自由以下各植物組成的群組石蒜科、禾本科(Graninae及Poaceae)。
32.根據權利要求28所述的植物，其中該植物是雙子葉植物。
33.根據權利要求32所述的植物，其中所述雙子葉植物是選自由以下各植物組成的群組夾竹桃科、紫菀科、菊科、鳳仙花科、秋海棠科、石竹科、藜科、葫蘆科、十字花科、龍膽科、牻牛兒苗科、大戟科、唇形科、豆科、百合科、半邊蓮科、錦葵科、藍雪科、花荵科、報春花科、毛茛科、薔薇科、茜草科、玄參科、茄科、傘形科、馬鞭草科及堇菜科。
34.根據權利要求28所述的植物的種子，在其基因組內包含所述表達盒。
35.一種用DNA分子穩定地轉化的轉基因植物細胞，該DNA分子包含能夠引發植物的花中轉錄的啟動子，其中所還啟動子包含具有選自由以下各序列組成的群組的序列的多核苷酸SEQ ID NO2及在嚴格條件下與SEQ ID NO2雜交的序列及其片段和變體。
36.根據權利要求35所述的轉基因植物細胞，其中DNA分子進一步包含可操作性地與該啟動子連結的選定編碼區。
37.根據權利要求36所述的轉基因植物細胞，其中該選定編碼區位於正義方向。
38.根據權利要求36所述的轉基因植物細胞，其中該選定編碼區位於反義方向。
39.根據權利要求35所述的轉基因植物細胞，其中該等嚴格條件具有低嚴格性。
40.根據權利要求35所述的轉基因植物細胞，其中所該等嚴格條件具有高嚴格性。
41.根據權利要求36所述的轉基因植物細胞，其中所述選定編碼區對以下進行編碼抗昆蟲性蛋白、抗細菌疾病性蛋白、抗真菌疾病性蛋白、抗病毒疾病性蛋白、花青甙生物合成酶、類胡蘿蔔素生物合成酶、花香生物合成蛋白、可篩選的標記蛋白或提升花壽命的蛋白。
42.根據權利要求36所述的轉基因植物細胞，其中所述選定編碼區對選自由以下可篩選標記蛋白組成的群組進行編碼β-葡糖苷酸酶、β-內醯胺酶、β-半乳糖苷酶、螢光素酶、水母發光蛋白和綠色螢光蛋白。
43.根據權利要求36所述的轉基因植物細胞，其中所述選定編碼區對產生以下化合物的花青甙生物合成酶進行編碼天竺葵色素、矢車菊色素、翠花素、芍藥色素、錦葵色素和矮牽牛素。
44.根據權利要求36所述的轉基因植物細胞，其中所述選定編碼區對產生以下化合物的類胡蘿蔔素生物合成酶進行編碼八氫番茄紅素、六氫番茄紅素、ζ-胡蘿蔔素、鏈孢紅素、番茄紅素、γ-胡蘿蔔素、β-胡蘿蔔素、α-隱黃素、β-隱黃素、角黃素、辣椒紅素、辣椒玉紅素、玉米黃素、堇菜黃素、新葉黃素、花葯黃質、葉黃素和蝦青素。
45.一種在轉基因植物的花中表達選定蛋白的方法，該方法包括以下步驟(a)獲得包含選定編碼區的表達載體，該編碼區可操作性地與能夠引發植物花中轉錄的啟動子連結，其中所述啟動子包含具有選自由以下各序列組成的群組的序列的多核苷酸SEQ ID NO2及在嚴格條件下與SEQ ID NO2雜交的序列及其片段和變體；(b)用所述載體轉化受體植物細胞；及(c)再生一表達所述受體植物細胞的所述選定蛋白的轉基因植物。
46.根據權利要求45所述的方法，其中該選定編碼區位於正義方向。
47.根據權利要求45所述的方法，其中該選定編碼區位於反義方向。
48.根據權利要求45所述的方法，其中該等嚴格條件具有低嚴格性。
49.根據權利要求45所述的方法，其中該等嚴格條件具有高嚴格性。
50.根據權利要求45所述的方法，其中所述轉化步驟包括選自由以下各方法組成的群組中粒子槍法、聚乙二醇介導的原生質體的轉化、電穿孔法和土壤桿菌介導的轉化。
51.根據權利要求50所述的方法，其中所述轉化步驟包括粒子槍法。
52.根據權利要求50所述的方法，其中所述轉化步驟包括聚乙二醇介導的原生質體的轉化。
53.根據權利要求50所述的方法，其中所述轉化步驟包括電穿孔法。
54.根據權利要求50所述的方法，其中所述轉化步驟包括土壤桿菌介導的轉化。
55.根據權利要求45所述的方法，其中所述受體植物細胞是來自單子葉植物。
56.根據權利要求55所述的方法，其中該單子葉植物是選自由以下各植物組成的群組石蒜科、禾本科(Graninae及Poaceae)。
57.根據權利要求45所述的方法，其中所述受體植物細胞是來自雙子葉植物。
58.根據權利要求57所述的方法，其中該雙子葉植物是選自由以下各植物組成的群組夾竹桃科、紫菀科、菊科、鳳仙花科、秋海棠科、石竹科、藜科、葫蘆科、十字花科、龍膽科、牻牛兒苗科、大戟科、唇形科、豆科、百合科、半邊蓮科、錦葵科、藍雪科、花荵科、報春花科、毛茛科、薔薇科、茜草科、玄參科、茄科、傘形科、馬鞭草科和堇菜科。
全文摘要
本發明涉及一種衍生自S－芳樟醇合酶基因的經分離的啟動子，其可用於向植物的至少一朵花中的至少一個經可操作性連結的多核苷酸或選定的基因授予高水平的表達。
文檔編號C12N9/00GK1639345SQ03805029
公開日2005年7月13日 申請日期2003年2月28日 優先權日2002年3月1日
發明者蘭德爾·豪普特曼, 艾倫·布洛爾斯, 羅伯特·艾森裡奇 申請人:鮑爾園藝公司