來自棉花的纖維特異性β－微管蛋白啟動子的分離和鑑定的製作方法

2023-12-10 04:27:46

專利名稱：來自棉花的纖維特異性β－微管蛋白啟動子的分離和鑑定的製作方法
技術領域：
本發明涉及植物分子生物學領域，具體地涉及轉基因植物和用於創建轉基因植物的啟動子，更具體地涉及纖維特異性啟動子。
背景技術：
棉花是紡織工業最廣泛使用的天然纖維，全世界棉花年產量為1億捆，總值450億美元。在過去的幾十年間雖然已通過經典育種明顯改進了纖維的品質和產量，但是通過經典育種進一步改善纖維性質的潛力已被限制，因為需要物種相容性和可利用的性狀。基因工程提供了進一步改良棉花的新途徑，其是通過導入基因以產生具有高度所需特徵的新種質而進行。
棉花纖維(種毛)是經歷快速同步延伸的單細胞毛狀體。皮層(cortical)微管提供了規範和調控細胞延伸的纖維素微原纖維排列所需的空間信息(Giddings和Staehelin，1991；Cyr和Palevitz，1995；Fisher和Cyr，1995)。纖維發育由4個重疊階段組成(即起始、初級細胞壁形成、次生細胞壁形成和成熟)(Basra和Malik，1984)。微管蛋白和肌動蛋白可能在發育纖維細胞中起重要功能作用。成熟纖維是纖維素、水、少量蛋白質、果膠、半纖維素、礦物質、蠟、少量有機酸、糖和色素的生物學組合物，其提供優異的穿著性能和美學(Arthur，1990；Basra和Malik，1984；Ryser，1985)。纖維分化和發育需要許多基因，這些基因在纖維發育的不同階段差異表達，目前僅鑑別了參與大量纖維特異性結構蛋白、酶、多糖、蠟或木質素的生物合成的一些基因(John和Crow，1992；John，1996a；Song和Allen，1997；Ma等，1997；Kawai等，1998；Whittaker和Triplett，1999)。這些分離的基因由於其纖維特異性表達可被認為具有改良棉花纖維的潛在應用。例如，John已使用纖維特異性基因啟動子產生基因工程棉花以收穫改變的纖維(John，1996b，1997a，1997b)。
啟動子是確定植物和動物發育過程中基因表達的時空特異性的DNA片段。在過去十年間已從各種植物和動物中鑑別和分離了許多組織特異性基因及其啟動子，包括一些棉花組織特異性基因和啟動子(Loguerico等，1999；Kawai等，1998；Song和Allen，1997；Ma等，1997；John，1996a；Rinehart等，1996；Hasenfratz等，1995；John和Peterson，1994；John和Crow，1992)。有幾種啟動子以顯示在棉花中以纖維特異性方式控制基因表達(Rinehart等，1996；John，1996a；John和Crow，1992)。一些植物組織特異性啟動子可被用於在特異組織中以發育調控模式表達外源蛋白質(John，1996b，1997a，1997b)。
發明概述從棉花中分離了編碼β-微管蛋白的纖維特異性基因(命名為CFTUB2)。所分離的完整CFTUB2 cDNA長度為1.623kb，包括1.338kb的開放讀框。基於CFTUB2 cDNA的序列，從棉花中分離了兩個CFTUB2啟動子片段(1.433kb和0.984kb)。將兩個CFTUB2啟動子片段(1.3和0.9kb)與GUS基因融合以構建用於分析啟動子功能的基因表達載體。通過Southem印跡雜交鑑別了具有CFTUB2啟動子/GUS融合基因的轉基因棉花和菸草植物。在所研究的所有轉基因棉花植物中，僅在新生纖維中檢測到GUS活性，而在花器官如花葯、花瓣和萼片中或在和根中未檢測到該活性。這一結果與Northem印跡分析一起提示CFTUB2啟動子在棉花中是纖維特異性的。該啟動子在棉花纖維中在轉錄水平控制特異基因表達。所分離的啟動子可用於通過基因操作改良棉花纖維，產生具有高纖維品質和產量的新棉花品種。
附圖簡述

圖1示出棉花CFTUB2基因cDNA的核苷酸序列(1623bp；SEQID NO1)。
圖2示出分離的1433bp CFTUB2啟動子片段的核苷酸序列(SEQID NO2)，984bp片段相應於這一序列的核苷酸449-1433。
圖3示出在表達載體中的與gus基因融合的CFTUB2啟動子的構建體。
詳細描述CFTUB2啟動子是棉花中的活性纖維特異性啟動子。來自各種棉花組織的cDNA的Northern印跡分析結果顯示包含CFTUB2基因的一cDNA克隆在8和14 DPA(開花後天數)的初生(young)纖維中強表達，並且在4、8和14 DPA的初生胚珠中也表達，但在所有其它組織中很少表達或不表達。該cDNA克隆的測序揭示其長度為1623bp，含有一1338bp的開放讀框(圖1)。將棉花CFTUB2的核苷酸和預計的多肽序列與資料庫進行比較，發現CFTUB2 cDNA與已知的來自其它植物(如擬南芥屬、菸草、水稻、大豆、玉米、馬鈴薯、胡蘿蔔等)的β-微管蛋白cDNA和基因在胺基酸水平有96-98％同源性，在核苷酸水平有78％以上的同源性(Liaud等，1992；Snustad等，1992；Villemur等，1994；Tonoike等，1994；Taylor等，1994；Kang等，1994；Okamura等，1997；Chu等，1998；Okamura等，1999)。
CFTUB2基因的轉錄物顯示在8 DPA的棉花新生纖維中有最高的積累，隨後隨著纖維的進一步發育基因產物(mRNA)的積累有一可見的降低。棉花胚珠不同發育階段中的基因表達的比較也示出基因轉錄物在8 DPA胚珠中的積累比在4和14 DPA中的積累多，隨著從8 DPA至28 DPA纖維發育，基因產物的積累逐漸降低至不可檢水平。這提示該基因與其它棉花纖維特異性基因一樣在棉花纖維和胚珠發育過程中以轉錄水平嚴格調控而特異表達(Whittaker和Triplett，1999；Shin和Brown，1999；Kawai等，1998；John，1996a；Song和Allen，197；Ma等，1997；Rinehart等，1996；John和Crow，1992)。
分離該啟動子區的兩個片段並分別克隆進pGEM-T載體。CFTUB2啟動子的一個片段長度為1433bp(圖2)，另一個長度為984bp。兩個片段均是有活性的纖維特異性啟動子。用CFTUB2啟動子/GUS融合基因構建體經農桿菌介導的基因轉移轉化菸草和棉花，用含有CaMV35S啟動子/GUS融合體的pBI121載體作為陽性對照。與Northern印跡分析結果一致，在所研究的所有31個轉基因棉花植物中，由CFTUB2啟動子驅動的GUS基因特異地在新生纖維中表達，但不在其它組織中表達；而在陽性對照棉花植物(35SGUS)的所有組織中均檢測到GUS活性。總共獲得36個轉化棉花植物，將其移植到土壤中生長成熟。類似地，發現在CFTUB2啟動子驅動下的GUS基因活性僅在所研究的所有15個轉基因菸草植物的種子中檢測到，提示CFTUB2啟動子活性在菸草中也是組織特異性的(棉花纖維是種皮的延伸種毛，其與菸草種皮有組織學相應性)。這一結果與上述Northern印跡分析結果一起表明CFTUB2啟動子在轉錄水平控制棉花纖維中基因特異表達。
因此，本發明的一個實施方案是得自棉花纖維β-微管蛋白基因CFTUB2的纖維特異性啟動子。
本發明的另一實施方案是包含棉花纖維CFTUB2基因啟動子的1433bp活性片段的纖維特異性啟動子。
本發明的再一實施方案是包含棉花纖維CFTUB2基因啟動子的984bp活性片段的纖維特異性啟動子。
本發明的再一實施方案是棉花纖維特異性啟動子，其包含SEQID NO2的CFTUB2啟動子片段的活性片段。活性片段是長度比SEQID NO2短但仍保持作為棉花中纖維特異性啟動子的活性的序列。片段可包含SEQ ID NO2序列的切除、缺失、截短或取代，或其組合。優選的活性片段由SEQ ID NO2的核苷酸449-1433組成。
本發明的啟動子可用於產生具有改變的纖維特徵的轉基因棉花。本發明的纖維特異性啟動子的應用使得可以在棉花纖維中選擇性表達轉基因，從而可採用的轉基因類型更多。選擇性表達避免了以下問題，如由轉基因的系統表達造成的轉基因植物的代謝負擔，或者轉基因在非纖維組織中表達的副作用。在棉花纖維中表達而在棉花植物的其它部分不表達的所需基因的例子包括(1)彩色棉花所需的花青苷基因，(2)用於增加棉花纖維強度的來自蠶或蜘蛛的絲蛋白，(3)用於改善熱性質和絕緣特徵的棉花纖維中的聚羥基丁酸酯的生物合成(John等，1996)。現有技術中有無數增強纖維的基因的例子，它們可有利地與本發明的啟動子連接，用於經熟知技術轉化棉花(參見，例如Umbeck，1992)，以實現轉基因在轉基因棉花纖維中的表達。參見例如，John，1996b，1997a，1997b；John等，1996。實施例1 編碼在棉花纖維發育早期表達的CFTUB2序列的纖維特異性cDNA的分離棉花種子用70％乙醇表面消毒30-60秒，用10％H2O2表面消毒30-60分鐘，之後用無菌水清洗。種子在培養室中於光照下28℃在1/2MS培養基上萌發，從無菌幼苗中切下的子葉和下胚軸用作轉化外植體材料。棉花植物在罐中培養以用於DNA和RNA提取。
用硫氰酸胍方法或SV總RNA分離系統(Promega)從棉花新生纖維、子房、花葯、花瓣、萼片、葉和根中提取總RNA。用mRNA純化試劑盒(Pharmacia Biotech)的寡(dT)-纖維素旋轉柱純化聚(A)+RNA。用cDNA合成試劑盒(Pharmacia Biotech)合成棉花cDNA。通過將cDNA片段插入ZAP表達載體(Stratagene)構建棉花cDNA文庫。
將分別來自約8和14 DPA的棉花新生纖維的聚(A)+RNA轉化成cDNA，用於構建棉花cDNA文庫。從該纖維cDNA文庫中隨機挑取約200個cDNA克隆，隨後測序。根據序列數據選擇潛在參與細胞擴張的一些克隆。
為發現轉錄物在棉花纖維中特異表達的cDNA克隆，用來自克隆的探針與分離自棉花纖維、胚珠、花葯、花瓣、萼片、蕾、葉和根的總RNA進行Northern印跡雜交，從而分析所選cDNA克隆的表達模式。來自不同棉花組織的RNA樣品在瓊脂糖—甲醛凝膠上分離，經毛細印跡轉移至Hybond-N尼龍膜上。RNA Northem印跡在68℃、ExpressHyb溶液(Clontech)中與隨機標記(PromegaPrime-a-Gene標記系統)製備的32P cDNA探針雜交。雜交後，在68℃用0.1×SSC，0.5％SDS洗印跡30-60分鐘。實驗結果表明一個cDNA克隆在8和14 DPA的新生纖維中強表達，在4、8和14 DPA的初生胚珠中也表達，但在所有其它組織中很少或不表達。
將PCR片段和cDNA片段亞克隆進載體中，用製備自Qiagen質粒試劑盒的質粒DNA作為PCR反應的模板。由自動測序儀測序PCR產物。該cDNA克隆的測序表明其長度為1623bp，含有1338bp的開放讀框，與β-微管蛋白基因相同(圖1)。這是從棉花中分離的第一個CFTUB2 cDNA克隆。將棉花CFTUB2的核苷酸和預計的多肽序列與資料庫進行比較，發現CFTUB2 cDNA與已知的來自其它植物(如擬南芥屬、菸草、水稻、大豆、玉米、馬鈴薯、胡蘿蔔等)的β-微管蛋白cDNA和基因在胺基酸水平有96-98％同源性，在核苷酸水平有78％以上的同源性(Liaud等，1992；Snustad等，1992；Villemur等，1994；Tonoike等，1994；Taylor等，1994；Kang等，1994；Okamura等，1997；Chu等，1998；Okamura等，1999)。
來自不同棉花組織的總RNA用於逆轉錄用作示差展示PCR反應中的模板的第一鏈cDNA。用示差展示試劑盒(Clontech)進行示差展示分析。用2pg總RNA作為逆轉錄的起始材料，以寡(dT)作為引物在42℃反應1小時合成第一鏈cDNA。示差展示PCR反應為94℃ 5分鐘、40℃ 5分鐘和68℃ 5分鐘的初始循環、隨後兩個循環的94℃ 2分鐘、40℃ 5分鐘和68℃ 5分鐘、隨後25個循環的94℃ 1分鐘、60℃ 1分鐘和68℃ 2分鐘以及最終的68℃延伸7分鐘。切下差示展示靶帶，再擴增以進行進一步分析。取可重複的纖維特異性差示展示產物進行進一步分析。收穫每一靶帶的cDNA，經PCR擴增再生。隨後將分離的cDNA亞克隆進載體並測序。
Northern印跡分析顯示CFTUB2基因的轉錄物在8 DPA的棉花新生纖維中有最高的積累，隨後隨著纖維的進一步發育基因產物(mRNA)的積累有一可見的降低。棉花胚珠不同發育階段中的基因表達的比較也示出基因轉錄物在8 DPA胚珠中的積累比在4和14DPA中的積累多，隨著從8 DPA至28 DPA的纖維發育，基因產物的積累逐漸降低至不可檢水平。這提示該基因與其它棉花纖維特異性基因一樣在棉花纖維和胚珠發育過程中以轉錄水平嚴格調控而特異表達(Whittaker和Triplett，1999；Shin和Brown，1999；Kawai等，1998；John，1996a；Song和Allen，197；Ma等，1997；Rinehart等，1996；John和Crow，1992)。實施例2 CFTUB2啟動子的分離基於篩選的CFTUB2 cDNA序列，經基因組步行PCR從棉花基因組步行(Genome Walker)文庫中分離CFTUB2啟動子。
用下述方法棉花植物葉中提取和純化總DNA，將液氮加至4g葉組織，充分均質葉。在一50ml試管中向均質組織中加入20ml冰冷的提取緩衝液(63g/L葡萄糖、0.1M Tris.HCl(pH8.0)、5mM EDTA、20g/L PVP-40、1g/L DIECA、1g/L抗壞血酸、2ml/L β-巰基乙醇)，250rpm離心15分鐘。除去上清後，向每管中加入10ml裂解緩衝液。將重懸的沉澱在65℃保溫30分鐘。向每管中加入10ml氯仿，與樣品混合併在3500rpm離心10分鐘。將上清轉移至新管中，重複1次氯仿提取。將上清轉移至新管中，向每管中加入0.6體積異丙醇進行DNA沉澱。3500rpm離心30分鐘後，用70％乙醇洗DNA。隨後將分離的基因組DNA溶解在無菌水或TE(10mM Tris.HCl，1mMEDTA)中備用。
從棉花植物的葉中構建棉花基因組DNA文庫。將DNA用BamHI部分消化，將DNA片段克隆進ZAP表達載體(Stratagene)的BamHI位點。
用通用基因組步行試劑盒(Clontech)構建基因組步行文庫。來自棉花葉的基因組DNA分別用5種限制酶消化，隨後經苯酚/氯仿純化，並用乙醇沉澱。將消化的DNA於基因組步行銜接子連接。相繼進行兩輪基因組步行PCR反應。在初級PCR中使用1微升每一基因組步行DNA文庫作為模板，初級PCR引物用作二級PCR的模板。PCR起始為95℃ 1分鐘，隨後35個循環的95℃ 15秒、68℃4分鐘，最終在68℃延伸6分鐘。切下靶PCR條帶，經Geneclean試劑盒(Bio 101)純化。
分離啟動子區的兩個片段並分別克隆進pGEM-T載體。CFTUB2啟動子的一個片段長度為1433bp，另一個片段長度為984bp(圖2)。經PCR方法在棉花0.9kb CFTUB2啟動子片段的5-末端和3』-末端分別產生HindIII和BamHI位點。將HindIII/BamHI片段首先亞克隆進pGEM-T載體(Promega)。用HindIII和BamHI消化含有CFTUB2啟動子片段的質粒DNA，經瓊脂糖凝膠電泳分離消化的片段。通過在pBI121載體的HindIII/BamHI位點中插入該片段置換CaMV35S啟動子而產生嵌合CFTUB2啟動子/GUS構建體。
將1.3kb BamHI/BamHI CFTUB2啟動子片段首先亞克隆進pGEM-T載體(Promega)。用BamHI消化含有CFTUB2啟動子片段的質粒DNA，經瓊脂糖凝膠電泳分離消化的片段。通過將該片段插入pBI101載體的BamHI位點產生嵌合CFTUB2啟動子/GUS構建體。實施例3 CFTUB2啟動子的功能分析為了鑑定CFTUB2啟動子在CFTUB2基因的纖維特異性表達中的功能，在基因表達載體pBI101或pBI121(缺失CaMV35S啟動子)中分別將CFTUB2啟動子的1.3kb片段或0.9kb片段與gus編碼序列融合(圖3)。用CFTUB2啟動子/GUS融合基因的構建體用農桿菌介導的基因轉移轉化菸草和棉花，用含有CaMV35S啟動子/GUS融合體的pBI121載體作為陽性對照。CaMV35S啟動子在棉花和其它植物的所有組織中均是活性的，其是一種組成型啟動子(Odell等，1985；Ow等，1987；McCabe和Martinell，1993)。將含有CFTUB2啟動子/GUS融合基因或CaMV35S啟動子/GUS對照的雙元載體轉移進根瘤農桿菌菌株LBA 4404中。用於轉化的棉花外植體得自如實施例1所述培養的棉花幼苗。菸草外植體材料得自菸草幼苗。菸草種子用70％乙醇表面消毒30-60秒，用0.1％HgCl2表面消毒15分鐘，隨後用無菌水洗。種子在培養室中於光照下28℃在1/2MS培養基上萌發，從無菌幼苗上切下的葉用作轉化外植體。用載體經農桿菌轉化棉花子葉和下胚軸外植體及菸草葉外植體，將轉化植物移植到溫室土壤中生長至成熟。
將菸草葉切成2×2cm的片，浸入農桿菌懸液5分鐘。在具有1mg/L 6-BA的MS培養基上於28℃培養感染的菸草外植體48小時，然後轉移至含有100mg/L卡那黴素和1mg/L 6-BA的MS選擇培養基上培養20-30天，選擇轉化的莖(卡那黴素抗性莖)。從愈傷組織上切下轉化莖，在含有50-100mg/L卡那黴素的MS培養基上生根。將轉化的菸草植物轉移至溫室土壤中生長至成熟。
用子葉和下胚軸作為外植體進行棉花轉化。棉花種子用70％乙醇表面消毒30秒鐘，用10％H2O2表面消毒60分鐘，隨後用無菌水洗。這些種子在無菌水中於28℃保溫。過夜後，種子發芽。取出胚並置於IM培養基(1/2{MS(大量營養素，微量營養素，EDTA-Fe)+VB1 10mg/L+VB6 1mg/L+VPP 1mg/L+肌醇100mg/L}+phytogel2g/L pH＝6.4)上，於28℃保溫7天。棉花的子葉和下胚軸用作轉化外植體。在切成5mm2(mm)塊後，將外植體浸入根瘤農桿菌菌株LBA 4404懸液(OD600＝0.2-0.4)中15分鐘，然後將外植體置於CM培養基(MS(大量營養素，微量營養素，EDTA-Fe)+VB110mg/L+VB6 1mg/L+VPP 1mg/L+肌醇100mg/L+2，4-D 0.1mg/L+KT0.1mg/L+葡萄糖30g/L+MgCl20.7mg/L+phytogel 2g/L pH＝6.4)上於24℃培養2天。用液體MS培養基洗後，將外植體置於SM培養基(MS(大量營養素，微量營養素，EDTA-Fe)+VB1 10mg/L+VB61mg/L+VPP 1mg/L+肌醇100mg/L+2，4-D 0.1mg/L+KT 0.1mg/L+葡萄糖30g/L+MgCl20.7mg/L+phytogel 2g/L+卡那黴素50mg/L+Cefutoxime 200mg/L pH＝6.4)上在培養室中於光照下、28℃進行選擇，每月傳代培養。在SM上傳代培養2-3個月後，從外植體誘導愈傷組織。將愈傷組織轉移至DM培養基(MS(大量營養素，微量營養素，EDTA-Fe)+VB1 10mg/L+VB6 1mg/L+VPP 1mg/L+肌醇100mg/L+KNO319g/L+MgCl20.7mg/L+葡萄糖30g/L++phytogel3g/L pH＝6.4)上，每月傳代培養。約5個月後，體細胞胚開始形成。在DM培養基上持續培養幼胚，直至它們發育成熟。將成熟胚轉移至GM培養基(1/2{MS(大量營養素，微量營養素，EDTA-Fe)+VB110mg/L+VB6 1mg/L+VPP 1mg/L+肌醇100mg/L}+NAA 0.01mg/L+葡萄糖30g/L++phytogel 3.5g/L pH＝6.4)上，於盒中發育成小植物。然後將小植物移植到土壤中進行植物生長，收集轉基因種子。
通過DNA Southern印跡雜交和GUS組織化學分析來分析具有嵌合CFTUB2啟動子/GUS基因(或35SGUS基因)的轉基因菸草和棉花植物以及作為陰性對照的非轉化植物。用限制酶消化來自棉花和菸草葉的總基因組DNA，在瓊脂糖凝膠上分離，並經毛細印跡轉移至Hybond-N尼龍膜上。DNA Southem印跡在68℃、ExpressHyb溶液(Clontech)中與隨機標記(Promega Prime-a-Gene標記系統)製備的32P DNA探針雜交。雜交後，在68℃用0.1×SSC，0.5％SDS洗印跡30-60分鐘。在-70℃將32P標記的尼龍膜曝光在X-光片上進行放射自顯影。Southem印跡分析的結果證實CFTUB2啟動子/GUS基因整合進菸草和棉花基因組中。總共獲得325個轉化的棉花植物，它們屬於31個轉化品系，將它們移植在土壤中生長至成熟。
根據Jefferson等(1987)所述的方案稍作修改在轉基因菸草和棉花植物中進行GUS活性的組織化學分析。將植物的新鮮組織在由0.1M磷酸鈉(pH7.0)，10mM乙二胺四乙酸(EDTA)，0.5mM亞鐵氰化鉀和0.5mM鐵氰化鉀及0.1％ X-gluc(Clontech)組成的X-gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚葡糖苷酸)溶液中保溫過夜。染色的植物材料隨後通過依次用100％和70％乙醇清洗而洗清並固定，檢查樣品並直接或在顯微鏡下照相。與Northem印跡分析結果一致，在所研究的所有31個轉基因棉花植物中，由CFTUB2啟動子驅動的GUS基因在新生纖維中特異表達，但是在其它組織中不表達，而GUS活性在陽性對照棉花植物(35SGUS)的所有組織中均檢測到。總共獲得36個轉化的棉花植物，並將它們移植至土壤中生長成熟，所有植物均是僅在新生纖維中有可檢測水平的GUS活性，但在花器官如花葯、花瓣和萼片或在葉和根中沒有可檢測水平的GUS活性。類似地，發現在CFTUB2啟動子驅動下的GUS基因活性僅在所研究的所有15個轉基因菸草植物的種子中檢測到，提示CFTUB2啟動子活性在菸草中也是組織特異性的。這一結果與上述Northem印跡分析結果一起表明CFTUB2啟動子在棉花纖維中在轉錄水平控制基因特異性表達。
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序列表110蔡林李學寶程寧輝劉建偉120來自棉花的纖維特異性β-微管蛋白啟動子的分離和鑑定1302577-1381401411602170PatentIn Ver.2.121012111623212DNA213Arabidopsis sp.4001ggcacgagta tatttttcct ctccaatttt ccgtcacttt cccgagaaaa tgagagaaat 60ccttcacatc caaggtggcc aatgcggcaa tcagatagga gccaagttct gggaagtcgt 120atgtgccgaa catggcatcg attcaacggg tcgatatggt ggtgactcgg agctccagct 180tgagcgaatc aatgtttact acaacgaagc cagttgtggc cgttttgttc cccgcgcagt 240tttaatggat ctggaacccg gaaccatgga tagcgtaaga tccggtcctt acggacaaat 300tttccgaccc gataacttcg ttttcggaca gtccggtgcg ggaaacaatt gggctaaggg 360acattacact gaaggagcgg agcttatcga ttccgttctc gacgtggtta gaaaggaagc 420cgaaaattgc gattgcttgc aagggtttca ggtatgccat tctttgggaa gaagaacggg 480ttccggaatg ggaacgttgt tgatatcgaa gatacgagag gagtatccgg accgaatgat 540gcttacgttt tcggtgtttc catctcccaa ggtttctgat actgttgttg aaccttacaa 600cgcgacactc tcagttcatc agcttgtgga aaatgctgat gagtgtatgg ttcttgataa 660cgaagctctc tacgatatct gtttccgtac cctcaagctc actactccaa gttttggaga 720tctcaaccat ctaatttctg ccaccatgag tggtgtaaca tgctgccttc gcttccctgg 780tcagcttaac tcagatctcc gcaaacttgc tgtaaacctt attccattcc ctcgactaca 840tttcttcatg gtgggatttg cgcctctcac ctcacgcggt tcccaacagt acagagccct 900cactgtccct gaacttacac agcaaatgtg ggatgccaag aacatgatgt gtgcagctga 960tcctcgacac ggtcgatacc tcacagcatc agcggtcttc cgtgggaaga tgagcacgaa 1020agaggttgat gagcagatga tcaatgtgca aaacaagaac tcatcttact ttgttgaatg 1080gatcccgaac aatgtgaagt ccactgtttg tgacatccct ccaatcggct taaagatggc 1140atccacattt atcgggaact ctacttcaat ccaagagatg ttcaggaggg tgagtgaaca 1200attcactgcc atgttccgta ggaaagcttt cttgcattgg tatactggag aagggatgga 1260tgagatggag ttcacagaag cggagagtaa catgaatgac ttggtttctg agtaccaaca 1320ataccaggat gcaactgcag atgatgaaga gtacgaggaa gaggaggaat acgaggcaga 1380ggcttaaaat ctaatggaat aatttggatg tttttcgttg tgttttggat tgggcttgtg 1440gagtgtgttg atgcaatttc tcactgcctg tttttggtct ttggatcact gtattgttga 1500ttgtgtcgac tttagttttg tcctcacagc ttacggagta tatgttgttg tattgcttgt 1560tgattcatct tataagtaat ttctagtaca ccttaagtaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1620aaa 162321022111433212DNA213Arabidopsis sp.4002actatagggc acgcgtggtc gacggcccgg gctggtgctt gatatctatg attttcagat 60ttgcataaga cttctatcta tcagaagacg cctgcagagg atcccaaatt agtctaaaat 120tatcttcagt ctcggaaacc aactcaggac ccaaaacccg tcgctcaccc aactcagtct 180aatataacag agtatgacac ttatgaccat atagagcctc gtaaggtgcc atctagatgc 240cagattggaa actgttattg taggcgaact caactaacgg taaaaaatcc tctcaactac 300cttagtaata aatcacatag ctccaaatcg tatcctctag tatatgaatc accttctcaa 360attgaccatc ggtctgagga tggaatgcag accggtgcca ccgatttact aatggtacct 420ataaaaaatt attatttttt aaaaaattga tgtgaccagt ggttggagag agaggtctac 480cgattggtca agtggcacca attttttatt ttacctcctg cctagattcg taaatactat 540tgcatttatc tcatttcatt atttatttaa ttattttata ttatttggat aaaaattcta 600atactttact tttttttaaa aagaatttat ttaattattt tatattattt agataaaaat 660tctaatactt tacttttttt ttaaaaagaa tttcaattgc gttttttctt aatttagttt 720taattctata ctaattataa aaattctgat cggattagtg tggtgtcaaa gtcaagtcac 780atgaattttg ttggagaaaa aataaaaatt aaacacattt ttcgattaat ttattatata 840tataataata taaacacatt tttatttaat gttgtcaata atatttttta attaaaattt 900cagcacaaca attacactct catcattaaa tttaatctta ttaccataat taaaattgtg 960aggacaatta ttttttaatc tcaccctcca ttaatgcata ttattaattt ttgttcgata 1020cttcttattt cactcctaac attaatcatt aacccaattt tgaactgtta taatttctta 1080acttattcac tattgtggct ctgggtccat ctggaaaggc caccgtccag gctgtccaac 1140cacactttgc cacgtcatca attccagtaa ctacattgtt acagttacta agcaaatccc 1200aatttcaaaa attcaatttc ccaggaaaac gaaacgtccg ttactaaccg acctaaaacc 1260cagctcaacc tgccgtcaat taacggaaat cttttaactc ctctatataa cccaaaacca 1320ctctcatcac catttcccca taaaaagaat ttccggaatt cttattcctt ttatattttt 1380cctctccaat ttcccgtcac tttccggaga aaatgagaga aatccttcac atc143權利要求
1.棉花纖維特異性啟動子，包括棉花β-微管蛋白基因CFTUB2的啟動子。
2.棉花纖維特異性啟動子，包括棉花β-微管蛋白基因CFTUB2的啟動子的1433bp片段，其具有SEQ ID NO2所示序列。
3.棉花纖維特異性啟動子，包括棉花β-微管蛋白基因CFTUB2的啟動子的984bp片段，其具有SEQ ID NO2的核苷酸449-1433的序列。
全文摘要
本發明涉及棉花β一微管蛋白基因CFTUB2及其活性片段。這些啟動子顯示出強纖維特異性活性。
文檔編號C07K14/415GK1382215SQ00813724
公開日2002年11月27日 申請日期2000年8月1日 優先權日2000年8月1日
發明者蔡林, 李學寶, 程寧輝, 劉建偉 申請人:分子農業生物學院