免疫調節劑顆粒和治療方法

2023-11-30 15:44:56 2

專利名稱：免疫調節劑顆粒和治療方法
技術領域：
在某些實施方案中，本發明涉及由快速、無細胞生產工藝製備的合成疫苗納米 粒。更具體地講，在某些實施方案中，所述納米粒包括抗原和/或免疫增強劑。
背景技術：
對於包括瘧疾、結核病、炭疽病、土拉菌病、布氏菌病、C型肝炎感染、組織 胞漿菌病、球孢子菌病、病毒性出血熱、腺鼠疫、病毒性腦炎、黃熱病和病毒性及細菌 性腸胃炎在內的許多傳染性疾病而言，仍然沒有可用的或有效的疫苗。需要新疫苗以對 付這些疾病。另外，在抗原變異性和免疫力類型上的挑戰也需要新的方法。在任何適合用做疫苗的組合物中，構象完整性和免疫原性表位和抗原位點的完 整保留是必不可少的。在這些分子和化合物的結構構型、化學電荷或空間定向上的改變 可能會導致抗原活性和用途的部分或完全喪失。主要需要考慮的是疫苗中的結合載體顆 粒具有最少不良反應並仍促進抗原性化合物與免疫系統間相互作用的能力。在將組合物 製備成用做疫苗或用做識別特異性受體的生物材料的綴合物時，所有這些因素都得考慮 到。為了誘導針對給定抗原的強免疫應答，需要蛋白質、佐劑或其它免疫增強劑。 為了獲得最佳免疫應答，抗原和免疫增強劑通常必須共同遞送。然而，共同遞送技術 包括將這兩種蛋白質融合在一起，這些技術包括以下缺陷這兩種組分間的物理幹擾、 每種組分到免疫系統的未受控的呈遞，對可用於該技術的融合蛋白和組合物的限制，等寸。其它技術包括使用含有硫酸鉀鋁、傳統的雙層或多層脂質體、聚合物顆粒和病 毒樣顆粒的組合物。這樣的技術具有顯著缺陷，包括理化穩定性、與寬範圍抗原的相容 性、不能共同遞送抗原和免疫調節劑，以及因基於細胞或雞胚生產的安全性考慮和重組 病毒的風險。因此，需要這樣的新疫苗所述疫苗能同時提供抗體響應和細胞響應，與 寬範圍的抗原相容，能夠共同遞送和具有多價性，並且具有安全和可重現的生產工藝， 以確保穩定的產品。發明概述依據本發明的實施方案，刺激受試者體內免疫應答的方法包括給予所述受試者 多個顆粒，其中每個顆粒都與免疫刺激劑和蛋白質偶聯。在一個實施方案中，所述給予 多個顆粒導致的抗體效價比給予不與所述顆粒偶聯的免疫刺激劑和蛋白質所導致的效價 高出至少大約10倍。在一個實施方案中，所述多個顆粒的基本上每個顆粒都包含尺寸為 大約200nm乘大約200nm乘大約200nm的顆粒。在另一個實施方案中，所述多個顆粒 的基本上每個顆粒都包含尺寸為大約2 μ m乘大約2 μ m乘大約2 μ m的顆粒，而且其中 所述給予多個顆粒導致的抗體效價比給予不與所述顆粒偶聯的免疫刺激劑和蛋白質所導
3致的效價高出至少大約100倍。依據本發明的另一實施方案，刺激受試者體內免疫應答的方法包括將與抗原偶 聯的微米尺度顆粒給予所述受試者，其中增加所述微米尺度顆粒的長寬比能增加免疫應 答。在一個實施方案中，所述微米尺度顆粒的長寬比為大約3 1，所述免疫應答比給予 長寬比為大約1 1的顆粒所導致的免疫應答高出大約2至大約3倍。在一個實施方案 中，所述微米尺度顆粒包含尺寸為大約1微米乘大約1微米乘大約3微米的顆粒。在另 一個實施方案中，所述微米尺度顆粒包含尺寸為大約2微米乘大約2微米乘大約6微米的 顆粒。在又一個實施方案中，所述微米尺度顆粒的長寬比為大約10 1，所述免疫應答 比給予長寬比為大約1 1的顆粒所導致的免疫應答高出大約3至大約4倍。在一個這 樣的實施方案中，所述微米尺度顆粒包含尺寸為大約1微米乘大約1微米乘大約10微米 的顆粒。依據本發明的另一實施方案，通過降低由與納米尺度顆粒偶聯的抗原所導致的 免疫應答的方法包括增加所述納米尺度顆粒的長寬比。在本發明的某些其它實施方案中，基本上抑制由給予受試者的免疫刺激劑所導 致的免疫應答的方法包括在將所述免疫刺激劑給予所述受試者之前，使所述免疫刺激劑 通過非降解性接頭與顆粒偶聯。在一個實施方案中，所述方法導致在將所述免疫刺激劑 初次給予所述受試者之後基本上能抑制免疫應答。在另一個實施方案中，所述方法導致 在將所述免疫刺激劑加強給予所述受試者之後基本上能抑制免疫應答。本發明的某些實施方案的疫苗顆粒組合物包括被構造成能以第一速率釋放第一 蛋白和以第二速率釋放第二蛋白並且被構造成能以單劑量提供初次效能和加強效能的多 個顆粒。附圖簡述

圖1顯示初次注射本發明一個實施方案的疫苗顆粒後3周的應答，其中對於 200nm疫苗顆粒，抗體水平為1,280 ；對於2微米疫苗顆粒，抗體水平為10,240 ；對於r 蛋白(rProtein)，抗體水平為101 ；圖2顯示初次注射本發明一個實施方案的疫苗顆粒後的另一應答；圖3顯示初次注射本發明一個實施方案的疫苗顆粒後的又一應答；圖4顯示在初次注射後，對本發明一個實施方案的疫苗顆粒的應答，比較非降 解性接頭和降解性接頭；圖5顯示在加強注射後，對本發明一個實施方案的疫苗顆粒的應答，比較非降 解性接頭和降解性接頭；圖6顯示本發明一個實施方案的80nmx80nmx 360nm聚(二甲基氨基甲基丙烯 酸酯)(PLGA)疫苗顆粒；圖7顯示本發明一個實施方案的疫苗顆粒的生物素-抗生物素蛋白連接系統的示 意圖；和圖8顯示本發明一個實施方案的血細胞凝集測定，表明對以下進行比較的組合 圖像(1)包被小鼠血清白蛋白的200nm χ 200nm χ 200nm疫苗顆粒(對照)；(2)包被 HA蛋白的200nm χ 200nm χ 200nm疫苗顆粒(活性物質(Active)) ； (3) HA蛋白陽性對 照；和(4)陰性對照，其中血細胞凝集顯示在畫出的孔中，表明顆粒表面HA蛋白的存在。本發明實施方案的詳述本發明的某些實施方案通過納米粒成型技術(mmoparticle molding technique)產
生疫苗。一個令人驚奇的結果就是，將抗原，例如流感HA( 「HA」)(來自Protein Sciences Corporation的流感WyomingHA蛋白)與免疫刺激或增強劑例如鞭毛蛋白或 IL-12(eBiosciences, Inc.)組合在納米粒上或其中，可觸發強烈的適應性免疫應答。此 外，在某些實施方案中的抗原和/或免疫增強劑(在下文中稱為「免疫增強劑」)可包裝 在納米粒內或展示在納米粒外面，正如可為了特定用途和/或抗原/免疫增強劑組合而進 行優化。此外，在某些實施方案中，免疫增強劑與納米粒抗原組分的比例可被構造成能 用於特定用途並可針對特定用途加以調整。在某些實施方案中，可將一種或多種免疫增 強劑與納米粒和一種或多種抗原包括在一起。在又一些實施方案中，所述納米粒也可包 括細胞特異性或組織特異性結合或靶向劑。PRINT 技術(Liquidia Technologies，North Carolina)是一種納米粒生產工藝，
該工藝獨有地允許控制顆粒大小、形狀、組成、表面官能度和其它物理特性例如模數 等。在本發明的某些實施方案中使用該技術，允許用於獨特的共同遞送策略、形狀特異 性和大小特異性免疫原性、生物貨物(biological cargo)例如抗原和免疫增強劑的無病毒遞 送、合成遞送載體和多種遞送途徑，包括腹腔、鼻腔、口服、皮下、皮內、肌內、腹膜 內、吸入等。本發明某些實施方案的納米粒組合物可被構造成能延時釋放不同劑量抗原和/ 或抗原和免疫增強劑組分，以優化與免疫系統和抗體形成的相互作用。在某些實施方案 中，所述納米粒組合物可構造成能以預定速率和/或響應預定環境條件(例如pH、含水 環境、特定酶等)而降解。在某些實施方案中，可通過預選交聯劑和/或交聯劑密度而 使納米粒轉向降解，以促進顆粒在預選環境中或以預選降解速率而降解。在某些實施方 案中，納米粒可包含不同種類和數量的表面免疫增強劑，以篩選、結合或掩蔽來往於所 需細胞的顆粒。也可設計本發明某些實施方案的納米粒，即通過控制納米粒的聚合物基 質，在納米粒分解之前將抗原遞送到胞內空間，因此提供抗原和/或抗原/免疫增強劑的 胞內遞送。本發明某些實施方案的組合物可包含生物降解材料、親水材料、GRAS(通常 被認為是安全的)材料等。在某些實施方案中，本發明的顆粒可包含聚(乙二醇)、聚 (乳酸-共-乙醇酸)、聚己內酯等或者由它們而形成。在某些實施方案中，顆粒組合物包含抗原和免疫增強劑兩者。在某些實施方案 中，顆粒組合物僅包含抗原或免疫增強劑中的一種。在某些實施方案中，使一種或多種 抗原或免疫增強劑綴合在納米粒表面。在某些實施方案中，可通過控制形成納米粒的或 與納米粒表面綴合的組合物而控制免疫增強劑與抗體的比率。在某些實施方案中，表面上的抗原量佔顆粒重量的大約0至大約50%。在某些 實施方案中，表面上的抗原量佔顆粒重量的大約0至大約40%。在某些實施方案中，表 面上的抗原量佔顆粒重量的大約0至大約30%。在某些實施方案中，表面上的抗原量佔 顆粒重量的大約0至大約20%。在某些實施方案中，表面上的抗原量佔顆粒重量的大 約0.1至大約20%。在某些實施方案中，表面上的抗原量佔顆粒重量的大約0.1至大約 10%。
在某些實施方案中，所述免疫增強劑佔抗原量的大約0至大約70%。在某些實 施方案中，所述免疫增強劑佔抗原量的大約O至大約60%。在某些實施方案中，所述免 疫增強劑佔抗原量的大約0至大約50%。在某些實施方案中，所述免疫增強劑佔抗原量 的大約0至大約40%。在某些實施方案中，所述免疫增強劑佔抗原量的大約0至大約 30%。在某些實施方案中，所述免疫增強劑佔抗原量的大約0至大約20%。在某些實施 方案中，所述免疫增強劑佔抗原量的大約0至大約10%。在某些實施方案中，所述免疫 增強劑佔抗原量的大約0.1至大約30%。在某些實施方案中，所述免疫增強劑佔抗原量 的大約0.1至大約20%。在某些實施方案中，所述免疫增強劑佔抗原量的大約0.1至大約 10%。在某些實施方案中，本發明的納米粒提供顆粒介導的控制釋放，其可改進應答 並降低針對當前免疫調節性疫苗技術的反應原性。也可構造某些實施方案的納米粒，以 產生劑量有節制的(dose-sparing)和加強有節制的(boost sparing)方案以及增加產品穩定 性和貨架期，例如通過操縱基質組合物。在某些實施方案中的免疫調節性疫苗的納米粒 包裝可進一步最小化或控制在預選環境條件下的體內分解。本發明某些實施方案中的納 米粒進一步提供在單個納米粒中或者在包含單劑量或多劑量的多個納米粒中的額外免疫 調節劑和/或抗原的潛在共同包裝。在又一些實施方案中，本發明的納米粒提供多價疫苗和Thl/Th2調節。在某些 實施方案中，所述納米粒也可產生顆粒介導的遞送，通過內涵體逃逸(endosomal escape) 遞送到細胞溶膠，允許抗原的有效呈遞，用於T細胞誘導。本發明某些實施方案的納米 粒也可提供在單個顆粒中或其上鞭毛蛋白和免疫原的共同包裝，其可無需融合蛋白。在 某些實施方案中，在本發明的納米粒增強對鞭毛蛋白和/或免疫原正確構象的維持，增 加APC尋靶，降低對劑量的需求，降低反應原性，其組合等。在某些實施方案中，在本 發明納米粒上增強鞭毛蛋白和/或免疫原的正確構象，因為在顆粒製造並使用所有含水 條件和化學後，免疫原和/或鞭毛蛋白連接在顆粒上。在某些實施方案中，通過引用結合在本文中的納米粒成型技術(PRINT (Liquidia Technologies, Inc.North Carolina))中所述的納米粒製造允許在顆粒基質內容易
地摻入許多生物劑，包括抗原、免疫調節、佐劑和其它免疫增強劑。在某些實施方案 中，納米粒成型技術也允許將靶向配體連接在顆粒表面。對於某些實施方案的疫苗應 用，靶向所述治療劑降低具有系統反應原性的機會和/或減少對劑量的需求。在本發明 的某些實施方案中，顆粒在某一表面、在所有表面或在顆粒內部，含有一種或多種免疫 增強劑和一種或多種抗原。在某些實施方案中，顆粒包含一種或多種目標抗原、免疫增 強劑和靶向劑。在某些實施方案中，納米粒成型技術也允許用於多價疫苗。在某些實施 方案中，納米粒含有或包含多種疫苗抗原。在某些實施方案中，包括這樣的納米粒所述納米粒使得抗原和免疫增強劑物 理分離。在某些實施方案中，用於物理分離抗原和免疫增強劑的一項技術包括包封抗原 並用免疫增強劑使顆粒表面官能化，或反過來。在某些實施方案中，用於物理分離抗原 和免疫增強劑的另一項技術包括將抗原和免疫增強劑兩者連接在同一顆粒表面的不同區 域，使顆粒連接在抗原和免疫增強劑之間。在某些實施方案中，這允許保留蛋白質形 狀，即構象，這對於產生合適的免疫應答(例如用於抗體誘導)是至關重要的，而且對於
6免疫增強劑活性而言是必不可少的。在本發明的某些實施方案中，根據所包含的免疫增強劑，設計所述顆粒，以使 免疫應答偏向Thl或Th2偏性。在某些實施方案中，設計顆粒基質的降解，以誘導給定應 答。在某些實施方案中，設計所述顆粒，以在核內體中降解，捕獲它並產生CD8響應。 在某些實施方案中，設計所述顆粒，使其在核內體/溶酶體途徑中分解並呈遞給CD4T細 胞，最終誘導更多抗體應答。在某些實施方案中，設計所述顆粒，從而以不同速率釋放兩種或更多種蛋白 質。在某些實施方案中，兩種或更多種蛋白質中的每一種都以不同速率釋放。在某些實 施方案中，調整釋放速率，使單個納米粒設計可在同一劑量中提供初次和加強效能。在 某些實施方案中，設計某些顆粒，以快速釋放某些蛋白質，而與納米粒結合或連接的其 它蛋白質則慢速釋放。在某些實施方案中，所述貨物(cargo)被掩蔽，以增加隨後強化效 能。在某些實施方案中，保護所述貨物以免在體內分解，因而改善效能並可能會導致對 劑量需求的降低。在某些實施方案中，可對本發明疫苗顆粒進行工程化改造，使其具有特定形 狀，以誘導所需的、增加的或減少的抗體反應。在某些情況下，高長寬比的顆粒與較低 長寬比的顆粒相比能引發更大的免疫原性反應。在其它情況下，較低長寬比引發更大的 免疫原性反應。長寬比是指顆粒的最長軸與最短軸之比。在某些實施方案中，優選的顆 粒形狀可以隨攝取機制、抗原、免疫刺激劑、反應類型等而變。在某些實施方案中，優 選具有更大的表面/體積比的顆粒形狀。在某些實施方案中，可將疫苗顆粒製造成長寬比為至少大約1 1。在某些實施 方案中，可將疫苗顆粒製造成長寬比為至少大約2 1。在某些實施方案中，可將疫苗顆 粒製造成長寬比為至少大約3 1。在某些實施方案中，可將疫苗顆粒製造成長寬比為至 少大約4 1。在某些實施方案中，可將疫苗顆粒製造成長寬比為至少大約5 1。在 某些實施方案中，可將疫苗顆粒製造成長寬比為至少大約6 1。在某些實施方案中， 可將疫苗顆粒製造成長寬比為至少大約7 1。在某些實施方案中，可將疫苗顆粒製造 成長寬比為至少大約8 1。在某些實施方案中，可將疫苗顆粒製造成長寬比為至少大 約9 1。在某些實施方案中，可將疫苗顆粒製造成長寬比為至少大約10 1。依據某 些實施方案，可將疫苗顆粒製造成長寬比範圍為大約1 1至大約60 1。在替代實施 方案中，可將疫苗顆粒製造成長寬比範圍為大約1 1至大約50 1。在其它實施方案 中，可將疫苗顆粒製造成長寬比範圍為大約1 1至大約40 1。依據某些實施方案， 可將疫苗顆粒製造成長寬比範圍為大約1 1至大約30 1。在再一些實施方案中，可 將疫苗顆粒製造成長寬比範圍為大約1 1至大約20 1。在再一些實施方案中，可將 疫苗顆粒製造成長寬比範圍為大約1 1至大約15 1。在再一些實施方案中，可將疫 苗顆粒製造成長寬比範圍為大約1 1至大約10 1。在再一些實施方案中，可將疫苗 顆粒製造成長寬比範圍為大約1 1至大約9 1。在再一些實施方案中，可將疫苗顆粒 製造成長寬比範圍為大約1 1至大約8 1。在再一些實施方案中，可將疫苗顆粒製造 成長寬比範圍為大約1 1至大約7 1。在再一些實施方案中，可將疫苗顆粒製造成長 寬比範圍為大約1 1至大約6 1。在再一些實施方案中，可將疫苗顆粒製造成長寬比 範圍為大約1 1至大約5 1。在再一些實施方案中，可將疫苗顆粒製造成長寬比範圍為大約1 1至大約4 1。在再一些實施方案中，可將疫苗顆粒製造成長寬比範圍為 大約1 1至大約3 1。在再一些實施方案中，可將疫苗顆粒製造成長寬比範圍為大 約1 1至大約2 1。在某些實施方案中，可將疫苗顆粒製造成長寬比為大約1 1。 在某些實施方案中，可將疫苗顆粒製造成長寬比為大約2 1。在某些實施方案中，可 將疫苗顆粒製造成長寬比為大約3 1。在某些實施方案中，可將疫苗顆粒製造成長寬 比為大約4 1。在某些實施方案中，可將疫苗顆粒製造成長寬比為大約5 1。在某 些實施方案中，可將疫苗顆粒製造成長寬比為大約6 1。在某些實施方案中，可將疫 苗顆粒製造成長寬比為大約7 1。在某些實施方案中，可將疫苗顆粒製造成長寬比為 大約8 1。在某些實施方案中，可將疫苗顆粒製造成長寬比為大約9 1。在替代實 施方案中，可將疫苗顆粒製造成長寬比為大約10 1。在其它實施方案中，可將疫苗顆 粒製造成長寬比為大約15 1。在其它實施方案中，可將疫苗顆粒製造成長寬比為大約 20 1。依據某些實施方案，可將疫苗顆粒製造成長寬比為大約30 1。在又一些實施 方案中，可將疫苗顆粒製造成長寬比為大約40 1。在再一些實施方案中，可將疫苗顆 粒製造成長寬比為大約50 1。在再一些實施方案中，可將疫苗顆粒製造成長寬比為大 約60 1。在再一些實施方案中，可將疫苗顆粒製造成長寬比為大於大約60 1。因此，可將本發明疫苗顆粒製造成具有控制在納米尺度上的任意尺寸。例如， 可將具有上述長寬比的本發明疫苗顆粒製造成尺寸為大約80nm χ大約90nm的圓柱狀顆 粒；尺寸為大約80nm χ大約80nmx大約360nm的顆粒；尺寸為大約80nm χ大約80nm χ 大約2000nm的顆粒；尺寸為大約80nm χ大約80nm χ大約5000nm的顆粒；尺寸為大約 1微米χ大約1微米的顆粒；尺寸為大約1微米χ大約3微米的圓柱狀顆粒；和尺寸為大 約1微米χ大約10微米的顆粒。與接受兩種可溶性蛋白質混合物的小鼠所產生的反應相比，共同遞送HA和 IL-12的本發明某些實施方案的疫苗顆粒(例如實施例2的顆粒)誘導針對HA蛋白的更強 烈抗體反應，如圖1所示。在某些實施方案中抗體反應的增加範圍為大約10至大約100 倍的增加。另外，在某些實施方案中，顆粒大小影響抗體應答。如圖1所示，在初次注 射後3周，可溶性蛋白產生大約100抗體效價的應答，本發明的200nmx 200nm χ 200nm 疫苗顆粒產生大約1280抗體效價的應答，而本發明的2微米χ 2微米χ 2微米疫苗顆粒產 生大約10,240抗體效價的應答。在某些實施方案中，可在形狀、大小和長寬比方面來調 整本發明疫苗顆粒，以有效地共同遞送抗原和蛋白質佐劑並獲得所需免疫原性。依據其它實施方案，本發明疫苗納米粒的長寬比可影響針對疫苗納米粒而產生 的應答。在某些實施方案中，在初次注射後，隨著疫苗納米粒的長寬比的增加，在其表 面偶聯有流感HA的微米尺度的疫苗納米粒的長寬比產生增加的免疫應答，如圖2所示。 在某些實施方案中，長寬比大約3 1的顆粒的免疫應答是長寬比為1 1的顆粒的免疫 應答的大約2-3倍。在某些實施方案中，長寬比大約10 1的微米尺度顆粒的免疫應答 是長寬比為1 1的微米尺度顆粒的免疫應答的大約3-4倍。單次注射後誘導的抗體反 應見圖2。在某些實施方案中，納米尺度疫苗顆粒的長寬比導致在初次注射之後，免疫應 答隨其表面偶聯流感HA的疫苗顆粒的長寬比增加而降低，如圖3所示。圖3所示的疫苗 顆粒組合物包括交聯聚乙二醇(PEG)基的(由79%聚(乙二醇)二甲基丙烯酸酯、20%
8甲基丙烯酸氨基乙基酯鹽酸鹽、HCPK組成，然後通過生物素接頭表面修飾進行表面 處理)。在某些實施方案中，本發明的疫苗顆粒是在低表面能模具中成型，利用以下專 利申請中所描述的方法和材料2006年6月19日申請的美國專利申請順序號10/583,570 和2006年11月7日申請的美國專利申請順序號11/594,023 ；和2004年12月20日 申請的PCT國際專利申請順序號PCT/US04/42706 ； 2006年6月19日申請的PCT/ US/06/23722 ； 2006 年 9 月 7 日申請的 PCT/US06/34997 ； 2006 年 11 月 7 日申請的 PCT/ US06/43305 ；和2007年1月29日申請的PCT/US07/02476 ；所述文獻各自通過引用全 部結合到本文中。另見2003年12月19日申請的美國臨時專利申請順序號60/531,531 ； 2004年6月25日申請的60/583,170 ； 2004年8月27日申請的60/604,970 ； 2005年6月 17日申請的60/691,607 ； 2005年9月7日申請的60/714,961 ； 2006年1月27日申請的 60/762,802 ； 2006 年 5 月 9 日申請的 60/798,858 ； 2005 年 11 月 7 日申請的 60/734,228 ； 2006年1月9日申請的60/757,411 ； 2006年5月12日申請的60/799,876 ； 2006年7月27 日申請的；2007年10月12日申請的60/979,710和2006年10月9日申請的60/828,719 ； 所述文獻各自通過弓I用全部結合到本文中。在某些實施方案中，將本發明的疫苗顆粒配製成不產生免疫應答。某些實施方 案的顆粒的免疫原性可通過使用接頭基團化學將抗原和/或免疫增強劑與顆粒綴合而得 以控制。具體地講，在某些實施方案中，免疫原性可通過接頭基團的降解動力學而得以 控制。與用含有經非降解性鍵與其表面連接的HA的顆粒注射的小鼠相比，在用含有經 降解性二硫化物交聯劑與其表面連接的HA的顆粒注射的小鼠中，發現更高的抗體反應。 在初免注射和加強注射之後均可觀察到這一效果。依據某些實施方案，如圖4和圖5所示，通過非降解性交聯接頭與納米粒連接的 蛋白質不產生活性或產生有限活性，而通過降解性交聯接頭連接的蛋白質則產生應答。 在某些實施方案中，納米粒具有通過非降解性交聯劑與其連接的佐劑，使得對於該佐劑 不產生免疫應答，或產生最小的免疫應答。這可有助於維持佐劑對多次注射的作用，僅 通過將佐劑經非降解性接頭與納米粒連接，允許使用高效力佐劑而更少考慮所含數量， 允許使用通常能觸發不良反應的佐劑，等等。如圖4所示，當用降解性接頭來連接時， 在接受包被有HA蛋白的疫苗納米粒的小鼠中產生抗HA抗體的應答；但當HA蛋白用非 降解性接頭連接時，在初次注射後卻沒有產生可檢測的應答。用200nm χ 200nm χ 200nm 疫苗顆粒和2微米χ 2微米χ 2微米的疫苗顆粒都可觀察到這些結果。第二次注射之後， 如圖5所示，用含有經非降解性接頭連接的HA蛋白的顆粒，抗HA抗體的應答是可檢 測到的，然而，比起用具有經降解性接頭連接的HA的200nm疫苗顆粒所產生的應答， 200nm疫苗顆粒的應答要小大約3_4倍，而且比起用具有經降解性接頭連接的HA的2微 米疫苗顆粒所產生的應答，2微米疫苗顆粒的應答要小大約5-6倍。依據本發明的某些實施方案，可以用非降解性接頭連接劑、抗原、分子等構成 疫苗顆粒，對於這些非降解性接頭連接劑、抗原、分子等，不希望產生免疫應答或僅產 生有限的免疫應答。例如，可將靶向劑或其它蛋白質或分子通過非降解性接頭連接在本 發明的疫苗顆粒上並且疫苗顆粒上所述免疫增強劑的存在將不會誘導免疫應答或者將會 誘導有限的免疫應答。
在某些實施方案中，以特定形式遞送抗原，以改進針對抗原的免疫應答。在某 些實施方案中，佐劑和/或免疫增強劑的劑量是不同的，以給出合適的應答。在某些實 施方案中，調整劑量，以有節制地給出免疫原性免疫調節劑，同時又不必減少所遞送的 抗原量。在某些實施方案中，將反應原性蛋白包封在顆粒內。在某些實施方案中，顆粒 靶向目標細胞。在某些實施方案中，所述細胞是抗原呈遞細胞。在其它實施方案中，設 計顆粒，使其攝入胞內，一旦顆粒內在化就被降解。在某些實施方案中，可用一種或多 種抗原、免疫增強劑和靶向配體使顆粒表面官能化。在某些實施方案中，將一種或多種 抗原、免疫增強劑和靶向配體通過降解性接頭基團連接在表面上。在某些實施方案中， 將一種或多種抗原、免疫增強劑和靶向配體通過非降解性接頭基團連接在表面上。在某 些實施方案中，將一種或多種抗原、免疫增強劑和靶向配體通過降解性接頭基團連接在 表面上，而將其它通過非降解性接頭基團連接在表面上。例如，在一個實施方案中， PGLA納米粒可具有連接在表面的不同數量的HA、IL-12和細胞靶向配體；可將HA和 IL-12通過降解性接頭基團而連接，並且可將細胞靶向配體通過非降解性接頭基團而連 接。用於本發明納米粒疫苗的抗原可以是任何類型的抗原，例如包括但不限於病原 體相關抗原、腫瘤相關抗原、變應原相關抗原、神經缺損相關抗原、心血管病抗原、類 風溼性關節炎相關抗原、其它疾病相關抗原、激素、妊娠相關抗原、胚胎抗原和/或胎 兒抗原等。在一個實施方案中，所述納米粒疫苗是重組蛋白、或重組脂蛋白、或重組糖 蛋白以及一種或多種抗原。可將本發明的納米粒疫苗給予有需要的受試者以觸發針對目標抗原的免疫應答 和抗體形成。可通過以下方式給予所述納米粒疫苗注射、吸入、經皮、經黏膜、肛 門、陰道、眼、攝食、靜脈內、其組合等。在某些實施方案中，病毒抗原/免疫增強劑 納米粒產物，例如抗原-鞭毛蛋白納米粒，可產生甚至針對並非很強免疫原性的目標(包 括病毒蛋白質的高度保守區)的應答。給予人類受試者或動物受試者後，本發明某些實施方案的納米粒疫苗可與例如 樹突細胞和巨嗜細胞相互作用。這樣的相互作用將會有兩個結果第一，納米粒疫苗 的免疫刺激劑部分將與信號轉導途徑相互作用並刺激信號轉導途徑，例如NF-kappa.B、 JNK和/或p38途徑。第二，因為這類與受體的相互作用，納米粒疫苗將會通過吞噬、 胞吞或巨胞飲(macropinocytosis)而攝入到樹突細胞和巨嗜細胞中，這取決於細胞類型、 納米粒疫苗的大小和刺激劑的特性。其次，信號轉導途徑的活化將會導致誘導樹突細胞 和巨嗜細胞(和在某些情況下，B細胞)表達細胞因子、趨化因子、粘附分子和共同刺激 分子。對納米粒的攝取將會導致對包含在納米粒中或其上的抗原的加工以及MHC I類分 子和MHCII類分子的呈遞。這將會產生幼稚T細胞活化所需的兩種信號特異性抗原信 號和共同刺激信號。另外，納米粒疫苗所誘導的趨化因子將會使幼稚T細胞募集到APC 和細胞因子(例如IL-12)，其可誘導T細胞分化為Th-I效應細胞。結果，將會誘導強 烈T細胞免疫應答，這反過來又將會活化適應性免疫應答的其它方面，例如抗原特異性B 細胞和巨嗜細胞的活化。在某些實施方案中，適用於本發明的材料可在下列文獻中找到美國專利 號 US7,285,535，名稱為 Toll/interleukin-lreceptor adapter protein (TIRAP) (Toll/ 白介素-1 受體連接物蛋白(TIRAP))；禾Π US6,960,343,名稱為 Toll/interleukin-Ireceptor adapter protein (TIRAP) (Toll/白介素_1受體連接物蛋白(TIRAP))；和已公布的美國 申請 US20070160623，名稱為 Innate immune system-directed vaccines (天然免疫系統 定向疫苗)；US2OO70122似 1，名稱為 Innate immune system-directed vaccines (天然免 疫系統定向疫苗)；US2OO6Ol88933,名稱為 IRAK-M is a negative regulator of toll-like receptor signaling (IRAK-M 是 toll 樣受體信號轉導的負調節劑)；US20060130164, 名稱為 Toll/interleukin-lreceptor adapter protein (TIRAP) (Toll/ 白介素 _1 受體連接 物蛋白(TIRAP)) ； US20060121460,名稱為 TolHike receptor 11 (Toll 樣受體 11)； US20050163764,名稱為 Treatment with agonists of toll-like receptors (用 toll 樣受體激 動劑進行治療)；US2OO3O232O55,名稱為 Innate immune system-directed vaccines (天 然免疫系統定向疫苗)；US20030224388，名稱為 RIP2 a mediator of signaling in the innate and adaptive immune systems (RIP2 天然和適應性免疫系統中信號轉導的介導 物)；US2OO3Ol75287,名稱為 Innate immune system-directed vaccines (天然免疫系統 定向疫苗)；US2OO3Ol57539,名稱為 IRAK-Mis a negative regulator of toll-like receptor signaling(IRAK-M是toll樣受體信號轉導的負調節劑)；US20030023993，名稱為Toll/ interleukin-lreceptor adapter protein (TIRAP) (Toll/ 白介素 _1 受體連接物蛋白(TIRAP))； 和 US20020061312，名稱為 Innate immune system-directed vaccines(天然免疫系統定向 疫苗)；所述文獻各自通過引用全部結合到本文中，用於其中公開的所有目的。在某些 實施方案中，上述所結合的參考文獻中的某些信息包括免疫刺激蛋白或免疫增強劑、抗 原、融合蛋白、遞送技術、劑量方案等。 用於本發明的更多材料可包括美國專利號7,060,284，其中討論了包含多肽和多 核苷酸的組合物用於刺激免疫系統和用於治療HER-2蛋白過量表達相關的惡性腫瘤； Brennan 等， 「Cowpea Mosaic Virus as a Vaccine Carrier of Heterologous Antigens (豆工豆花 葉病毒作為異源抗原的疫苗載體)，，，Mol.Biotechnol.l7(l) 15-26(2001)，其中討論了 嵌合病毒顆粒作為異源抗原的載體；授予Adams等人的美國專利號6,060,064，其中討論 了使用蛋白質載體用於展示免疫原性胺基酸序列，用作疫苗；授予Frey等人的美國專利 號6,086,881，其中描述了包含金屬氧化物顆粒的其它多價疫苗構建體；授予Speaker等人 的美國專利號5,686,113，其中描述了基於多糖的精胺，藻酸鹽膠囊，它們是非合成的； 授予Schwendeman等人的美國專利號6,326,021，其中描述了合成的聚乙交酯-共-丙交 酯生物相容性基礎聚合物；授予Barchfeld等人的美國專利號5,709,879 ；授予Betbeder 等人的美國專利號6,342,226 ；授予Popescu等人的美國專利號6,090,406 ；和Lian等 人，Trends and Developments in Liposome Drag Delivery Systems (月旨質體藥物遞送系統的 趨勢和發展)，J.of Pharma.Sci.90(6) 667-680(2001)和 van Slooten 等人，Liposomes Containing Interferon-gamma as Adjuvant in Tumor Cell Vaccines (月中瘤細胞疫苗中含有幹擾 素1作為佐劑的脂質體)，Pharm Res.l7(l) 42-48(2000)，其中描述了納米粒載體用 作由脂質或其它脂肪酸製備而來的疫苗；和Kreuter, "Nanoparticles and Microparticles for Drug and Vaccine Delivery (用於藥物和疫苗遞送的納米粒和微粒)，」 J.Anat. 189 503-505(1996)，其中描述了非脂質組合物；所述文獻各自通過引用全部結合到本文中， 用於其中公開的所有目的。
「疫苗」可指包含抗原和任選其它輔助分子的組合物，其目的是將所述組合物 給予受試者以刺激專門針對所述抗原的免疫應答並優選造成免疫記憶，導致在未來某個 時刻當受試者遇到該抗原時將會產生免疫應答。其它輔助分子的實例是作為非特異性 免疫刺激分子的佐劑和改善抗原的藥代動力學和/或藥效動力學特性的其它分子。常 規地，疫苗通常包含引起疾病的生物體(經適當減毒或殺死的)或病原生物體的某些 部分作為抗原。減毒生物體，例如減毒病毒或減毒細菌，經操縱後使其喪失在其自然 宿主中生長的某些或全部能力。目前有多種生物技術方法用於產生疫苗。(參見例如 W.Bains (1998) Biotechnology FromA to Ζ,第 2 版，Oxford University Press)；其通過引用 全部結合到本文中。「抗原」是指由適應性免疫系統的抗原受體特異性識別的物質。因此，本文所 用的術語「抗原」包括抗原、抗原的免疫原性衍生物或部分和衍生自抗原的免疫原性分 子。優選地，本發明所用的抗原是分離的抗原。具體用於本發明的抗原包括但不限於病 原體相關的、變應原相關的或疾病相關的那些。抗原也是在任何潛伏期(通常在人體內為數天至數周)之後誘導敏感性和/或 免疫應答狀態並以可證明方式在體內或體外與致敏受試者的抗體和/或免疫細胞發生反 應的物質。抗原的實例包括但不限於微生物相關抗原，尤其是病原體抗原，例如病毒、 真菌或細菌，或衍生自它們的免疫原性分子；包括含有正常移植抗原和/或腫瘤相關抗 原的細胞在內的細胞抗原；RR Rh抗原；特定細胞或組織或體液的特徵抗原或者對特定 細胞或組織或體液的具有特異性的抗原；和變應原相關抗原，例如與環境變應原相關的 那些(例如草、花粉、黴菌、粉塵、昆蟲和皮屑)、職業性變應原(例如乳膠、皮屑、尿 烷、環氧樹脂)、食物(例如貝類、花生、蛋類、乳製品)、藥物(例如抗生素、麻醉劑) 和疫苗(例如流感疫苗)。T淋巴細胞對所展示肽的抗原加工和識別大部分取決於抗原的胺基酸序列，而不 是抗原的三維結構。因此，用於本發明納米粒疫苗的抗原部分可含有表位或特異性目標 結構域，而非完整序列。事實上，本發明納米粒疫苗的抗原部分可包含抗原的一個或多 個免疫原性部分或衍生物，而非完整抗原。另外，本發明的納米粒疫苗可含有具有完整 三維結構的完整抗原或保留抗原決定簇的三維結構的抗原部分，以產生針對抗原空間表 位的抗體應答。病原體相關抗原。病原體相關抗原的具體實例包括但不限於選自以下的抗原 牛痘、禽痘病毒、火雞流感病毒、牛白血病病毒、貓白血病病毒、禽流感、雞肺病毒、 犬細小病毒、馬流感、FHV、新城疫病毒(NDV)、Chicken/Pennsylvania/1/83流感病 毒、感染性支氣管炎病毒；登革熱病毒、麻疹病毒、風疹病毒、假狂犬病、Epstein-Barr 病毒、HIV、SIV > EHV > BHV > HCMV > 漢坦(Hantaan)、破傷風梭菌(C.tetani)、腮腺 炎、麻疹病毒、單純皰疹病毒1型、單純皰疹病毒2型、人巨細胞病毒、A型肝炎病毒、 B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、戊型肝炎病毒、呼吸道合胞病毒、人乳頭瘤病毒、流感 病毒、沙門氏菌、奈瑟氏菌、包柔氏螺旋體(Borrelia)、衣原體、博德特氏菌(Bordetella) 以及瘧原蟲和弓形體、隱球菌、鏈球菌、葡萄球菌、嗜血桿菌、白喉、破傷風、百日 咳、埃希氏菌、念珠菌、麴黴、內阿米巴、賈第鞭毛蟲和錐蟲。癌症相關抗原。本發明的方法和組合物也可用於產生針對腫瘤相關蛋白抗原的疫苗，所述抗原例如黑素瘤相關抗原、乳癌相關抗原、結直腸癌相關抗原、前列腺相關 抗原等。用於所述疫苗的腫瘤相關性或組織特異性蛋白質抗原的具體實例包括但不限於 選自以下的抗原前列腺特異性抗原(PSA)、前列腺特異性膜抗原(PSMA)、Her-2、表 皮生長因子受體、gpl20和p24。為了使腫瘤產生增殖細胞和惡性細胞，它們必須形成血 管。阻止腫瘤血管形成的策略具有成為治療藥的潛力。本發明的方法和組合物也可用 於產生針對腫瘤血管形成的納米粒疫苗。用於這類納米粒疫苗的靶抗原的實例是血管內 皮生長因子、血管內皮生長因子受體、成纖維細胞生長因子和成纖維細胞生長因子受體等。變應原相關抗原。本發明的方法和組合物可用於預防或治療變態反應和哮喘。 依據本發明，可將一種或多種蛋白質變應原與一種或多種納米粒或免疫刺激劑連接，產 生免疫刺激劑/抗原嵌合構建體，並將其給予對抗原過敏的受試者。因此，本發明的方 法和組合物也可用於構建可抑制變態反應的納米粒疫苗。可用於本發明方法和組合物的變應原相關蛋白抗原的具體實例包括但不限於 源自花粉的變應原，例如源自樹木的那些，例如日本扁柏(柳杉屬(Cryptomeria)， 日本柳杉(Cryptomeria japonica))、牧草(禾本科(Gramineae))，例如果園草(鴨茅 屬(Dactylis)，鴨茅(Dactylis glomerata))、野草例如豚草(豚草屬(Ambrosia)，豚草 (Ambrosia artemisiifolia))；花粉變應原的具體實例包括日本扁柏花粉變應原Cryj 1 (J. Allergy Clin.Immunol. (1983) 71 77-86)和 Cryj 2 (FEBS Letters (1988) 239 329-332)， 其通過引用全部結合到本文中，和豚草變應原Ambal.l、Amba 1.2, Amb a 1.3, Amnba
I.4、Amball等；源自真菌(麴黴、念珠菌、鏈格孢菌等)的變應原；源自蟎蟲的變應 原(塵蟎(Dermatophagoides pteronyssinus) > 粉塵蟎(Dermatophagoidesfarinae)等的變應 原)；蟎蟲變應原的具體實例包括Derp I、DerpIK DerpIIK DerpVIK DerfK Derf
II、DerfIIKDerfVII等)；室內灰塵；源自動物皮屑、糞便和毛髮的變應原(例如貓變 應原Feld I)；源自昆蟲的變應原(例如鱗毛或蛾、蝶、搖蚊的鱗屑等，黃蜂例如金環胡 蜂(Vespamandarinia)的蜂毒)；食物變應原(蛋、奶、肉、海鮮、豆類、穀物水果、堅 果和蔬菜類等)；源自寄生蟲(例如蛔蟲和線蟲，例如異尖線蟲(Anisakis))的變應原； 以及基於蛋白質或肽的藥物(例如胰島素)。其它疾病抗原。本發明還涵蓋針對並非癌症、變態反應和哮喘的疾病相關抗 原的納米粒疫苗。作為許多實例中的一個實例和並非限制性實例，澱粉樣蛋白前 體蛋白(稱為「澱粉樣蛋白肽」)的蛋白質裂解產物的胞外累積，與阿爾茨海默病 (Alzheimer，s disease)的發病機制相關(Janus 等，Nature (2000) 408 979-982 ； Morgan 等，Nature(2000)408 982-985)；其通過引用全部結合到本文中。因此，用於本發明納 米粒疫苗的嵌合構建體可包含澱粉樣蛋白β肽，或澱粉樣蛋白β肽的抗原結構域，作為 構建體的抗原部分。「免疫增強劑」或「免疫刺激劑」或「免疫增強劑」可指在微生物、而非人 體中發現的一種分子類型，其可觸發天然免疫應答。因此，本文所用的該術語包括任何 這樣的微生物分子類型並且不限於病原微生物相關的那些。本文所用的該術語包括作為 潛在的天然免疫應答啟動者的結構或其衍生物。免疫刺激結構可在以下分子中發現或由以下分子組成包括但不限於脂多糖；磷脂醯膽鹼；細胞因子佐劑；聚糖，包括肽聚 糖；磷壁酸，包括脂磷壁酸；蛋白質，包括脂蛋白和脂肽；外膜蛋白(OMP)、外表面蛋 白(OSP)和細菌細胞壁的其它蛋白組分；細菌DNA;單鏈和雙鏈病毒RNA;非甲基化 CpG-DNA ；甘露聚糖；分枝桿菌膜；孔蛋白；和各種各樣的其它細菌和真菌的細胞壁 組分，包括在酵母菌中發現的那些。本文所用的免疫刺激劑是由一大類微生物共享的分散的分子結構。它們通常是 微生物代謝的保守產物，其不受限於抗原變異性並且不同於自體抗原，參見Medzhitov等 (1997) Current Opinion in Immunology 9 4 ；其通過引用全部結合到本文中。免疫刺激劑可由以下分子類型組成或在以下分子類型中發現，但不限於以下分 子類型脂多糖(LPS)、孔蛋白、脂質A相關蛋白(LAP)、脂多糖、菌毛蛋白、非甲基 化CpG基序、細菌DNA、雙鏈病毒RNA、甘露聚糖、細胞壁相關蛋白、熱激蛋白、糖 蛋白、脂質、細胞表面多糖、聚糖(例如肽聚糖)、磷脂醯膽鹼、磷壁酸(例如脂磷壁 酸質)、分枝桿菌細胞壁組分/膜、細菌脂蛋白(BLP)、外膜蛋白(OMP)和外表面蛋 白 A(Osp A)。其它有用的佐劑公開於 Henderson 等(1996)Microbiol.Review 60 316 ； Medzhitov 等(1997) Current Opinion in Immunology 9 4-9) ； The European Medicines Agency Evaluation of Medicines for Human Use, 2005 年 1 月 20 日，http://www.emea. europa.eu/pdfs/human/vwp/13471604en.pdf ；所述文獻各自通過引用全部結合到本文中。在本發明的一個實施方案中，優選的本發明免疫刺激劑包括含有DNA編碼的蛋 白質組分的那些，例如BLP、奈瑟氏菌孔蛋白、OMP禾POspA。一種用於本發明的免疫 刺激劑是BLP，因為已知BLP能誘導天然免疫應答的活化(Henderson等(1996) Microbiol. Review 60 316)並已證明能被免疫系統識別(Aliprantis 等(1999) Science 285 763)；所 述文獻各自通過引用全部結合在本文中。本發明也包括篩選多種免疫增強劑、抗原和/或靶向劑的方法，即通過大規模 分批或連續工藝來製造相同或不同組合物的多個納米粒。納米粒可僅包含免疫增強劑/ 抗原作為納米粒的全部組合物或者組合免疫增強劑/抗原可與第三組合物混合或包封在 第三組合物中，其可提供所需的體內活性。這樣的所需體內活性可包括但不限於增加 循環時間，掩蔽以防降解，掩蔽以防不良免疫應答，與細胞膜交聯，胞內降解，其組合 等。此外，納米粒可由抗原製造，然後可將免疫增強劑與納米粒結合或者可將靶向劑與 納米粒偶聯。在一個篩選方法中，含有所需抗原的大量納米粒可由包括接頭基團的基質 來製造，所述接頭基團例如伯胺、羥基、硫化物、羧酸等。然後，可採用本領域已知的 有機化學，通過這些接頭基團，使免疫增強劑與包含抗原的顆粒亞類進行化學或物理偶 聯。當從模具中收穫顆粒之後，可在溶液或乾粉中使所述顆粒官能化，或者以組合方 式，在顆粒陣列上直接官能化。通過該方法，可使顆粒官能化，使得以受控密度、比率 和位置，在其表面上含有一種或多種不同免疫調節劑。然後可以在合適的體外或體內模 型中，篩選這樣的表面官能化顆粒的文庫，以確定最佳免疫增強劑、免疫增強劑組合和 目標抗原的相對濃度。進一步的篩選方法包括除了改變表面的免疫增強劑之外，還改變 顆粒中的抗原濃度。在又一些實施方案中，本發明的納米粒疫苗可用於篩選受試者中抗體的存在或 者篩選樣品中一系列不同刺激劑/抗原組合納米粒，以確定抗體是否存在或刺激劑/抗原組合的功能。可將納米粒構造成具有一種組分，當與目標抗體接觸時其經歷可檢測的或 可產生信號的理化變化，例如，納米粒可包含生物傳感器或者就是生物傳感器，當納米 粒與特定靶標結合時可被觸發。因此，可將具有刺激劑與抗原的不同組合和/或比率的 各種各樣的納米粒組合給予受試者或者可將其用於檢測抗體的存在或免疫增強劑/抗原 組合的功能或活力。在某些實施方案中，本發明的納米粒可用於從生物體或樣品中吸引特定細胞或 蛋白質，與特定細胞或蛋白質結合，並有助於對特定細胞或蛋白質進行標記或過濾。依 據這樣的實施方案，可將納米粒構造成具有細胞、蛋白質或病毒的特異性結合劑，例如 捕獲配體，其一旦結合，就可將這樣的細胞、蛋白質或病毒標記為非自體，並因此有助 於將這樣的細胞、蛋白質或病毒從機體中除去。在又一些實施方案中，納米粒可包括免 疫刺激劑，所述刺激劑能刺激目標免疫系統組分，以收集、聚集或遷移到納米粒上或其 周圍，因而促進納米粒捕獲配體與免疫系統細胞的結合併標記為非自體，從而導致將所 述細胞從受試者中除去。在某些實施方案中，標記自體細胞或蛋白質或病毒(其被非識 別性蛋白層掩蔽)的方法可通過促進免疫系統識別與自體物質結合的納米粒(從而成為非 自體物質)來處理受試者，因而有助於將所述物質從受試者中除去。
實施例給出以下實施例，為本領域普通技術人員提供指南，用於實施本文所公開主題 的代表性實施方案。根據本說明書和本領域技術人員一般水平，技術人員可以理解，以 下實施例僅僅是示例性的並且在不偏離本文所公開主題的範圍之內可以採用眾多變化、 修改和替代。實施例1.顆粒製造和分析方法蛋白質修飾通過以下標準方法，用或者[琥珀醯亞胺基2-(生物素醯胺基)_乙 基-1，3' - 二硫代丙酸](降解性二硫化物生物素接頭)或者硫代琥珀醯亞胺基-6-[生 物素醯胺基]己酸(非降解性生物素接頭)來修飾蛋白質。Wyoming H3 HA (Protein sciences)將 Wyoming HA 溶液(120 μ g/mL， 1.75mL，210 μ g總蛋白)用14.2 μ L IOmM[琥珀醯亞胺基2-(生物素醯胺基)-乙基-1， 3' _ 二硫代丙酸](6mg溶於ImL H2O)處理。將所得混合物振搖30分鐘，然後使用 IOMWCO經Y -輻照的slide-a-lyzer盒(Pierce)，通過透析來純化。樣品對150mL H2O 透析，以30分鐘的間隔更換7次1520。然後從透析盒中回收蛋白質並用於顆粒修飾。重組小鼠IL-12: (eBiosciences)用O.3 μ L 10mM[琥珀醯亞胺基2-(生物素醯 胺基)-乙基-1，3' - 二硫代丙酸](6mg溶於ImL H2O)處理小鼠IL-12溶液(400 μ g/ mL，5uL, 2yg總蛋白)。將所得混合物振搖30分鐘，再用0.025 μ m硝基纖維素膜 (Millipore)通過液滴透析(drop dialysis)而純化。將樣品放在漂浮在50mL H2O上的膜 上，並透析30分鐘。然後從透析膜回收蛋白質並用H2O稀釋4倍，用於顆粒修飾。PEG顆粒製造和修飾採用PRINT工藝，使用所需大小和形狀模槽的Fluorocur 模具，製造顆粒。用含有20wt%甲基丙烯酸2-氨基乙基酯鹽酸鹽、79_%聚(乙二醇) 二甲基丙烯酸酯(MW 1000)和1-羥基環己基苯基甲酮的單體混合物填充模具。填 充後的模具對PET片進行層壓，再暴露給紫外光進行固化。固化後，從PET片上取下模具，留下顆粒分離在PET片上。通過用聚乙烯刀片刮取，從PET片上將顆粒收集到溶液 (無菌H2O)中。離心沉澱顆粒懸液(16Kxg，10分鐘)，去除上清液，然後通過超聲處 理，重新分散在70 30乙醇水中。該工序重複3次，將顆粒以lOmg/mL重新分散在 70%乙醇中並貯存於4°C。PLGA顆粒製造採用PRINT工藝,用PLGA(50 50，0.3i.v.)和聚(二甲氨基 甲基丙烯酸)(MW 20,000)的95 5混合物在DMF中的5wt%溶液，製備用於表面吸 附 HA 的陽離子 PLGA顆粒(FLUVIRIN ) (Novartis，2008-2009seasonal)。用含有 80nm χ 80nm χ 360nm 模槽的FLUOROCUR (Liquidia Technologies, Inc.，North Carolina)，
將該聚合物混合物倒模。顆粒通過離心而純化，然後重懸於0.1wt%聚乙烯醇溶液中。通過首先經使用10K MWCO透析膜對H2O的透析，從蛋白質中脫去所有鹽分， 使HA蛋白(FLUVIRIN )吸附在表面上。對於靶標，顆粒表面上的lowt%劑量的蛋白 質，將IOyg蛋白質(IOOyL)加入到O.lmg顆粒懸浮的200 μ L 0.1wt%聚乙烯醇溶液中。 將懸液在4°C振搖15分鐘，然後離心沉澱顆粒(16,OOOx g，10分鐘)。去除上清液，用 BCA測定來分析殘餘蛋白含量。再將顆粒重新分散在0.4mL0.1wt%聚乙烯醇溶液中，使 蛋白濃度為25 μ g/mL。所得80nm χ 80nm χ 360nm PLGA疫苗顆粒見圖6。牛物素_抗牛物素蛋白化學採用以下標準方法,使用或者[琥珀醯亞胺基 2-(生物素醯胺基)-乙基_1，3' _ 二硫代丙酸](降解性二硫化物生物素接頭)或者硫代 琥珀醯亞胺基_6-[生物素醯胺基]己酸(非降解性生物素接頭)，對顆粒進行表面修飾。 將200nm χ 200nm χ 200nm顆粒的70%乙醇懸浮液(lmL，10mg/mL)沉澱，然後重懸於 ImL無水DMF中，3次。將含有10mg[琥珀醯亞胺基2_(生物素醯胺基)_乙基_1，
3 『 - 二硫代丙酸]和70mg三乙胺的0.5mL DMF溶液加入到顆粒懸液中，再將所得混合 物放入振動臺上過1小時。通過重複離心並重懸於70%乙醇(3x ImL)中，純化所得混 合物並懸浮在70%乙醇中達10mg/mL。表面官能化按照以下兩步法，將顆粒用蛋白質包被。通過離心和重懸浮，將 生物素化顆粒的懸浮液(0.2mL，10mg/mL的70%乙醇懸液)沉澱並在或者lwt%小鼠白 蛋白溶液或者0.1wt%聚乙烯醇溶液中洗滌2次。將顆粒在含水溶媒中重懸到其原來的體 積，再加入等體積的3mg/mL抗生物素蛋白溶液。然後將所得混合物在室溫下振搖15分 鍾。然後通過離心和重懸浮在含水溶媒中3次，將所得顆粒純化。然後將抗生物素蛋白 包被的顆粒以lOmg/mL重懸於溶媒中。然後在第二步驟中，將顆粒用HA和/或IL-12包被。將所需量的蛋白質加入 到微量離心管的H2O中，然後加入抗生物素蛋白包被的顆粒。將所得懸液在4°C振搖15 分鐘，然後離心沉澱。去除上清液，將顆粒重懸於溶媒中至一定體積，使得所需量的蛋 白質/注射在40yL內。如果將顆粒懸浮於0.1wt%聚乙烯醇中，採用Bradford測定來分 析上清液中的殘留蛋白(通常>95%蛋白質從上清液中除去)。如果將顆粒懸浮於
小鼠白蛋白中，採用將生物素化蛋白與抗生物素蛋白在顆粒上相結合的化學計量學，間 接測定顆粒的結合能力。用螢光標記蛋白(用生物素和Hylite 647兩者標記的牛IgG)處 理抗生物素蛋白包被的顆粒。沉澱顆粒，比較顆粒處理前後的螢光強度並對所生成的標 準曲線校準。對各顆粒計算結合能力，然後以小於等於測定結合能力的數值將顆粒與HA 和IL-12 —起給予。本發明生物素_抗生物素蛋白納米粒的示意圖見圖7。
陽離子表面吸附通過離心和重懸浮,從乙醇懸液中沉澱未修飾顆粒(20%甲 基丙烯酸氨基乙基酯鹽酸鹽、79% PEGik-二甲基丙烯酸酯、1%HCPK)並在0.1wt% 聚乙烯醇溶液中洗滌2次。將顆粒(lmg，10mg/mL)加入到HA溶液(10 μ g， 222μ @45μ§/ιηυ中，所述溶液已經對H2O透析，以從蛋白製備物中除去NaCl。將懸 液在4°C振搖15分鐘，然後沉澱顆粒並重懸於0.25mL0.1wt%聚乙烯醇中。通過Bradford 測定來分析上清液中蛋白質的存在，>95%蛋白質吸附到顆粒上。可按類似方式，單獨 或與HA蛋白組合，使重組小鼠IL-12吸附到顆粒上。分析HA ELISA標準ELISA方法用於測定抗HA抗體反應。在測定中，96孔 板用 50ng/孔的血凝素蛋白(H3A/Wyoming/03/2003，Protein Sciences,目錄號 3006)包 被。在系列兩倍稀釋液中測定血清樣品。用在山羊中產生的具有鹼性磷酸酶的抗小鼠 IgG完整分子(Sigma，目錄號A3688)來測定抗體。用Sigma Fast 磷酸對硝基苯酯片 (Sigma,目錄號 N2770-50SET)進行測定並在 Molecular Devices SpectraMaxM5 讀板器上 讀數。對於HA/IL12包被的顆粒講行抗體染餼使表面連接IL12的顆粒暴露給IL12的 標記抗體(抗小鼠IL12PE，BioLegend,目錄號505203)並洗滌。通過螢光顯微鏡術， 顆粒呈現紅色，歸因於對IL12具有特異性的紅色標記抗體。使表面連接HA的顆粒暴露給HA抗體(抗H3流感血凝素兔多克隆，Protein Sciences,目錄號6100)。洗滌顆粒，留下與顆粒表面上存在的HA結合的抗體。用具有 綠色標記的抗兔第二抗體(抗兔IgGAlexaFluor 488，Invitrogen,目錄號A21206)識別抗
體結合。將過量第二抗體洗去，通過螢光顯微鏡術對顆粒成像，以檢測綠色螢光，其可 表明顆粒表面上HA的存在。將表面連接IL12和HA的顆粒暴露給帶標記的IL12抗體(抗小鼠IL12PE， BioLegend,目錄號505203)和HA抗體(抗H3流感血凝素兔多克隆，Protein Sciences, 目錄號6100)。洗滌顆粒，留下一種與顆粒表面上存在的HA結合的抗體和另一種與顆粒 表面上的IL12結合的抗體。用具有綠色標記的抗兔第二抗體(抗兔IgGAlexaFluor 488， Invitrogen,目錄號A21206)識別HA抗體結合。將過量第二抗體洗去，通過螢光顯微鏡 術對顆粒成像，以檢測綠色螢光，其可表明顆粒表面上HA的存在，並檢測紅色螢光，其 可表明顆粒表面上IL12的存在，如圖8所示。實施例2 PRINT遞送的蛋白疫苗顆粒的免疫原性測定表面上含有HA和IL12的疫苗顆粒(由79%聚(乙二醇)二甲基丙烯酸 酯、20%甲基丙烯酸氨基乙基酯鹽酸鹽、HCPK組成，然後通過降解性生物素接頭 進行表面處理)刺激幹擾素Y的能力。首先，從完整的小鼠脾臟(BALB/c小鼠，來自 Charles River Laboratories)中分離脾細胞並接種在96孔板中。將測試顆粒給予脾細胞並 讓其孵育過夜。使用標準ELISA試劑盒(Mouse INFg ELISA kit, eBiosciences,目錄號 88-7314-77)，分析這些細胞上清液中幹擾素Y的產生。數據參見表1，表明IL12在顆 粒上並保持功能。
權利要求
1.刺激受試者體內免疫應答的方法，所述方法包括將與抗原偶聯的微米尺度顆粒給予所述受試者，其中增加所述微米尺度顆粒的長寬 比能增加所述免疫應答。
2.權利要求1的方法，其中所述微米尺度顆粒的長寬比為大約3 1，並且其中所述 免疫應答比給予長寬比為大約11的顆粒所導致的免疫應答高出大約2至大約3倍。
3.權利要求2的方法，其中所述微米尺度顆粒包含尺寸為大約1微米乘大約1微米乘 大約3微米的顆粒。
4.權利要求2的方法，其中所述微米尺度顆粒包含尺寸為大約2微米乘大約2微米乘 大約6微米的顆粒。
5.權利要求1的方法，其中所述微米尺度顆粒的長寬比為大約10 1，且其中所述免 疫應答比給予長寬比為大約11的顆粒所導致的免疫應答高出大約3至大約4倍。
6.權利要求5的方法，其中所述微米尺度顆粒包含大約1微米乘大約1微米乘大約10 微米的顆粒。
7.降低由與納米尺度顆粒偶聯的抗原所導致的免疫應答的方法，所述方法包括增加所述納米尺度顆粒的長寬比。
8.基本上抑制由給予受試者的免疫刺激劑所導致的免疫應答的方法，所述方法包括在將所述免疫刺激劑給予所述受試者之前，使所述免疫刺激劑通過非降解性接頭與 顆粒偶聯。
9.權利要求8的方法，其中所述方法導致在將所述免疫刺激劑初次給予所述受試者之 後基本上能抑制免疫應答。
10.權利要求8的方法，其中所述方法導致在將所述免疫刺激劑加強給予所述受試者 之後基本上能抑制免疫應答。
11.疫苗顆粒組合物，所述組合物包含被構造成能以第一速率釋放第一蛋白和以第二速率釋放第二蛋白並且被構造成能以 單劑量提供初次效能和加強效能的多個顆粒。
12.刺激受試者體內免疫應答的方法，所述方法包括給予所述受試者多個顆粒，其中每個顆粒都與免疫刺激劑和蛋白質偶聯。
13.權利要求12的方法，其中所述給予多個顆粒導致的抗體效價比給予不與所述顆粒 偶聯的免疫刺激劑和蛋白質所導致的抗體效價高出至少大約10倍。
14.權利要求12的方法，其中所述多個顆粒的幾乎每個顆粒都包含尺寸為大約200nm 乘大約200nm乘大約200nm的顆粒。
15.權利要求1的方法，其中所述多個顆粒的幾乎每個顆粒都包含尺寸為大約2μ m乘 大約2 μ m乘大約2 μ m的顆粒，而且其中所述給予多個顆粒導致的抗體效價比給予不與 所述顆粒偶聯的免疫刺激劑和蛋白質所導致的抗體效價高出至少大約100倍。
全文摘要
刺激受試者體內免疫應答的方法包括將與抗原偶聯的微米尺度顆粒給予所述受試者，其中增加所述微米尺度顆粒的長寬比能增加免疫應答。刺激受試者體內免疫應答的方法包括給予所述受試者多個顆粒，其中每個顆粒都與免疫刺激劑和蛋白質偶聯。疫苗顆粒組合物包含被構造成能以第一速率釋放第一蛋白和以第二速率釋放第二蛋白並且被構造成能以單劑量提供初次效能和加強效能的多個顆粒。
文檔編號A61K9/14GK102014874SQ200980116881
公開日2011年4月13日 申請日期2009年3月4日 優先權日2008年3月4日
發明者A·加羅維, A·墨菲, B·哈比, J·懷特, J·金迪, L·科普, S·羅思 申請人:流體科技公司