重組人促卵泡生長激素的生產方法

2023-12-03 04:40:16 2

專利名稱：重組人促卵泡生長激素的生產方法
技術領域：
本發明涉及基因工程領域。更具體地，本發明提供了一種高效生產重組人促卵泡生長激素(FSH)的方法，包括有關的CHO細胞株的構建、重組人促卵泡生長激素的表達和純化工藝。

背景技術：
重組人促卵泡生成素(FSH)是由腦垂體嗜鹼性細胞分泌進入血液循環的一種多肽激素，該激素與腦垂體分泌的另一激素一一黃體激素(Lnteinzinghormone，LH)，共同作用於女性卵細胞，控制卵細胞的成熟，其中FSH起著關鍵調節作用，是卵泡細胞發育成熟不可缺少的因子。
FSH是由雙鏈形成的多肽糖蛋白，包括α鏈和β鏈，該二條亞鏈由非共價鍵聯結，分別由不同的基因轉錄而來。α鏈含有92個胺基酸，β鏈含有111個胺基酸。α鏈和β鏈在轉錄後都經過糖基化，研究表明，該蛋白質糖基化對其生物活性十分重要，是其發揮活性作用的關鍵。因此，必須採用真核細胞系統表達，該蛋白質才有活性。並且，α鏈和β鏈必須成比例共同表達於一個細胞株內，方能達到完全活性的FSH。
不能釋放卵子是女性不育最常見的原因，佔所有不孕婦女的1/3左右，其主要原因是由於患者在月經中期，下丘腦刺激垂體釋放的促卵泡生成素(FSH)不足或相對不足，從而導致卵巢不能產生成熟的卵子或不能引起排卵。促卵泡生成素(FSH)是第一種用於治療這類不孕症的生物藥，目前應用中主要有人基因重組FSH(r-FSH)與高純度人尿PSH(u-FSH-HP)，u-FSH-HP是由絕經期婦女尿液中提取的，純度達95％，但仍含有殘留尿液中的具有蛋白性質的成分，這些成分可抑制FSH的作用。rh-FSH是近年來應用基因工程技術人工合成的純度達100％的FSH製劑。u-FSH-HP與rh-FSH不僅在來源上不同，而且在結構上也不完全相同，如它們的寡糖分子結構不同，免疫反應生物活性不同，rh-FSH比u-FSH-HP的鹼性形式多，酸性形式少，前者對受體的親和力更強，自身的生物活性也更。鹼性形式在誘導卵泡生長中起重要作用，在自然月經周期中，月經中期FSH的鹼性形式較多，說明rh-FSH更接近天然FSH，具有更高的生物活性。由於尿促性腺激素生物活性存在20％的內變異，751U的u-FSH可能含有60~90IU的變異，說明u-FSH活性不如rh-FSH穩定。
因此，迫切需要開發高效生產重組人FSH的方法，本發明採用了CHO(dhfr-)表達系統表達FSH，通過對人FSH基因的優化，構建含有優化的人FSH基因的表達載體，並獲得了高水平的表達細胞株；通過控制培養條件，達到了較高蛋白表達率；在此基礎上對表達的rh-FSH的純化進行了大量的摸索和研究後，得到了高純度、高得率、可供動物實驗的rh-FSH蛋白。


發明內容
本發明的目的就是提供一種高效和/或簡便的生產重組人促卵泡生長激素的方法。
本發明的另一目的就是提供優化的重組人促卵泡生長激素的胺基酸序列和用於該方法的表達載體及工程細胞。
在本發明的第一方面，就是提供了一種優化的編碼重組促卵泡生長激素的胺基酸序列，其特徵在於，所述的胺基酸序列為SEQ ID NO2所示的胺基酸序列。
在另一優選例中，所述的編碼SEQ ID NO2所示的胺基酸序列的核苷酸序列為SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
在本發明的第二方面，提供了一種表達載體，含有權利要求1所述的核苷酸序列。
在另一優選例中，所述的表達載體是pET30a(+)/FSH。
在本發明的第三方面，提供了一種工程細胞，其特徵在於，含有權利要求2所述的表達載體。
在另一優選例中，所述的工程細胞是CHO(dhfr-)，是二氫葉酸還原酶的基因缺陷細胞株，非常適合外源基因的高效表達。
在本發明的第四方面，提供了一種生產重組人促卵泡生長激素的方法，該方法包括步驟 a)在適合的表達條件下，培養如權利要求4所述的宿主細胞，從而表 達出人促卵泡生長激素；較佳地，所述的宿主細胞是CHO(dhfr-)。
b)分離純化出表達的人促卵泡生長激素。
在本發明的另一優選例中，所述的步驟(a)的培養條件包括 培養分為有血清培養階段和無血清階段，有血清培養階段細胞進行擴增達到一定密度後，更換無血清培養基進行表達，灌注培養收集培養上清。培養溫度保持在37℃，pH值控制在7.0±0.2，攪拌速度80rpm，溶氧(DO)50％。
在本發明的另一優選例中，誘導過程還可以添加酵母提取物(YE)、蛋白腖(peptone)等作為保護劑。
在本發明的另一優選例中，所述的步驟(b)包括步驟 i)對培養上清通過離心和/或過濾方式去除殘留細胞及碎片，獲得上清； ii)層析純化，所述的層析選自凝膠過濾層析、陰離子交換層析、陽離子交換層析及其組合。
在本發明的另一優選例中，上清經凝膠過濾層析、Q Sepharose F.F.層析、SP-Sepharose F.F.層析、透析復性、濃縮以後得到純度大於98％、得率在20％以上的純品。



圖1.FSH天然序列與FSH優化序列的同源性比較。Query天然FSH基因序列；Sbjct優化的FSH基因序列。
圖2.pET30a(+)/FSH表達質粒的構建路線圖。
圖3.工程細胞的培養過程細胞生長和目的蛋白表達曲線。
圖4.SP-Sepharose FF純化電泳圖。1.Marker，2.透析上清，3.SP-Sepharose FF離子交換層析穿透液，4-9.SP-Sepharose FF收集液。
圖5.15％SDS-PAGE電泳檢測純化過程目的蛋白的純度及含量。

具體實施例方式 本發明人通過深入而廣泛的研究，通過優化設計人促卵泡生長激素基因編碼序列，將優化後的人促卵泡生長激素編碼序列構建入合適表達載體，轉化宿主細胞，獲得高表達細胞株，並通過優化培養、純化工藝，實現了人促卵泡生長激素高效表達，並且表達出的人促卵泡生長激素保持生物學活性。在此基礎上完成了本發明。
本發明根據人促卵泡生長激素天然胺基酸序列，按密碼子偏愛性，在不改變胺基酸序列的條件下，優化其核苷酸序列，全基因合成經優化的重組人促卵泡生長激素蛋白的目的基因序列，將該基因克隆到pET3(+)中測序驗證後，用分子克隆的常規方法，構建表達載體，轉入CHO細胞(dhfr-)，通過dhfr+/-篩選出表達工程細胞，增加MTX壓力篩選獲得高表達工程細胞。6孔板中試驗表明，rh-FSH比表達可達4ug/106cells/day。
在獲得工程細胞後，便可在適合的條件下進行培養。在本發明中，工程細胞表達重組人促卵泡生長激素的培養條件沒有特別限制。可以採用本領域常規的培養條件。例如，合適的培養基包括(但不限於)以下組成 (i)氮源含有機氮源和無機氮源，有機氮源包括血清等，無機氮源包括胺基酸等。
(ii)碳源為葡萄糖，是單一碳源。較佳的，有血清培養中葡萄糖濃度為4.5g/L，無血清培養階段葡萄糖濃度為7g/L。
為大規模獲得重組人促卵泡生長激素，需要在反應器中進行表達培養。本發明研究了中試培養工藝，優化後的表達水平達到500mg/L。
在培養表達後，對表達的重組人促卵泡生長激素蛋白進行分離。通常，培養樣品先離心獲得上清液後，經凝膠過濾層析、Q Sepharose F.F.層析、SP-sepharose F.F.層析、透析、濃縮等。
經不同層析過程比較，優化的純化方法包括 1.對培養樣品進行離心獲得上清； 2.經凝膠過濾層析、Q Sepharose F.F.層析、SP-sepharose F.F.層析、透析、濃縮，純品純度98％以上，得率約120mg/L培養液。
純品的活性按大鼠重量增長法進行測定，最後以國際標淮品校正活性單位。生物活性檢測目的蛋白比活性達7000IU/mg。
純化後重組人促卵泡生長激素可用常規技術製成各種劑型。
在本發明的一個實例中，構建了生產重組人促卵泡生長激素的CHO表達工程細胞，高水平分泌表達。
在本發明的另一個實例中，經過培養工藝的優化，進一步提高了重組人促卵泡生長激素的表達量。
在本發明的另一個實例中，培養上清經離心收集上清，再經一系列純化步驟後可得到純品120mg/L。
純化後原液加入適當輔料，製成重組人促卵泡生長激素的注射用粉針劑。初步穩定性試驗表明，該粉針劑穩定。
中試研究表明，產品製造工藝穩定，操作簡單，周期短，成本低，每升培養液可獲得重組人促卵泡生長激素純品120mg，適合產業化生產。
本發明的優點在於 (1)選用的是CHO宿主細胞(dhfr-)，通過MTX壓力篩選出高表達工程細胞。
(2)優化後的重組人促卵泡生長激素蛋白基因非常適合在CHO(dhfr-)宿主細胞中表達，具有高表達、高穩定的特點。
(3)通過控制關鍵的培養工藝條件，使表達水平達到500mg/L。
(4)通過純化工藝的優化，每升培養液可獲得120毫克以上、純度大於98％重組人促卵泡生長激素。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不用於限制本發明的範圍。下列實施例中未註明具體條件的實驗方法，通常按照常規條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(NewYorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照製造廠商所建議的條件。
實施例1表達質粒的構建和高表達工程細胞株的獲得 根據人促卵泡生長激素天然胺基酸序列，按密碼子偏愛性，在不改變胺基酸序列的條件下，全基因合成重組人促卵泡生長激素蛋白的目的基因序列(SEQ ID NO1)，該優化的FSH基因序列與天然的FSH基因序列同源性為93％(見圖1)。將該基因克隆到pET-30a(+)中並測序驗證。
表達載體構建方法見圖2。通過PCR擴增得到目的人促卵泡生長激素基因，用Nde I和EcoR I雙酶切分別處理基因IL-4的PCR回收產物和質粒pET30a(+)，酶切後回收相應的片段用T4DNA連接酶在16℃連接過夜。連接產物轉染CHO細胞，在含有卡那黴素的LB平板上挑選抗性陽性的克隆，抽提質粒DNA，並進行質粒酶切鑑定。得到在pET30a(+)中插入了IL-4基因的重組質粒pET30a(+)/IL-4。
將構建好的表達質粒pET30a(+)/IL-4轉化進入已製備好的大腸桿菌BL21(DE3)感受態細胞，塗布含30μg/mL卡那黴素的LB平板，然後在轉化平板上挑取單克隆，用鹼裂解法抽提並檢測質粒。將確證含有表達質粒pET30a(+)/IL-4的單克隆在含30μg/mL卡那黴素的LB平板上保存。
實施例2重組人促卵泡生長激素的表達及表達形式的確定 挑選一株確證好的表達工程細胞CHO/pET30a(+)/FSH，用α-MEM培養基(5％dFBS)進行培養，SDS-PAGE電泳檢測上清是否有目的條帶的出現，並分析其表達量。取一部分培養後的培養液離心，上清SDS-PAGE電泳檢測，確定其表達形式。分析其上清和沉澱，目的蛋白絕大部分在上清中，表明目的蛋白是以分泌形式表達(見圖3)。
實施例3重組人促卵泡生長激素的規模化培養 復甦1支凍存的細胞，接種於1個T-25方瓶中，2-3天後傳代至1個T-75方瓶中，2-3天後傳代至3個T-75方瓶，2-3天後傳代至9個T-75方瓶中，2-3天後傳代至4個轉瓶中，2-3天後接種至2.2L反應器(工作體積1.1L)中，含血清培養基中培養，監測反應器中葡萄糖濃度的變化，待反應器中細胞耗糖量達到4g/天后改為無血清培養基灌注培養，根據細胞耗糖量調節灌流速度，待細胞基本不再消耗葡萄糖時停止培養，收集上清。
實施例4重組人促卵泡生長激素純化 將發酵後的菌體重懸於20mM Tris，pH 8.0，緩衝液，在冰浴下高壓勻漿破菌，離心收集沉澱，再用Tris緩衝液洗滌沉澱，得到包涵體，按1∶10的比例，將包涵體在6M鹽酸胍溶液內變性溶解，變性後的蛋白溶液離心取上清；對含1mM還原型穀胱甘肽和0.1mM氧化型穀胱甘肽的5％蔗糖緩衝液透析，使目的蛋白復性；復性後的上清過SP-Seharose fast flow離子交換層析柱，用0-1M NaCl緩衝液梯度洗脫，分管收集洗脫蛋白峰；SP洗脫峰透析後，過Q-Sepharose fast flow離子交換層析柱，進行濃縮。15％SDS-PAGE電泳檢測純化過程目的蛋白的純度及含量(見圖5)。
經過以上純化工藝，最後可得蛋白純品120mg/L。
實施例5重組人促卵泡生長激素活性測定 以大鼠卵巢增重法檢測rFSH的活性，純化的重組人促卵泡生長激素的活性達7000U/mg。
在本發明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發明的上述講授內容之後，本領域技術人員可以對本發明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落於本申請所附權利要求書所限定的範圍。
序列表
上海新生源醫藥研究有限公司
重組人促卵泡生長激素的生產方法
2
1
498
DNA
人工序列
CDS
(1)..(498)
優化的重組人重組人促卵泡生長激素基因
1
atgagctaca acttgcttgg attcctacaa agaagcagca attttcagtg tcagaagctc 60
ctgtggcaat tgaatgggag gcttgaatac tgcctcaagg acaggatgaa ctttgacatc 120
cctgaggaga ttaagcagct gcagcagttc cagaaggagg acgccgcatt gaccatctat 180
gagatgctcc agaacatctt tgctattttc agacaagatt catctagcac tggctggaat 240
gagactattg ttgagaacct cctggctaat gtctatcatc agattaacca tctgaagaca 300
gtcctggaag aaaaactgga gaaagaagat ttcaccaggg gaaaactcat gagcagtctg 360
cacctgaaaa gatattatgg gaggattctg cattacctga aggccaagga gtacagtcac 420
tgtgcctgga ccattgtcag agtggaaatc ctaaggaact tttacttcat taacagactt 480
acaggttacc tcagaaac 498
2
203
PRT
智人(Homo sapiens)
2
APDVQ DCPEC TLQEN PFFSQ PGAPI LQCMG CCFSR AYPTP LRSKK TMLVQ KNVTS ESTCC VAKSY NRVTV
MGGFK VENHT ACHCS TCYYH KS NSCEL TNITI AIEKE ECRFC ISINT TWCAG CYTRD LVYKD PARPK IQKTC
TFKEL VYETV RVPGC AHHAS LYTYP VATQC HCGKC DSDST DCTVR GLGPS YCSF GEMK E
權利要求
1.一種高表達重組人促卵泡生長激素的工程細胞構建的方法，其特徵在於，它包括步驟
a.獲得優化的重組人促卵泡生長激素的DNA序列；
b.構建合適表達載體；
c.轉化宿主細胞，篩選獲得高表達的工程細胞。
2.如權利要求1所述的一種高表達重組人促卵泡生長激素的工程細胞構建的方法，其特徵在於，步驟(a)中所述的優化的重組人促卵泡生長激素的DNA序列編碼SEQ ID NO2所示的胺基酸序列。較佳地，其為SEQ ID NO1所示的DNA序列。
3.如權利要求1所述的一種高表達重組人促卵泡生長激素的工程細胞構建的方法，其特徵在於，步驟(b)中所述的表達載體含有權利要求1所述的DNA序列。較佳地，所述的表達載體是pET30a(+)/FSH。
4.如權利要求1所述的一種高表達重組人促卵泡生長激素的工程細胞構建的方法，其特徵在於，步驟(c)中所述的工程細胞，含有權利要求3所述的表達載體或權利要求2所述的編碼重組人促卵泡生長激素的DNA序列。較佳地，所述的工程細胞是CHO(dhfr-)。
全文摘要
本發明提供了一種重組人促卵泡生長激素的編碼序列、生產該重組人促卵泡生長激素的方法，以及用於該方法的表達載體和宿主細胞。首次採用了pET系統表達FSH，通過轉染CHO工程細胞，獲得了高水平表達的細胞株；通過控制培養條件，達到了較高蛋白表達率；在此基礎上對分泌表達的重組人促卵泡生長激素的純化進行了大量的摸索和研究後，得到了一套FSH純化方法。用本法，可得到高得率、高純度的重組人促卵泡生長激素，並能滿足臨床需要。本發明可高效、簡便、低成本地獲得重組人促卵泡生長激素純品。
文檔編號C07K14/435GK101298607SQ20071004036
公開日2008年11月5日 申請日期2007年4月30日 優先權日2007年4月30日
發明者黃陽濱, 孫九如, 軍 任, 磊 遊, 朱飛雲 申請人:上海新生源醫藥研究有限公司