抑制弓形蟲wx2基因表達的siRNA及其應用的製作方法

2023-11-30 18:31:06

專利名稱：：抑制弓形蟲wx2基因表達的siRNA及其應用的製作方法
技術領域：
：本發明涉及一種siRNA，具體涉及一種抑制弓形蟲wx2基因表達的siRNA及其在篩選弓形蟲減毒活疫苗中的應用。
背景技術：
：弓形蟲是一種專性細胞內寄生的機會致病原蟲，生活史複雜，涉及的組織器官多，可引起人獸共患的弓形蟲病，其危害嚴重程度在再現疾病中僅次於結核。孕婦感染弓形蟲可引起流產、早產、畸胎、死胎、嬰幼兒先天性弓形蟲病、小兒智力障礙等，對人口素質和優生優育產生嚴重影響。近年來，隨著寵物熱的興起，人與動物接觸機會增加，給弓形蟲病的流行帶來了新的問題。弓形蟲腦炎已成為愛滋病患者的主要死亡原因之一，也是器官移植患者死亡和精神病發病的主要原因之一。目前，尚無十分理想的弓形蟲病治療藥物，現有的化學藥物有治療周期長、藥物毒副作用大、不能根治等缺陷，迄今為止尚無一種藥物能夠殺滅包囊內的蟲體，加之弓形蟲的重複感染十分迅速，故雖經多方面努力仍未得以很好地遏制。因此，研製安全高效的弓形蟲病疫苗已成為人們的迫切需要。關於弓形蟲減毒或弱毒活疫苗已有不少報導，主要有Ts溫度敏感株、T263突變株、S48速殖子等，其中Ts溫度敏感株在多種動物體內獲得了抗致死性攻擊的保護力；T263突變株能有效抑制貓排卵囊的能力，由此切斷傳播途徑；1988年，0'connd用S48速殖子有效地控制了綿羊的流產，現已用作抗綿羊弓形蟲病的商用疫苗。本發明人通過具有保護性的抗弓形蟲單克隆抗體免疫篩選弓形蟲cDNA文庫獲得二個新的具有免疫保護性的候選分子，其中vv;c2基因^GenBank登錄號為AY238892J序列長1515bp(SEQIDNO.l)，起始密碼子位於734-736位鹼基，編碼183個胺基酸，蛋白質理論分析量為48.639kDa。wx基因(GenBank登錄號AY208994)序列長984bp(SEQIDN0.2),起始密碼子位於243-245鹼基，編碼198個胺基酸，蛋白質理論分子量為49.165kDa。我們利用近幾年迅速發展起來的RNAi(RNAinterfetense)新技術，針對弓形蟲wx2基因的228-247位序列設計的雙鏈DNA，並將其導入弓形蟲體內，獲得體內能持續表達siRNA分子的RNA幹擾蟲株，動物感染實驗表明其毒力顯著減低，有望開發出家畜和寵物用弱毒或減毒活疫苗。
發明內容本發明的目的在於提供一種抑制弓形蟲wx2基因表達的siRNA。本發明的抑制弓形蟲wx2基因表達的siRNA是通過設計並體外合成雙鏈DNA，構建逆病毒表達載體並導入弓形蟲體內，獲得在體內持續表達的siRNA分子。所述雙鏈DNA的鹼基序列為正義鏈5'-GATCCCCCATCCGTAAAGCGGTGAGTtTTCAAGAGA|ACTCACCGCTTTACGGATGTTTTTA-3';(SEQIDNO.5)反義鏈5'-AGCTTAAAAACATCCGTAAAGCGGTGAGT|rCTCTTGAA|ACTCACCGCTTTACGGATGGGG-3';(SEQIDNO.6)其幹擾位點為wx2序列的895913位的19個核苷酸，方框內為為迴文結構。所述siRNA的表達質粒為逆病毒表達載體pSUPER.retro，其分子大小為7196bp。本發明的另一目的在於提供上述siRNA在篩選弓形蟲弱毒或減毒活疫苗中的應用。應用本發明的siRNA篩選弓形蟲弱毒或減毒活疫苗的技術方案如下首先構建幹擾質粒，經電穿孔法導入弓形蟲體內，經篩選獲得體內能持續表達siRNA分子的可遺傳的RNA幹擾蟲株，採用RT-PCR鑑定其幹擾效果，選取高效的RNA於擾蟲株，通過動物攻擊實驗檢驗其幹擾效果，進而利用篩選到的幹擾蟲株開發家畜和寵物用弱毒或減毒活疫苗。所述幹擾蟲株的篩選方法為幹擾蟲株的篩選方法為採用細胞內篩選和細胞外低溫篩選結合的方法，首先在3^g/ml嘌呤黴素條件下、於L929細胞內培養8天，轉到^g/ml嘌呤黴素條件下、於4'C細胞外選擇8天，然後在4^g/ml嘌呤黴素條件下、於L929細胞內選擇培養5天。本發明的優勢在於本發明的siRNA分子能特異、高效地抑制弓形蟲wx2基因的表達，體外幹擾表達實驗結果表明幹擾質粒組蛋白質表達量較對照組減少60-70%;RT-PCR實驗結果表明篩選的幹擾蟲株wx2b-i的幹擾效果達到80%以上；進一歩的動物攻擊實驗表明千擾蟲株vvx2b-i組動物發病及死亡時間顯著推遲，平均存活時間延長一倍，因此該幹擾蟲株有望成為新的減毒蟲株，可望進一步研製成應用於家畜和寵物的弱毒或減毒活疫苗。圖l:pSUPER-retro質粒圖圖2:幹擾質粒雙酶切瓊脂糖凝膠電泳鑑定結果A.pSUPER-vv/JcCEcoiI，^7u7l雙酶切；B.pSUPER-w義2cEcoRI,屈ol雙酶切；C.pSUPER-wo:B五coM，報"i/llI雙酶切；D.空泳道，無條帶出現；E.pSUPER-wcc2bEcoRI，歷rtdUI雙酶切；F.pSUPER-no;2a五coiI，狄"dLU雙酶切；G.pSUPER-CfcoWI,;^oI雙酶切；H.pSUPER質茅站co/U^oI雙酶切；圖3:共轉染幹擾質粒與pcDNA3-vvx2在真核細胞COS-7細胞中蛋白質表達的Western-blot結果A.pcDNA3對照組；B.pSUPER-wx2c與pcDNA3-wx2共轉染組；C.pSUPER-no:2b與pcDNA3-Ha2共轉染組；D.pSUPER-vva;2a與pcDNA3-na2共轉染組；E.pSUPER-C與pcDNA3-wx2共轉染組；F.pcDNA3-wx2圖4:幹擾蟲株的vv;c2基因RT-PCR檢測結果A.幹擾株wx2c-i;B.幹擾株Hoc2b-i;C.幹擾株C-i;D.野生型RH株弓形蟲；E.幹擾株Ha2a-i;F.P24對照圖5:不同時間各組小鼠存活比率1.RH株組；2.C-i組；3.vwc2b-i組圖6:速殖子攻擊後各組小鼠平均生存時間具體實施例方式一、siRNA的設計與合成pSUPER-retro質粒(圖l)為美國伊利諾伊大學羅樹紅博士惠贈。根據wx2、wjc基因cDNA序列和siRNA的設計原則以及載體pSUPER.retro的特點各設計三對具有髮夾結構的包含N-19的核苷酸靶序列，序列由上海生工合成。1、盯ik(酶切位點為/厶歷/7rffl7)(SEQIDNO.3)(SEQIDNO.4)2、盯ib.(酶切位點為餘〃/,〃^o!/Z7)5'-GATCCCCCATCCGTAAAGCGGTGAGTTTCAAGAGAACTCACCGCTTTACGGATGTTTTTA-3'(SEQIDNO.5)5'-AGCTTAAAAACATCCGTAAAGCGGTGAGTTCTCTTGAAACTCACCGCTTTACGGATGGGG-3'(SEQIDNO.6)3、(酶切位點為iW//,J力o/)5'-GATCCCCAGCGGTGAGTGTCGTTCTATTCAAGAGATAGAACGACACTCACCGCTTTTTTA-3'(SEQIDNO.7)(SEQIDNO.8)4、盯A.(酶切位點為5g7//,5'-GATCCCCGGGTGGCTTCTACAAGGAATTCAAGAGATTCCTTGTAGAAGCCACCCTTTTTA-3'(SEQIDNO.9)5，(SEQIDNO.10)5、(酶切位點為A^//,歷/7說Z/)5'-((SEQIDNO.11)(SEQIDNO.12)6、wjfC.(酶切位點為5,-；(SEQIDNO.13)5，(SEQIDNO.14)7、陰性對照(C)(酶切位點為5'-GATCCCCTATCCGCACGCTCACTCTATTCAAGAGATAGAGTGAGCGTGCGGATATTTTTA-3'(SEQIDNO.15)5'-](SEQIDNO.16)二、幹擾質粒的構建1、配對退火將配對的OligoDNA用去核酸酶的水溶解至3^g/ml，在PCR管中加入正義和反義核苷酸各及lxSTE退火緩衝液，90°C4min,7(TClOmin，然後逐漸冷卻至10°C,-2(TC保存備用。2、雙酶切、回收將pSUPER質粒(2^g)、州WU12.5^1、lOxTangobuffer2〃1、去離子水配成2(Vd體系，37。C酶切4hr，取反應液進行瓊脂糖凝膠電泳，確定酶切完全。在反應體系中加入Bg/Il2W，37'C酶切過夜。最後進行瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下切膠回收質粒片段，測濃度並4'C保存備用。3、連接連接反應體系見表1，16'C連接過夜，構建的幹擾質粒命名為pSUPER-vvjc2a、pSUPER舊2b、pSUPER督2c、pSUPER督A、pSUPER督B、pSUPER督C、pSUPER-C。表l幹擾質粒連接體系退火Oligos2^1T4DNA連接buffer(10x)1^1pSUPERT4連接酶l川去離子水_^fi總體積_4、連接產物的轉化1)冰上融化感受態細胞或用新鮮製備的感受態細胞；2)將冷卻的10Al連接混合物加入感受態細胞中，輕輕混勻後冰浴60min;3)42。C熱休克90sec後迅速置冰水浴孵育2min;4)加入800^1LB液體培養基，混勻，37°C，220rpm振蕩培養60min;5)取100培養物平鋪到含Amp(100mg/L)的LB瓊脂平板上，將平板放置室溫下直至表面液體被吸收。倒置平皿，於37"培養箱中培養過夜。5、挑單克隆，初級搖菌從LB平板上挑取克隆，加入5ml液體LB(含Amp，100//g/ml)，在37'C300rpm搖床上振蕩孵育1216h。三、弓形蟲幹擾質粒的鑑定pcDNA3-wx2、pcDNA3-wx質粒為本發明人構建並保存。1、重組質粒雙酶切鑑定陽性克隆取1.5ml菌液按試劑盒說明書進行操作，小量提取質粒進行雙酶切鑑定，37i:酶切4h，雙酶切反應體系見表2。為了便於觀察，酶切選用的位點是五coiI和i^V^UJ，觀察的目的條帶為281bp，陰性對照質粒採用EcoiI和屈ol雙酶切，在248bp處出現相應條帶。表2雙酶切反應體系載體iowddH205EcoRI1.5WHindlII/Xho11.5^1BufferR_2川總體積_20W幹擾質粒雙酶切瓊脂糖凝膠電泳鑑定結果顯示所有幹擾質粒包括陰性對照質粒均在6.9Kb左右和281bp處各出現一條帶。pSUPER空質粒對照在6.9Kb左右和248bp處各出現一條帶，與預期一致，證明幹擾構建成功(見圖2)。2、重組質粒測序鑑定將前一步提取的質粒分裝於EP管中，送上海生工測序。測序引物根據pSUPER載體設計並由上海生工公司合成5-GGAAGCCTTGGCTTTTG陽3'bindingsite:1241-12575'-GATGACGTCAGCGTTCG陽3'bindingsite:2645-2629測序結果與預期一致，說明構建成功，幹擾質粒測序結果見SEQIDN0.17，陰性對照pSUPER空質粒測序結果見SEQIDN0.18。3、幹擾質粒與>2真核表達質粒共轉染COS-7細胞，初步觀察其體外幹擾表達的效果1)24孔板培養COS-7細胞，在50(Vd無抗生素的DMEM培基中接種2xlS細胞，待細胞長到90-95%密度時開始轉染。轉染前1天換成無血清DMEM培基；2)轉染混合物用5QtdOpti-MEM(無血清)培基稀釋pcDNA3-wx2,pcDNA3-wx質粒DNA及幹擾質粒各0.8^g，輕輕混勻。在5QalOpti-MEM(無血清)培基加入2.QalLipofectamin2000，室溫孵育5min。然後混勻DNA與Lipofectamin2000(總體積100〃)，輕輕混勻，室溫孵育20min;3)將DNA與Lipofectamin2000混合物加入24孔板細胞中，來回輕輕晃動培養板；4)37°C5%C02培養6hr後換培養基一次，培養48h-72h後收集細胞裂解液進行Westtern-blot鑑定。實驗結果表明基因wx2的幹擾質粒中pSUPER-wx2b組與pSUPER-wx2c組蛋白質表達量較陰性對照和野生型對照組有所減少，經灰度掃描，pSUPER-na2b組蛋白質表達量較對照組減少70%以上，pSUPER-wx2c組蛋白質表達量較對照組減少60%以上。pSUPER-wx2a組幹擾效果不明顯。基因wx的幹擾質粒中pSUPER-wxC組表達減少不明顯(圖2)。四、RNA幹擾蟲株的建立及幹擾效果觀察1、質粒大量提取參照試劑盒說明進行。2、電轉化幹擾質粒入弓形蟲體內DNA的處理幹擾質粒(pSUPER-w;c2a,pSUPER-wx2b，pSUPER-wo:2c，pSUPER-w;cB,pSUPER-wjcC,pSUPER-C)50^g用去離子水稀釋成300W體積，力fl100%乙醇600^1和3Qal醋酸鈉(pH3.0，3M)，-20°(:過夜，14000rpm離心10min，棄上清，用lml70呢乙醇洗DNA(-20。C至少2h)，14000rpm離心10min,晾乾後用100^1電轉染buffer懸浮DNA。收穫純化弓形蟲速殖子，每次轉染用5-10xl(^個速殖子，1600rpm離心6min,棄上清，用5ml電轉染緩衝液漂洗速殖子1次，再將速殖子重懸於電轉染緩衝液30Q1中，再加入處理過的質粒DNA10Qal，混勻，轉入4mm電擊杯進行電穿孔。條件1.5千伏，25//F電擊一次，時間lms，室溫放置15min，然後將蟲體轉入細胞中培養(含5%小牛血清)，37°C，5%(202培養12h後換成嘌呤黴素選擇培養。3、質粒轉染蟲株的篩選選取不同細胞株HeLa、3T3、HFF、L292，用DMEM完全培基培養至長滿培養瓶，接種幹擾質粒轉染的弓形蟲，37°C、5%(202培養12小時，換成不同濃度嘌呤黴素培養基(分別含0.5^g/ml、1^g/ml、1.5^g/ml、2^ag/ml、3^g/ml、4^g/ml質量百分比濃度嘌呤黴素及5%小牛血清)選擇培養。在不同時間觀察蟲子及細胞生長情況，在選擇培養後8天，收集蟲子，離心收集沉澱，用4^g/ml嘌呤黴素溶解沉澱，(C細胞外選擇8-15天，回復到細胞內用^g/ml嘌呤黴素選擇培養5天，收集蟲子接種昆明小鼠，大量收集弓形蟲用於提取RNA進行後續檢測及電鏡檢査。實驗結果表明HeLa、3T3、HFF細胞對於嘌呤黴素的耐受不同，在濃度為0.5-1.5^g/ml之間，對幹擾質粒轉染蟲體的選擇性殺傷不理想，對照組野生型蟲株在選擇5天後仍沒有明顯死亡，細胞死亡也少；在2/zg/ml以上時，野生型對照組的蟲體雖然死亡明顯，但細胞在培養第3天就大量死亡，不足以維持蟲體的生長。L929細胞對嘌呤黴素的耐受力較前幾種細胞好，在3^g/ml時可以耐受選擇5-8天左右，而細胞死亡速度較慢，在4^g/ml時仍可以耐受4-5天，所以選擇L929細胞作為宿主細胞。DMEM完全培養基的小牛血清濃度為5%，以限制細胞生長速度，細胞生長速度過快不利於蟲體的篩選。幹擾蟲株在L929細胞中選擇培養8天後，野生型蟲株組蟲體在顯微鏡下觀察不到，培養上清接種昆明小鼠(盲傳)均無發病現象。4、RT-PCR在mRNA水平檢測基因wx2的表達1)總RNA的提取取2-3xl7個弓形蟲幹擾株(wx2a-i，wx2b-i，w;c2c-i,wxB-i,wxC-i，C-i)速殖子加入lmlTrizol，室溫放置5min，再加入0.2ml氯仿，劇烈振蕩15min，室溫放置3min,4。C，10000rpm離心15min，吸取水相部分，於水相中加入0.5ml異丙醇，室溫放置10min,4'C，10000rpm離心10min，棄上清，留沉澱，用75%的乙醇洗滌沉澱，4'C，lOOOOrpm離心5min，晾乾10min,用2QalDEPC處理水55-6(TC溶解沉澱，-7(TC保存備用。2)逆轉錄採用Ferment公司的逆轉錄試劑盒進行，在冰浴試管中加入總RNA5/d(5^g)，引物01igo(dT)^1^1,DEPC處理水定容至12W，混勻，瞬時離心5sec，然後7(TC水浴5min，冰浴30sec,瞬時離心5sec，將試管冰浴再加入5xreactionbuffer4/d，RNaseinhibitor(20u/^l)2/zl,dNTPMix(10mmol/L)2/d,37。C水浴5min，再加入AMVRT1^1(20U/^1)，總體積為20W，37'C水浴60min,7(TC加熱10min結束反應，-2(TC保存備用。3)PCR擴增以逆轉錄的cDNA為模板，引物分別為ho:2,正向引物GCGAATTCCTTGCGGAGACACATG;反向引物CCGCTCGAGATTCGTTTAGAGAGG。tableseeoriginaldocumentpage10cDNA模板3ul無菌雙蒸水__總體積___PCR擴增條件94。C預變性4分鐘，94。C變性80秒，53。C/52。C退火80秒，72°C延伸120秒，共35個循環，72"C再延伸8分鐘，4"C保存。實驗結果表明幹擾蟲株wx2c-i、wx2b-i均獲得一定的基因沉默效果，其中幹擾蟲株vvx2b-i(B泳道)基因沉默效果尤其理想，經灰度掃描RNA幹擾效果達到80%左右(圖4)。考慮到有些序列可能在二級結構或在高一級巻曲內被隱藏，部分靶mRNA不能被dsRNA作用，因此，幹擾效果能夠達到80%是相當成功的。五、幹擾蟲株毒力及動物攻擊實驗觀察實驗分三組，每組各10隻昆明小鼠(22±5g)，分別記數500個幹擾蟲株、陰性蟲株C-i、野生型RH株弓形蟲速殖子腹腔接種小鼠，觀察小鼠死亡時間。在動物感染實驗中，vv義2b-i組動物存活時間較陰性C-i組和野生型RH株弓形蟲組明顯延長，40%小鼠存活期長達21天，平均存活時間為319.1土175.6h;而對照組小鼠在10天內基本全部死亡陰性，其中C-i組和野生型RH株組平均存活時間分別為161.2±11.98h與165.4±6.09h，統計學分析具有顯著性差異，P<0.05;發病及死亡時間推遲，說明幹擾蟲株毒力有所減低(圖6、圖7)。SEQUENCELISTING〈110〉中南大學〈120〉抑制弓形蟲wx2基因表達的siRNA及其應用〈130〉Patentlnversion3.3〈210〉1〈211〉1515〈212〉廳<213〉Toxoplasmagondii〈400〉1ggcacgagcgagcgtgttgcgaaggcaaaccgataaacagttcttgctctctgcctgttg60gaaaccatgttcttacgatggctgggctgttttcgcgcatcctcgtttgacgtaggttag120tgacatgcttctactccgtgcttcgtcagtgaaaactttgtgttgccgaaacaagcaatg180tgcctctactgggcaacttcctcttaacatgttcaaggtcga^aaaaaaaaaaaaaa犯240ctcgagagatcttttgagcacaagaaggtacacgtttctttcccttctgctcgcctcggc300ggtaaggctggtgcgcatttgttgcacgcgcatctttccacatgaaaaaagagcgcgtat360cgggataacgggagacagagcgaaaataaaagagggcgggtttc3tttgg犯caacgcca420agacattgtttctgcaacatacaccgcgagaaactgctgcaccccgcagtagagattgaa480cttcaccggaatcgagtgtaatccacacgctagaccaggcctaaagacgtttacccagtt540cctaaccgggcgccgcgcttgtccttcgagaaaaaacttcatggaagaaaaaagctcaca600ctttgtaccgacaaacggcaaacattagcgccatacgcaaaaggaaccgcatgcacacag660ctcggtaagctcctcctctcgacggtacctgacctaattcggtgcaccgagcgatagaca720attgcggagacacatgtatatctgtatagaaggtacgcaaaaaggtaggatcacagacgc780gcatgcaaaaacacattcctcacagacgcgatggcgtcctgcacctgcagtgccgcttct840tcattcaccgattcacatgacattttccttcgaccggagagacgaaaacatccgtaaagc900ggtgagtgtcgttctacgtatcgcctctcgtcgccgaagagaagaaattcctccatactc兆Oaggactcttcggatttcctcagtttgcttctgcattccgtgttcccttcttcgtcgtctc1020tcctccctcctccccatttctttgcttcctctctctcctttctaaccgtctctgcggctc1080tccgccgtcgctccgttcctcgactttgcttctcggagtcgagcgcgtcgacccttcctc1140ccggtttctctcttctctggatacgagcgaacgcgagctgaccgcgtcgcaccaccctca1200aaacactcgcacggggtcccatgtgaggtacacacacgaagtatttttcctccggctgca1260cttgaacgtacacagaagtcaggcgacaccgtgagtgcagcaggcccgcggcttggggga1320gctccggcctctctaaacgaatctgaaaatgcgcgaaagaaaagcgacttgcccttcccg1380cacagtccgtggtgtggcgcgagcgacattccacgcctgggatttgcgtcatcacaaaac1440tatcgaaccagcaaatgcacttgtttttcgccaccgcagagacacgtgagtcattgttgc1500tctcgcttctttgcc1515〈210〉2〈211〉984〈212〉腿<213〉Toxoplasmagondii〈400〉2ggcacgaggcgcttttggcttcgttccgatcgtccgcgagtcttcccctcgtttttacac60aatggcggaccggtactctgtgaagctgttgcggcccatggagggcgtccccgtccccga120gcggaccaagaccaagatcgcccgggacgtcaagcttctcaacaagatgaagcaggcgaa180ggaagcccacgcaaagaaggttcatgcacagcgtcatgcgctcaagatgaggacatacaa240gtatgtcagcgagtacagggaaggagagagaigaacctcatcaagctgaagcgcgaggcca300aggcgaagggtggcttctacaaggaacccgaggc犯aggttatcctggccactcgtatca兆Oagggtatcaacaagcttgctcccaagccgaagatgattctccgtctcttccggctgcgcc420agctcc.acaacgcggtcttcatcaaggtcaacaaagccaccattgaaatgttgaaggctg480tccagcccttcatcacttacggctacccgaccctgaaaactatccgccagctcatctaca540agcgtggctacgctaaggtcggcaagcccggcgcccactcgcgcatccgcctgcaagcga600acgacatcgtgtcccagcacttgggcaagtacggcatccacggagtcgaggatttggttc660acgaaatctacacttgcggcccgtacttcaagcaggcgaacaactttttgtggccgttta720agctcaactctccccgcaagggattcaccagcaagcgccacggctacaacgagccccgca780agggagactggggcaacagagaggaaatgatcaacgagttggtccagcgaatgatctaaa840agcagacggcgtccgcgcgggagggtggccgagggccgctgaatctcgtgcacgtggtgt■ctttgttctgtagtgaagcaactgcgcatccaactctcaccgtccaatcgtaacagtgac%03<211〉60DNA〈213〉人工序列〈400〉3gatccccacacattcctcacagacgcttcaagagagcgtctgtgaggaatgtgtttttta〈210〉460腿〈213〉人工序列〈400〉4agcttaaaaaacacattcctcacagacgctctcttgaagcgtctgtgaggaatgtgtggg5〈211〉60DNA9846060〈213>人工序列〈400〉5gatcccccatccgtaaagcggtgagtttcaagagaactcaccgctttacggatgttttta606〈211〉60〈212〉DNA〈213〉人工序列6agcttaaaaacatccgtaaagcggtgagttctcttgaaactcaccgctttacggatgggg60〈210〉7<211〉60〈212〉DNA〈213〉人工序列7gatccccagcggtgagtgtcgttctattcaagagatagaacgacactcaccgctttttta60〈210〉8〈211〉61DNA人工序列〈400〉8tcgagtaaaaaagcggtgagtgtcgttctatctcttgaatagaacgacactcaccgctgg60〈210>960〈212〉DNA人工序列9gatccccgggtggcttctacaaggaattcaagagattccttgtagaagccacccttttta60<210〉10〈211〉60<212〉腿〈213〉人工序列〈400〉10agcttaaaaagggtggcttctacaaggaatctcttgaattccttgtagaagccacccggg60〈210〉1160〈2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