研究、判定或評價的方法

2023-12-01 05:20:41 1

專利名稱：：研究、判定或評價的方法研究、判定或評價的方法
技術領域：
5本發明涉及一種通過向SART應激負荷動物投入被檢物質後對其腦組織進行蛋白質組表達分析，對該被檢物質的藥理作用，特別是對於纖維肌痛症的作用、鎮痛作用或抗應激作用進行研究、判定或評價的方法。|0
背景技術：
纖維肌痛症(Fibromyalgia)是一種慢性全身性的強烈疼痛、或者即使為局部疼痛，也是廣範圍的慢性疼痛為主要症狀的疾病，不僅肌肉組織，而且連皮膚也感覺疼痛。在纖維肌痛症中，不僅表現出這種全身性的疼痛，而且還多伴有疲勞感、倦怠感、憂鬱、焦慮感、晨間僵15硬感、肌肉強直、睡眠障礙等。此外，有時還伴有頭痛、顏而痛、認識障礙(記憶錯誤、注意力渙散)、腸胃不適(內臟痛、消化系統障礙、腸胃氣脹)、尿頻、腹瀉、便秘、月經不調等症狀。已報告，相對於美國的一般人口，纖維肌痛症的發病率在女性為3.4%，男性為0.5%，大致多發於2550歲的女性，約80%的患者為20女性，在日本的情況認為與美國大致相同。纖維肌痛症，雖然其自覺症狀各種各樣，可是外界觀察到的症狀，除特徵性的全身壓痛之外，卻幾乎沒有，除進行MRI、CT等圖像檢査外，即使進行肌肉疼痛部位的病理檢查、各種免疫學、病毒學、內分泌學檢查，也幾乎不能見到異常。例如，不能觀察到不同於風溼性關節炎的浮腫，儘管顯示炎症25程度的血液中的指標，即血沉或cAMP受體蛋白(CRP)均在正常範圍之內，但患者仍主訴遍及四肢或軀幹的廣泛範圍內的疼痛。作為診斷方法，現在，在世界範圍內使用美國風溼病學會1990年提出的分類標準。根據該標準，以臍部作為基點，在上半身和下半身、右半身和左半身、脊椎部和胸骨部的5處中的任一部位均感覺疼痛，30且此疼痛至少持續3個月以上的情況，或者在規定的全身18處的壓痛載重後，在ll處以上感覺到疼痛的情況，被認定為纖維肌痛症。關於纖維肌痛症的發病的原因和機理，現在雖然推測為應激等心理原因、病毒感染、遺傳、免疫異常或祌經遞質的異常等，但是仍未5闡明。纖維肌痛症是一種由生物體組織的損傷或可能帶來損傷的侵害刺激引起的、與多數一般疼痛性的疾病大不相同的疾病，在疼痛部位無相關的病理學方面的所見。在纖維肌痛症的治療上，在一般的疼痛治療中較多使用的非類固醇性抗炎症藥(NSAIDs)等消炎鎮痛劑的幾乎無效。另外，雖然試用io了肌肉鬆弛藥、阿片樣物質性鎮痛藥、抗焦慮劑等各種各樣的藥劑，但其有效性因人而異存在很大的差別，未見顯著的效果。因此，目前在纖維肌痛症的治療上，無非是開具抗憂鬱藥或抗憂鬱藥和NSAIDs的處方、向疼癇發作部位投以局部麻醉藥或類固醇劑、採用按摩、運動療法、睡眠療法等。但是，任何治療藥劑和治療方法，由於纖維肌15痛症的原因尚未確定，且治療效果因人而異存在很大的差別，所以均不能確立為治療方法。如上所述，目前，纖維肌痛症的發病原因和機理尚未闡明，因此，研究者們正在尋求研究、判定或評價對治療該疾病有效的物質的方法。本發明的目的在於提供一種對治療纖維肌痛症或疼痛性疾病有效20的物質進行研究、判定或評價的方法。本發明的發明人首先著眼於纖維肌痛症與SART應激負荷動物的類似性。所謂SART應激負荷動物，是指負荷SART(SpecificAlternationofRhythminTemperature)應激，即反覆寒冷刺激的動物，可由小鼠、大25鼠、豚鼠等製作得到。製作方法可以根據喜多等的方法(日薬理誌，71:195，1975)進行。即，例如在大鼠的情況下，在上午10點至下午5點的期間內，每小時交替改變飼養環境溫度24'C和一3t:，接著，在下午5點至次日早晨的上午IO點的期間內，維持在4。C，使其自由攝取水和飼料，詞養4天以上，通過反覆負荷寒冷刺激而能夠製作。30在大鼠為一3X:的低溫的溫度設定，在小鼠為4°C，在豚鼠為0°C，由此能夠分別製作SART應激負荷小鼠、豚鼠。已知這樣製作的SART應激負荷動物具有以下特徵，即，因反覆寒冷刺激而造成的疼痛閾值降低(疼痛過敏)、焦慮-憂鬱亢進、CRH(促腎上腺皮質素釋放激素)、去甲腎上腺素、IL-ip的釋放分別亢進、5-羥色胺(5-HT)的釋放被抑制。另外，其體重也減少。5另一方面，已知纖維肌痛症的的患者也具有疼痛閾值降低、焦慮-憂鬱亢進、CRH(促腎上腺皮質素釋放激素)、去甲腎上腺素、P物質、IL-ip、IL-2、IL-6及lL-8的釋放分別亢進、5-羥色胺(5-HT)的釋放被抑制的特徵。已經明確，在這些方面與SART應激負荷動物具有共性。io此外，迄今為止，已知牛痘病毒接種炎症組織的提取物對於SART應激負荷動物，具有疼痛閾值降低(疼痛過敏)的抑制作用(鎮痛作用)、CRH(促腎上腺皮質素釋放激素)、去甲腎上腺素、IL-lp的釋放亢進的抑制作用、5-羥色胺(5-HT)的釋放抑制、體重減少的抑制作用等的抗應激作用(基礎&臨床、15卷、5號、2459頁、1981年；応15用薬理、32巻、3號、599頁、1986年及其它)，規定以牛痘病毒接種家兔炎症皮膚的提取液為主要成分的醫藥品製劑(商品名Neurotropin(祌經妥樂平))，通過使用該SART應激負荷動物的鎮痛效力試驗而進行效價檢定，作為定量試驗。牛痘病毒接種家兔炎症皮膚的提取液製劑是一種已明確廣泛適用20於腰疝症、頸肩腕綜合症、症狀性神經痛、肩周炎、變形性關節炎、帶狀皰疹後祌經痛等疼痛性疾病，除此以外還廣泛適用於伴隨皮膚疾病(溼疹、皮炎、蕁麻疹)的搔癢、過敏性鼻炎、亞急性脊髓視神經症(SMON)後遺症的冷覺、異常知覺、疼痛等的非常獨特的製劑，其皮下注射、肌肉注射、靜脈注射用的注射劑和片劑，作為醫療用醫25藥品已被允許製造，並在市場上出售。近年，在美國進行了關於作為難治性神經性疼痛的RSD(反射性交感神經萎縮症，CPRS-typel)的臨床試驗。另外，近年，已明確牛痘病毒接種炎症組織的提取物對纖維肌痛症有效(ArthritisResTher,5(Suppl3):S53，170，2003年及其它)。30在以下專利文獻中，同樣記載了牛痘病毒接種炎症組織的提取物對纖維肌痛症有效。專利文獻1:國際公幵WO2004/039383號公報
發明內容本發明的發明人著眼於上述的SART應激負荷動物與纖維肌痛症5患者具有共同的特徵、以及牛痘病毒接種炎症組織提取物對上述二者均有鎮痛作用，考慮其作用機理為改善疼痛的下行性抑制系統的功能降低，經過深入的研究，結果發明一種通過向SART應激負荷動物投入被檢物質後對其腦組織進行蛋白質組表達分析，對該被檢物質的藥理作用，特別是對於纖維肌痛症的作用、鎮痛作用或抗應激作用進行io研究、判定或評價的方法。發明的效果本發明提供一種通過向SART應激負荷動物投入被檢物質後對其腦組織進行蛋白質組表達分析，對該被檢物質的藥理作用，特別是對於纖維肌痛症的作用或鎮痛作用進行研究、判定或評價的方法。根據15該方法，能夠探索對纖維肌痛症或疼痛性疾病有效的物質，對其進行療效的判定、評價，或者對該物質的耙蛋白質進行分析。具體實施方式向動物接種牛痘病毒，破碎出痘的組織，加入提取溶劑除去組織20碎片之後，進行除蛋白處理，使其吸附於吸附劑上，然後再將吸附成分溶出，由此得到牛痘病毒接種炎症組織提取物。例如，可以通過以下工序製造牛痘病毒接種炎症組織提取物。(a)採取接種牛痘病毒而出痘的家兔、小鼠等的皮膚組織，破碎出痘的組織，添加水、苯酚水溶液、生理鹽水或苯酚加甘油水溶液等25提取溶劑之後，通過過濾或離心分離得到提取液(濾液或上清)。(b)將上述提取液調整至酸性的pH，加熱，進行除蛋白處理。然後將除蛋白後的提取液調整至鹼性，加熱後進行過濾或離心分離。(c)將得到的濾液或上清調整至酸性，使其吸附於活性碳、高嶺土等吸附劑上。30(d)向上述吸附劑添加水等提取溶劑，調整至鹼性的pH，將吸附成分溶出，由此能夠達到牛痘病毒接種炎症組織提取物。下面，對上述各工序進行更詳細地說明。(a)採取向家兔等兔子接種牛痘病毒而出痘的炎症皮膚組織，將其破碎。添加其15倍量的提取溶劑，製成乳化懸浮液。作為提取溶劑，5可以使用蒸餾水、生理鹽水、弱酸性乃至弱鹼性的緩衝液等，也可以適當地添加甘油等穩定劑、苯酚等殺菌防腐劑、氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂等鹽類等。此時，也可以通過凍結融解、超聲波、細胞膜溶解酶或表而活性劑等的處理破壞細胞組織，使提取容易進行。(b)io將得到的乳狀提取液通過過濾或離心分離除去組織碎片之後，進行除蛋白處理。除蛋白操作可以根據通常公知的方法進行，加熱處理、使斤j蛋白質變性劑，例如酸、鹼、尿素、胍、丙酮等有機溶劑等的處理、等電點沉澱，鹽析等方法均可適用。然後，採用除去不溶物的通常方法，例如使用濾紙(纖維素、硝酸纖維素等)、玻璃濾器、西萊特15(Celite)、塞氏過濾板等的過濾、超濾、離心分離等方法，由此能夠除去析出的不溶蛋白質。(c)使用鹽酸、硫酸、氫溴酸等酸，將這樣得到的含有有效成分的提取液調整至酸性，優選調整至pH3.5pH5.5，進行向吸附劑上吸附的20操作。作為能夠使用的吸附劑，可以列舉活性碳、高嶺土等。向提取液中添加吸附劑並進行攪拌，或者使提取液通過填充有吸附劑的柱子，由此能夠使有效成分吸附在該吸附劑上。在向提取液中添加吸附劑的情況下，通過過濾或離心分離等除去溶液，從而能夠得到吸附有有效成分的吸附劑。25(d)為使有效成分從吸附劑中溶出(脫離)，能夠通過向上述吸附劑添加提取溶劑，在室溫或者適當加熱進行攪拌而溶出，以過濾或離心分離等通常方法除去吸附劑而實現。作為所使用的提取溶劑，可以使用鹼性溶劑，例如，調整至鹼性pH的水、甲醇、乙醇、異丙醇等或這些30溶劑的適當的混合溶液，優選使用調整至pH9pH12的水。另外，例如在上述專利文獻1等中記載了更具體的製法。實施例首先，如下所述製作了SART應激負荷動物的腦組織試樣。(1)動物對6周齡的Wistar系雄性大鼠負荷SART應激，製作出SART應5激大鼠。使大鼠自由攝取飼料和自來水，負荷5天。自第6天起解除負荷，以供試驗。(2)牛痘病毒接種炎症組織的提取物作為牛痘病毒接種炎症組織的提取物，使用根據上述專利文獻1的實施例2製作的將從接種了牛痘病毒的兔子的炎症皮膚中提取的提io取物調製為20NU/mL的物質(牛痘病毒接種家兔炎症皮膚的提取物)。所謂Nli，是使用作為疼痛閾值低於正常動物的慢性應激動物的SART應激負荷大鼠，基於Randall-Selitto法進行試驗，以鎮痛效力的EDso忸規定的。INU表示當EDs(,值為100mg/kg時，牛痘病毒接種家兔炎症皮膚提取物含有鎮痛活性成分lmg的活性。15(3)牛痘病毒接種家兔炎症皮膚的提取物的給藥對上述SART應激負荷大鼠，從SART應激負荷開始日起，按照每lkg體重200NU，將牛痘病毒接種家兔炎症皮膚的提取物(SART應激被檢物質給藥組)進行連日腹腔內給藥。以相同的方案，向正常對照組和SART應激負荷對照組投入生理鹽水。給藥的液體量為每lkg體20重10mL。分組如下正常對照組(n二5)、SART應激負荷對照組(n二IO)、SART應激負荷被檢物質組給藥組(n二10)。(4)疼痛閾值的測定通過採用壓力剌激鎮痛效果測定裝置的基於Randall-Selitto法的試驗，對疼痛閾值進行測定。即，以一定的加壓速度對大鼠的右後肢腳25趾施加壓力刺激，將動物表現出逃避或嘶叫反應時的加壓重量(g)作為疼痛閾值進行測定。由此得到以下的結果。(1)體重的變化SART應激負荷對照組的體重與正常對照組相比，從SART應激負30荷開始1天後起，觀察到有意義的體重增加抑制。SART應激負荷被檢物質給藥組的體重與SART應激負荷對照組相比，未觀察到體重變化。(2)牛痘病毒接種家兔炎症皮膚的提取物對SART應激負荷大鼠的疼痛閾值降低的效果如果負荷SART應激5天，則與正常對照組相比，疼痛閾值有意義地降低。對SART應激負荷被檢物質給藥組，在最後給藥的30分鐘之5後測定了疼痛閾值，結果觀察到與SART應激負荷對照組相比有意義的改善。(3)試樣如上所述，在確認SART應激負荷引起疼痛閾值的降低和牛痘病毒接種家兔炎症皮膚提取物的鎮痛效果之後，從各組大鼠的腦組織屮回io收大腦、中腦、小腦、間腦、橋腦和延髓、脊髓后角和後根祌經節。對得到的各試樣，使用Polytron勻漿器，在冰冷下，在細胞裂解緩衝液(30mmol/LTris-鹽酸、2mol/L硫脲、7mol/L尿素、4XCHAPS，pH8.5)[CHAPS:3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylamrnonio]propanesulfonicacid(3-[3-鵬醯胺丙基)二甲氨基]丙磺酸)]中對分別取自各組的4隻大鼠15的試樣進行勻漿，將得到的組織均漿以液氮迅速冷卻，凍結保存於一8(TC至使用之吋。然後，使用以上述方法得到的試樣，通過螢光標記雙向差異凝膠電泳(2D-DIGE)法，發現在SART應激負荷動物的中樞和末梢神經中表達量發生改變的蛋白質，再採用基質輔助雷射分析電離飛行時間質20譜(MALDI-TOF/MS)對這些蛋白質進行鑑定。以下進行詳細說明。(1)試劑在上述螢光標記雙向差異凝膠電泳中使用的試劑均為由GEHealthcareBioscience株式會社(原AmershamBioscience)指定的生產廠家製造的等級品。為避免在細胞裂解緩衝液、重泡脹緩衝液中使用25的尿素和硫脲對實驗系統造成不良影響，添加離子交換樹脂Amberlite進行振蕩，吸附並除去分解物後再使用。在調製試劑時使用超純水(Milli-Q水)。(2)螢光標記雙向差異凝膠電泳(2D-DIGE)法利用根據Bradford法用牛血清白蛋白製作的標準曲線，對以上述方30法得到的試樣的蛋白質濃度進行定量分析。將其用作螢光標記雙向差異凝膠電泳的試樣，在蛋白質表達量變化的分析中，採用2D-DIGE法。(3)使用螢光標記試劑(CyDye)進行的標記反應用細胞裂解緩衝液將各試樣的蛋白質濃度調整為2mg/mL或5mg/mL，並確認其液性為pH8.09.0的範圍。製作出分別等量混合有待測的全部試樣的混合試樣，將其作為為內部標準。將內部標準、蛋5白質試樣50嗎加入微量離心管內，添加lpL的CyDyeDIGEFluorminimaldye標記溶液(以無水二甲基甲醯胺將CyDye色素稀釋至400pmol/pL)。攪拌後，在冰中和喑處靜置30分鐘，標記蛋白質。內部標準試樣以Cy2色素標記，蛋白質試樣以Cy3或Cy5色素標記。添加lpL10mmol/L的賴氨酸溶液，在冰中和暗處靜置10分鐘，使標記io反應停止。將以Cy2、Cy3和Cy5色素標記的各試樣加入1個微量離心管內進行混合，用於第一向電泳。(4)第一向電泳第一向電泳使用AmershamBioscience的IPG預製膠條(ImmobilineDrystrip)和等電點電泳系統(IPGphor)，進行等電點電泳。使用長度15為24cm、pH範圍分別為pH47L、4.55.5L、5.36.5L禾卩69L的膠條。在使用pH47L、4.55.5L和5.36.5L的膠條的情況下，同吋進行膠條重泡脹和試樣添加。將450pL含有試樣的重泡脹緩衝液(2mol/L硫脲、7mol/L尿素、4%CHAPS、1.2%DeStreakReagent、0.5%IPG20Buffer)加於24cm的膠條架上，再放置IPG膠條放置於其上。10小吋重泡脹之後，以每個膠條最大50|_iA、最大8000V實施D0，000—180,000VHr電泳。在分離鹼性側的蛋白質的pH69L的膠條的情況下，重泡脹IPG膠條後再添加試樣能夠得到良好的結果，因此，在加入不含試樣的重25泡脹緩衝液......的重泡脹託盤內重泡脹IPG膠條10小時以上，然後用加樣杯添加試樣，以每個膠條最大....、最大8000V實施96，000VHr電泳。在嚴格遮光的條件下進行試樣添加後的操作，將電泳結束後的膠條保存於一80"C至實施第二向電泳。30(5)第二向電泳第二向電泳進行24cmX20cm、1mm厚的十二垸基硫酸鈉一聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS—PAGE，丙烯醯胺濃度12.5%)。向電泳結束的膠條添加平衡緩衝液A(50mmol/LTris-鹽酸、6mol/L尿素、30%甘油、2%SDS、1%二硫蘇糖醇，pH8.8)，振蕩15分鐘，更換為平衡緩衝液B(50mmol/LTris-鹽酸、6mol/L尿素、30%甘油、2%SDS、2.5%碘乙5醯胺，pH8.8)後，再振蕩15分鐘。在平衡結束之後，立即進行第二向電泳。在l(TC、2W/gel、遮光狀態下進行電泳，直至電泳前端距凝膠下端510mm的位置。(6)分析將電泳結朿的凝膠從電泳槽屮取出之後，遮光，直接以夾於玻璃片10之間的狀態，立即使用Typhoon9400可變圖象分析儀(variableimageanalyzer)(螢光圖象分析裝置)，獲取Cy2、Cy3、Cy5的螢光圖象(激發波-fe/1^光波長Cy2:488nm/520nm，Cy3:532nm/580nm，Cy5:633nm/670nm)。應用DeCyder差異分析軟體(DeCyderDifferentialAnalysisSoftware),對各祌經組織的6塊凝膠(凝膠圖像數18)進行15斑點的檢出、匹配、統計分析。對正常對照組和SART應激負荷對照組，以及SART應激負荷對照組和SART應激負荷被檢物質給藥組分別進行比較，挑選出表達量之差為1.5倍以上且在t—test中p<0.05的斑點。(7)磷酸化蛋白質的分析20為了確認翻譯後修飾的影響，在同一塊凝膠中實施了使用螢光標記試劑(CyDye)的總蛋白質的標記，和使用磷酸化蛋白質染色試劑(Pro-QDiamond)的磷酸化蛋白質的染色。以Cy2標記50嗎試樣，與450pg未標記的試樣混合，與上述同樣進行雙向電泳。電泳結束後，為不引起CyDye和Pro-QDiamond的褪色，在遮光下實施染色操作。25從玻璃片中取出凝膠，在固定液(50%甲醇，10%三氯乙酸)中，室溫下浸漬1小時。然後更換固定液，過夜，再更換固定液，平穩地振蕩1小時，固定。用雙蒸水洗淨固定後的凝膠，每次15分鐘，清洗4次，添加500mL染色液，振蕩2小時進行染色。然後添加脫色液(20%乙腈、50mmoVL乙酸鈉，pH4.0)，每次30分鐘，共洗淨3次。使用30Typhoon9400可變圖象分析儀，Cy5色素以激發波長633nnv^光波長670nm的條件、Pro_QDiamond以激發波長532nm/螢光波長580nm的條件，對凝膠進行測定。(8)採用MALDI-TOF/MS進行的蛋白質鑑定作為試樣，添加相當於蛋白質量為500pg的組織均漿，與上述同樣實施雙向電泳。5使用SYPRORubyProteinGel和BlotStainKit,按照試驗設計(protocol)對凝膠中的總蛋白質進行染色。從玻璃片中取出已結朿電泳的凝膠，浸漬在500mL的固定液(10%甲醇，7%乙酸)中，在室溫下平穩地振蕩過夜，進行固定。固定後，添加500mL染色液，在遮光下，室溫下平穩地振蕩5小吋以上，進行染色。然後添加500mL的io脫色液(10%甲醇，6%乙酸)，在遮光下，室溫下平穩地振蕩I2小吋。使J1]Typhoon9400可變圖象分析儀，在激發波長457nnv^光波長610nm的條件下，對凝膠進行測定。染色後的凝膠使用BioRadSpotCutter挑選出目的斑點，對其進行分析。其結果如下所示。15(1)在pH4—7的範圍內的蛋白質表達改變的分析對採取的全部組織實施在pH4—7的範圍內的螢光標記雙向差異凝膠電泳(2D-DIGE)分析。(l一l)大腦分析的結果為，對正常對照組和SART應激負荷對照組，以及SART20應激負荷對照組和SART應激負荷被檢物質給藥組，分別進行了比較，均未發現表達量之差為1.5倍以上且在t一test中p<0.05的斑點。以下，根據同樣的檢測標準對斑點的表達量之差進行評價。(l一2)間腦在正常對照組和SART應激負荷對照組，以及SART應激負荷對照25組和SART應激負荷被檢物質給藥組中，均未發現存在表達量存在差異的斑點。(1—3)中腦在正常對照組和SART應激負荷對照組的比較中，與正常對照組相比，在SART應激負荷對照組中增加了5個斑點，未發現減少的斑點。30而在SART應激負荷對照組和SART應激負荷被檢物質給藥組中，在被檢物質給藥組中增加1個斑點，減少4個斑點。(l一4)橋腦在正常對照組和SART應激負荷對照組的比較中，在SART應激負荷對照組中增加6個斑點，減少4個斑點。而在SART應激負荷對照組和SART應激負荷被檢物質給藥組中，在被檢物質給藥組中增加35個斑點，未發現減少的斑點。(l一5)延髓在正常對照組和SART應激負荷對照組的比較中，在SART應激負荷對照組中未發現增加的斑點，減少1個斑點。而在SART應激負荷對照組和SART應激負荷被檢物質給藥組屮，在被檢物質給藥組中未io發現增加的斑點，減少1個斑點。(1—6)小服f在正常對照組和SART應激負荷對照組的比較中，在SART應激負荷對照組中增加了5個斑點，減少9個斑點。而在SART應激負荷對照組和SART應激負荷被檢物質給藥組中，未發現存在表達量存在差15異的斑點。U—7)脊髓后角在正常對照組和SART應激負荷對照組的比較中，在SART應激負荷對照組中增加1個斑點，未發現減少的斑點。而在SART應激負荷對照組和SART應激負荷被檢物質給藥組中，在SART應激負荷被檢20物質給藥組中增加1個斑點，減少1個斑點。(卜8)後根神經節在正常對照組和SART應激負荷對照組的比較中，在SART應激負荷對照組中增加1個斑點，未發現減少的斑點。而在SART應激負荷對照組和SART應激負荷被檢物質給藥組中，未發現存在表達量存在25差異的斑點。在至此進行的實驗中發現表達量改變的斑點數量表示在表1中。30[表l]tableseeoriginaldocumentpage16n二4，t檢驗(2)在窄pH範圍(pH4.5—5.5和pH5.3—6.5)內的蛋白質表達改變對於在pH4—7的範圍內能夠確認多個斑點發生變化的中腦、橋腦和小腦，實施了在更窄範圍(pH4.5—5.5和pH5.3—6.5)內的DIGE，再次確認在pH4—7中得到的結果，並嘗試檢出新的斑點。(2—1)中腦io在pH4.5—5.5的範圍內，在正常對照組和SART應激負荷對照組中，在SART應激負荷對照組中增加14個斑點，減少6個斑點。而在SART應激負荷對照組和SART應激負荷被檢物質給藥組中，在被檢物質給藥組中增加1個斑點，減少14個斑點。在pH5.3—6.5的範圍內，在正常對照組和SART應激負荷對照組中，在SART應激負荷對照組中增15力口7個斑點，減少2個斑點。而在SART應激負荷對照組和SART應激負荷被檢物質給藥組中，在SART應激負荷被檢物質給藥組中增加2個斑點，減少6個斑點。在中腦中，在pH4—7的範圍內發現表達量發生改變的斑點，除了其中的1個之外，在pH4.5—5.5和pH5.3—6.5的範圍內，仍然發生1.5倍以上有意義的改變，能夠確認實驗的再現性。(2—2)橋腦在pH4.5—5.5的範圍內，在正常對照組和SART應激負荷對照組，以及SART應激負荷對照組和SART應激負荷被檢物質給藥組中，均5未發現表達量存在差異的斑點。在pH5.3—6.5的範圍內，在正常對照組和SART應激負荷對照組中，在SART應激負荷對照組中增加1個斑點，減少1個斑點。而在SART應激負荷對照組和SART應激負荷被檢物質給藥組中，在被檢物質給藥組中增加2個斑點，減少l個斑點。io在橋腦中，在pH4—7的範圍內能夠檢測出改變的斑點，在pH4.5一5.5禾卩pH5.3—6.5的範圍內未能確認。(2_3)小腦在pH4.5—5.5的範圍內，在正常對照組和SART應激負荷對照組中，在SART應激負荷對照組中增加3個斑點，減少12個斑點。而在SART15應激負荷對照組和SART應激負荷被檢物質給藥組屮，在被檢物質給藥組屮增加2個斑點，減少1個斑點。在pH5.3—6.5的範圍內，在正常對照組和SART應激負荷對照組中，在SART應激負荷對照組中增加2個斑點，減少7個斑點。而在SART應激負荷對照組和SART應激負荷被檢物質給藥組中，在被檢物質給藥組中增加1個斑點，未發20現減少的斑點。在小腦中，在pH4—7的範圍的內發現的改變的斑點，除了其中的2個之外，在pH4.5—5.5和pH5.3—6.5的範圍內，仍然發生1.5倍以上有意義的改變，能夠確認實驗的再現性。(3)在pH6—9的範圍內的蛋白質表達量改變的分析25對大腦和後根神經節進行了在pH6—9的範圍內的DIGE分析，結果如下所述。(3—1)大腦在正常對照組和SART應激負荷對照組，以及SART應激負荷對照組和SART應激負荷被檢物質給藥組中，均未發現表達量存在差異的30斑點。(3—2)後根神經節在正常對照組和SART應激負荷對照組，以及SART應激負荷對照組和SART應激負荷被檢物質給藥組中，均未發現表達量存在差異的斑點。在窄pH範圍和鹼性pH範圍的實驗中發現變化的斑點數量表示在表2中。[表2]tableseeoriginaldocumentpage18所有實驗均為n-4，t檢驗(4)中腦試樣的磷酸化分析一般認為，在發現翻譯後修飾的影響方面，蛋白質組分析與其它方法相比更具長處。因此，使用中腦試樣確認蛋白質的磷酸化。用Cy5預先標記總蛋白質，以ProQDiamond對雙向電泳後發生磷酸化的蛋白質進行染色，按各自的螢光波長獲取圖象，確認蛋白質磷酸化的有無。(5)已確認發生改變的蛋白質的鑑定5對於中腦、橋腦和小腦的試樣，進行雙向電泳，挑選出斑點進行凝膠內消化後，採用MALDI-TOF/MS進行分析。如上所述，根據使用2D-DIGE的蛋白質組分析，確認了在SART應激負荷動物的中腦、橋腦、小腦中的多種蛋白質發生改變。蛋白質組分析的優點在於能夠確認在基因水平上不能確認的翻譯io後修飾。在DIGE分析中，受到磷酸化、糖化、切斷等翻譯後修飾的蛋白質作為另外的斑點而能夠被確認，因此，應用Pro-QDiamond染色對斑點是否為磷酸化的蛋白質進行確認。通過組合應用CyDye標記和Pro-QDiamond染色，能夠確認以DIGE法確認發生改變的斑點有無磷酸化。15通過MALDI-TOF/MS對已確認發生改變的斑點進行鑑定的結果，能夠鑑定的蛋白質為以下21種CRMP-2、CRMP-4、Munc-18-1、Complexinl、Cornplexin2、突觸蛋白2(Synapsin2)、PGP9.5(蛋白基因產物9.5(ProteinGeneProduct9.5))、a-突觸核蛋白(Alpha-synuclein)、Erk2(MAPK)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶PAK220(Ser/ThrproteinkinasePAK2)、TOLLIP、肌動蛋白相關蛋白2/3複合體亞基2(Actinrelatedprotein2/3sub2)、肌動蛋白相關蛋白2/3複合體亞基4(Actinrelatedprotein2/3sub4)、a-微管蛋白(Tubulinalpha)、Regucalcin(SMP30)、elF5A、醛脫氫酶(Aldehydedehydrogenase)、琥珀醯CoA連接酶(SuccinylCoAligase)、肌酸激酶(Creatinekinase)、25檸檬酸合成酶(Citratesynthase)、ATP合成酶(ATPsynthase)。當設正常對照組的表達量為1時，在SART應激負荷對照組和SART應激負荷被檢物質(Drug)給藥組中，各鑑定蛋白質的斑點的表達量表示在表3中。30tableseeoriginaldocumentpage20(6)鑑定出的蛋白質的分析在這些鑑定出的蛋白質中，針對在中腦中的由SART應激負荷引起變化，但該變化通過投入被檢物質而被抑制的CRMP-2、CRMP-4和Munc-18-1，以及在小腦中發現的由SART應激負荷引起變化的5Complexin1/2，進行了更詳細地研究。(A)應用realtimePCR測定CRMP-2在中腦中心灰白質中的mRNA量，未能確認由SART應激負荷和由SART應激負荷被檢物質給藥引起mRNA量的變化，提示CRMP-2在轉錄階段中未受影響。因此，以聚丙烯醯胺凝膠將中腦均槳進行電泳後，轉印至PVDF膜上，再使用io抗CRMP-2抗體對其進行檢測，未發現以抗CRMP-2抗體識別的條帶濃度變化，提示發生通過雙向電泳能夠確認的翻譯後修飾等變化。為了對其進行確認，從通過雙向電泳分離後的凝膠中轉印至PVDF膜上，使用抗CRMP-2抗體進行檢測，在比通過2D-DIGE確認發生改變的斑點更高分子量的位置上發現CRMP-2的斑點。由該結果提示，以152D-DIGE確認發生改變的斑點為CRMP-2的一部分被切斷而生成的切斷型CRMP-2。(B)用realtimePCR測定CRMP-4在中腦中心灰白質中的mRNA量，也未能確認由SART應激負荷和由SART應激負荷被檢物質給藥引起mRNA量的變化，提示CRMP-4在轉錄階段中未受影響。因此，以聚20丙烯醯胺凝膠將中腦均漿進行電泳後，轉印至PVDF膜上，再使用抗CRMP-4抗體對其進行檢測，未發現以抗CRMP-4抗體識別的條帶濃度變化，.提示發生通過雙向電泳能夠確認的翻譯後修飾等變化。為了對其進行確認，從通過雙向電泳分離後的凝膠中轉印至PVDF膜上，使用抗CRMP-4抗體進行檢測，在與通過2D-DIGE確認發生改變的斑25點幾乎相同的分子量檢測出等電點不同的多個斑點，考慮可能發生翻譯後的修飾。由SART應激負荷引起這些斑點的濃度在酸性側降低，鹼性側增加，該變化通過投入被檢物質而被抑制。已知磷酸化可作為使蛋白質的等電點發生改變的翻譯後修飾，因此，與經ProQDiamond染色的凝膠圖象進行比較，可知酸性側的斑點被磷酸化，而鹼性側的30斑點未被磷酸化。由該結果提示，通過2D-DIGE發現了由SART應激負荷引起磷酸化CRMP-4的減少。(C)採用realtimePCR測定Munc-18-1在中腦中心灰白質中的mRNA量，Munc-18-1也未能確認由SART應激負荷和由SART應激負荷被檢物質給藥引起mRNA量的變化，提示Mimc-18-1在轉錄階段中未受影響。因此，以聚丙烯醯胺凝膠對中腦均漿進行電泳之後，轉錄至PVDF5膜上，再用可識別Munc-18-1的胺基酸58—70位的抗體對其進行檢測，確認由SART應激負荷引起以新的抗Munc-18抗體識別的條帶濃度位於低分子量側，提示發生了切斷等翻譯後修飾。為了對其進行確認，從通過雙向電泳分離後的凝膠中轉印至PVDF膜上，使用抗Munc-18抗休進行檢測，不僅檢出了通過2D-DIGE確認發生變化的斑點，而且io在高分子量側還檢出了數個斑點。進一步，嘗試使用識別Munc-18-1的C末端的胺基酸580—594位的抗體對其進行檢測，在高分子量側檢測出數個斑點，但未檢出山2D-DIGE確認發生改變的斑點。由該結果提示，以2D-DIGE發現的斑點為將C末端從Munc-18-1中切斷後的蛋白質。15(D)針對Complexin1/2，通過雙向電泳分離小腦均漿，從凝膠巾轉印至PVDF股上，使用抗Complexin1/2抗體進行檢測，不僅檢出了釆用MALDI-TOF/MS分別鑑定出的Complexin1和Complexin2，而且還在兒乎相同的分子量檢測出等電點存在於若干酸性側的數個斑點，考慮可能發生翻譯後的修飾。這些斑點，正是雖然在2D-DIGE中發現20其變化，但採用MALDI-TOF/MS卻未鑑定出來的斑點，存在於同一位置的斑點在中腦中也發生了改變。在中腦中，由SART應激負荷引起這些斑點濃度在酸性側增加，該變化通過投入被檢物質而被抑制。由該結果提示，通過2D-DIGE發現了由SART應激負荷引起的翻譯後修飾的變化。以上結果總結在表4中。[表4]tableseeoriginaldocumentpage23設正常對照組=1計算*:p<0.05(與TH常對照組比較，T檢驗)+:p<0.05(與SART應激負荷對照組比較，T檢驗)如上述CRMP-2、CRMP-4和Munc-18-1這樣的通過蛋白質組分析作為發生變化的蛋白質被鑑定的蛋白質，也存在翻譯後被修飾的情況。已確認發生改變的上述蛋白質，既有翻譯後被修飾的蛋白質，也有翻io譯後不被修飾的蛋白質。作為翻譯後的修飾反應，可以列舉例如肽鏈的切斷、糖鏈和脂肪酸的加成這種不可逆反應，和磷酸化、乙醯化、羥化、羧化、腺苷酸化、ADP核糖基化等可逆反應。(7)鑑定出的蛋白質在生物體內的功能從公共的資料庫和公知的文獻中收集發現的蛋白質相關的情報。15CRMP-1、CRMP-2和CRMP-4為同屬於CRMP家族的蛋白質，分別具有70%以上的同源性。有報告，CRMP-2為一種參與軸索延伸和生長錐破壞的蛋白質，通過磷酸化抑制軸索延伸。關於本案發現的切斷型CRMP-2，雖然有報告切斷型CRMP-2在組織採取後隨著時間的推移而增加，在內側型側頭葉癲癇患者的已萎縮的海馬中表達減少，20但是它在生物體內的功能和意義尚不清楚。己知CRMP-4也具有與CRMP-2同樣的功能，但尚不知道CRMP-4的功能調控等，也沒有磷酸化的報告。雖然沒有軸索延伸與疼痛過敏的相關性的直接性的報告，但是考慮因疼痛和溫度等而可能發生神經網絡的變化。關於Munc-18-l、Complexin1、Complexin2禾卩Synapsin2，其均參與祌經遞質的釋放。已知神經遞質儲存於分泌小泡內，對刺激產生5反應而與細胞膜融合，發生釋放。而Munc-18-KComplexin1和Complexin2在作為分泌小泡與細胞膜的融合中的關鍵的蛋白質複合體SNARE複合體的形成中發揮重要的作用。關於被認為切斷型的低分子量的Munc-18-l，雖然還不明白其在生物體內的功能和意義，但是迄今為止觀察到其存在於海馬和大腦皮質中。ioPGP9.5(蛋白基因產物9.5，泛素羧基末端水解酶同功酶LI(Proteingeneproduct9.5，Ubiquitincarboxyl-terminalhydrolaseisozymeLl))和a-突觸核蛋白也是已知在祌經中特異表達的蛋白質。已知PGP9.5是作為祌經的標記物而被廣泛使用的蛋白質，具有泛素水解酶活性，認為能夠防止因泛素化而引起的祌經損傷，其消失可引起祌經發15生破壞。另外，最近還報告，PGP9.5使P2XATP受體活化，使ATP誘導性的Tll流增加。a-突觸核蛋白是一種因其生理功能而在帕金森病中凝柒的周知的蛋白質，已報告，(x-突觸核蛋白抑制參與多巴胺合成的酪氨酸磷酸化酶的活性，與多巴胺轉運蛋白結合，使多巴胺向細胞內的流入。20除了這些祌經特異性蛋白質之外，參與信號轉導系統、細胞形態、蛋白質合成起始、能量產生等的蛋白質也已被鑑定。表5匯總了有關確認發生改變且採用MALDI-TOF/MS鑑定出的蛋白質的已知功能。2530[表5]tableseeoriginaldocumentpage25上述蛋白質有可能是SART應激負荷動物的疼痛閾值降低等的生理功能異常或者纖維肌痛症患者的病因，還有可能是牛痘病毒接種家兔炎症皮膚提取物的靶分子。因此，在被檢物質使這些蛋白質的變化恢復正常的情況下，該被檢物質可能成為對治療纖維肌痛症和腰痛症、頸肩腕綜合症、症狀性神經痛、肩周炎、變形性關節炎、帶狀皰疹後神經痛等疼痛性疾病、RSD(refrexsympatheticdystrophy:反射性交感神經萎縮症)等神經性疼痛、或者因應激而造成的生理功能異常等有效的藥劑。工業實用性如上所述，能夠確認，根據本發明的方法能夠檢出、鑑定因SART應激負荷或投入有牛痘病毒接種家兔炎症皮膚的提取物而表達發生改變的蛋白質。因此，本發明作為一種通過向SART應激負荷動物投入被檢物質後對其腦組織進行蛋白質組表達分析，對該被檢物質的藥理作用，特別是對於纖維肌痛症的作用、鎮痛作用或抗應激作用進行研究、判定或評價的方法十分有用。權利要求1.一種對被檢物質的藥理作用進行研究、判定或評價的方法，其特徵在於該方法基於對投入有被檢物質的SART應激負荷動物的腦組織進行的蛋白質組表達分析。2.如權利要求1所述的研究、判定或評價的方法，其特徵在於所述藥理作用為對纖維肌痛症的作用、鎮痛作用或抗應激作用。3.如權利要求1或2中任一項所述的研究、判定或評價的方法，其特徵在於所述SART應激負荷動物為大鼠。4.如權利要求13中任一項所述的研究、判定或評價的方法，其特徵在於所述腦組織為中腦、橋腦或小腦。5.如權利要求14中任一項所述的研究、判定或評價方法，其特徵在於所述蛋白質組表達分析是採用螢光標記雙向差異凝膠電泳的分析。6.如權利要求15中任一項所述的研究、判定或評價的方法，其特徵在於進行蛋白質組表達分析，與正常動物進行比較，將在SART應激負荷動物中表達發生改變的蛋白質作為指標。7.如權利要求15中任一項所述的研究、判定或評價的方法，其特徵在於進行蛋白質組表達分析，與未投入被檢物質的SART應激負荷動物進行比較，將在投入有被檢物質的SART應激負荷動物中表達發生改變的蛋白質作為指標。8.如權利要求6或7所述的研究、判定或評價的方法，其特徵在5於作為表達發生改變的蛋白質，用翻譯後被修飾或未被修飾的CRMP-2、CRMP-4、Munc-18-1、Complexin1、Complexin2、突觸蛋白2、PGP9.5(蛋白基因產物9.5)、a-突觸核蛋白、Erk2(MAPK)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶PAK2、TOLLIP、肌動蛋白相關蛋白2/3複合io體亞基2、肌動蛋白相關蛋白2/3複合體亞基4、a-微管蛋白、Regucaldn(SMP30)、elF5A、醛脫氫酶、琥珀醯CoA連接酶、肌酸激酶、檸檬酸合成酶、ATP合成酶中的任1種或2種以上作為指標。9.如權利要求18中任一項所述的研究、判定或評價的方法，其15特徵在於所述被檢物質為牛痘病毒接種炎症組織的提取物。10.如權利要求9所述的研究、判定或評價方法，其特徵在於所述被檢物質為牛痘病毒接種家兔炎症皮膚的提取物。2011.一種用權利要求18中任一項所述的研究、判定或評價的方法進行了研究、判定或評價的藥劑。12.如權利要求11所述的藥劑，其特徵在於25所述藥劑為對纖維肌痛症的治療劑。13.如權利要求ll所述的藥劑，其特徵在於所述藥劑為鎮痛劑。14.如權利要求ll所述的藥劑，其特徵在於所述藥劑為具有抗應激作用的藥劑。15.如權利要求11所述的藥劑，其特徵在於有效成分為牛痘病毒接種家兔炎症皮膚的提取物。16.SART應激負荷動物在權利要求18所述的研究、判定或評價的方法中的使用方法。17.SART應激負荷動物在被檢物質為牛痘病毒接種家兔炎症皮膚提取物的權利要求18所述的研究、判定或評價的方法中的使用方法。全文摘要本發明提供一種通過向SART應激負荷動物投入被檢物質後，對其腦組織進行蛋白質組表達分析，研究、判定或評價該被檢物質對纖維肌痛症的作用、鎮痛作用或抗應激作用等藥理作用的方法。對SART應激負荷動物的腦組織進行蛋白質組表達分析，以確認被檢物質如何影響其中所發生的蛋白質表達的變化，由此能夠探索對治療纖維肌痛症和疼痛性疾病有效的物質和抗應激物質。文檔編號C12Q1/02GK101151376SQ20068000739公開日2008年3月26日申請日期2006年3月6日優先權日2005年3月7日發明者加藤智啟,藤澤裕樹,西岡久壽樹申請人:日本臟器製藥株式會社