多肽膜及方法

2023-12-02 08:13:56

專利名稱：多肽膜及方法
技術領域：
本發明涉及納米工程多肽膜和微膠囊的製備過程及製作這類
膜和微膠囊的方法。更具體地說，本發明涉及將功能性生物大分子封裝 到納米工程多肽微膠囊內。
背景技術：
聚電解質多層膜是由帶相反電荷的聚電解質層交替構成的薄 膜(如幾納米到幾毫米厚)。在合適的基底上通過層疊組裝，可以形成這 種膜。靜電層疊自組裝工藝("ELBL")中，靜電是聚電解質結合的物理 基礎。由於膜表面電荷密度符號在層連續沉積時發生反轉，所以有可能 形成積層膜。帶相反電荷的聚離子的ELBL沉積的一般原理如圖l所示。 鑑於ELBL膜工藝的普遍性和相對簡單的特點，可以將許多不同類型的聚 電解質沉積到許多不同類型的表面上。多肽多層膜屬於聚電解質多層膜， 包含至少一個含帶電多肽的層。多肽多層膜的主要優點是環保。ELBL膜 還可以用於封裝工藝。多肽膜和微膠囊例如應用在納米反應器、生物感 應器、人工細胞和藥物釋放載體等方面。美國專利(公開號20050069950)中最先闡述了將多肽加到 多層膜內的設計原理。簡單來說， 一個多肽是否適用ELBL，與其淨電荷 和長度有關。適於ELBL的多肽最好含有一個或多個胺基酸基元，g卩，長度約5-15個胺基酸殘基並且具有適於靜電沉積用的合適線性電荷密度的
連續胺基酸序列。可以採用不同的方法設計適於ELBL的多肽，如直接將
多個胺基酸序列基元相互連接，或者用接頭將多個胺基酸序列基元連起 來。具有合適長度和電荷特性的多肽可以很容易地通過沉積形成一層或 多層多肽多層膜。蛋白質、肽和寡核苷酸都可能是潛在的治療製劑。但這些生
物分子在體內會受到各種不同降解機制的攻擊。為延長功效或控釋需要， 將生物分子和其他生物活性分子封裝到一個生物相容性環境內，不失為 一種提高靶位點生物活性分子利用度的策略。在被生物分子包覆的基底 上沉積多肽膜，同樣也有可能延長該生物分子的功效，或者實現該分子 的控釋。利用靜電層疊納米組裝工藝製成的聚電解質多層膜和微膠囊的 穩定性高、具有可調控滲透性。因此，仍然需要發明其他方法，將蛋白質等生物活性大分子 直接而有效地留置在生物可降解工程多肽膜和微膠囊內。

發明內容
在一實施例中， 一種制膜方法包括將第一層聚電解質沉積 到基底表面上，形成第一層，然後將第二層聚電解質沉積到第一層聚電 解質上，形成第二層。在高分子沉澱劑存在條件下，將第一層聚電解質 或第二層聚電解質沉積到基底上，或者將這兩層聚電解質都沉積到基底 上，第一層聚電解質和第二層聚電解質的淨電荷極性相反。在另一實施 例中，第一層聚電解質或第二層聚電解質含有，或者這兩層聚電解質都 含有賴氨酸、穀氨酸或其它在中性pH條件下具有帶電側鏈的胺基酸的同 聚多肽。在另一實施例中，第一層聚電解質或第二層聚電解質含有，或 者這兩層聚電解質都含有設計多肽，其中所述設計多肽含有一個或多個 第一胺基酸序列基元，所述一個或多個第一胺基酸序列基元由5-15個氨 基酸殘基組成，每個殘基的淨電荷數量大於或等於0.4;所述設計多肽不是同聚多肽，有至少15個胺基酸殘基長，每個殘基的淨電荷數量大於或等於0.4。
在另一實施例中，在製備聚電解質多層膜過程中改善生物活 性分子功能留置的方法包括將第一層聚電解質沉積到基底表面上，形 成第一層，然後將第二層聚電解質沉積到第一層聚電解質上，形成第二 層。在高分子沉澱劑存在條件下，將第一層聚電解質或第二層聚電解質 沉積到基底上，或者將這兩層聚電解質都沉積到基底上，第一層聚電解 質和第二層聚電解質的淨電荷極性相反；並且，基底含有生物活性分子。
下面通過附圖和詳細說明對上述和其他特徵進行舉例闡述。


現參見附圖所示的典型實施例
圖1是帶相反電荷多肽的組裝體示意圖。
圖2是葡萄糖氧化酶(GOx)被吸附到CaC03或三聚氰胺甲 醛(MF)粒子模板上的吸附力與葡萄糖氧化酶濃度和NaCl濃度的函數 關係圖。
圖3表示在不含高分子沉澱劑、含40% PEG300和含50% PEG300條件下，聚(L-賴氨酸)/聚(L-穀氨酸)(PLL/PLGA)封裝膜的 沉積過程中CaC03模板上所吸附GOx的損失與因洗滌液、聚(L-賴氨酸) (PLL)組裝緩衝液和聚(L-穀氨酸)(PLGA)組裝緩衝液中含有釋放出 的GOx而在280nm處產生的吸光度的函數關係圖。
圖4表示沉積溶液中含或不含50% PEG 300時，PLL/PLGA 封裝膜沉積過程中GOx在CaC03模板上的留置情況。
圖5是用分光光度法測定多肽微膠囊內GOx活性的反應示意圖。
圖6是被封裝的GOx的活性測定值與多肽層數的函數關係圖。
圖7表示(a)模板溶解後微膠囊的共焦顯微圖像。左螢光， 右亮視場；(b)膠囊的螢光密度圖。左負載膠囊，右模板溶解前 被包覆在內的核。
具體實施方式
本發明涉及聚電解質多層膜，尤其涉及一種製備聚電解質多 層膜的新方法。在一實施例中，聚電解質多層膜含有生物活性分子。在 另一實施例中，該膜含有一個或多個多肽層。
本文中，"層"是指厚度增加體，例如經過吸附步驟後基底上 方厚度增加，形成膜。"多層"是指多個(即兩個或兩個以上)厚度增加 體。"聚電解質多層膜"是指包含一個或多個由聚電解質構成的厚度增加 體的膜。多層膜的各個層在沉積之後可能不再是離散的獨立層。事實上， 厚度增加體相互間，尤其是兩個厚度增加體界面之間的物質可能會有明 顯混合。
"聚電解質"包括分子量大於l，OOO、每分子至少帶5個電荷 的聚陽離子或聚陰離子材料。合適的聚陽離子材料例如包括聚胺。聚胺 例如包括多肽、聚乙烯胺、聚(氨基苯乙烯)、聚(氨基丙烯酸酯)、聚 (N-甲基氨基丙烯酸酯)、聚(N-乙基氨基丙烯酸酯)、聚(N，N-二甲基 氨基丙烯酸酯)、聚(N,N-二乙基氨基丙烯酸酯)、聚(氨基甲基丙烯酸 酯)、聚(N-甲基氨基-甲基丙烯酸酯)、聚(N-乙基氨基甲基丙烯酸酯)、 聚(N，N-二甲基氨基甲基丙烯酸酯)、聚(N,N-二乙基氨基甲基丙烯酸酯)、 聚(乙烯亞胺)、聚(二烯丙基二甲基氯化銨)、聚(N,N,N-三甲基氨基 丙烯酸酯氯化物)、聚(甲基丙烯醯胺丙基三甲基氯化銨)、幾丁質和包 含前述至少一種或多種聚陽離子材料的組合。合適的聚陰離子材料例如 包括多肽、核酸、海藻酸、卡拉膠、帚叉藻膠、果膠、黃原膠、透明質 酸、肝素、硫酸肝素、硫酸軟骨素、硫酸皮膚素、硫酸葡聚糖、聚(甲 基)丙烯酸、氧化纖維素、羧甲基纖維素、酸性多糖和交聯羧甲基纖維素、含有側鏈羧基的合成聚合物和共聚物，以及包含前述至少一種或多 種聚陰離子材料的組合。"胺基酸"是指多肽的結構單位。本文中，"胺基酸"包括20 種常見的天然存在的L-胺基酸、其它所有天然胺基酸、所有非天然氨基
酸和所有類胺基酸，如類肽(peptoid)。"天然存在的胺基酸"是指20種常見的天然L-胺基酸，即甘
氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨 酸、甲硫氨酸、天冬氨酸、天冬醯胺、穀氨酸、穀氨醯胺、精氨酸、賴 氨酸、組氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和脯氨酸。"非天然胺基酸"是指除20種常見天然L-胺基酸之外的氨基 酸。非天然胺基酸可以是L-型或D-型。"類肽"或N-取代的甘氨酸是指相應胺基酸單體的類似物，
與相應胺基酸的側鏈相同，但側鏈是與氮基的氮原子相連，而不是與該
殘基的a碳原子相連。所以，聚類肽單體間的化學鍵不是肽鍵，可用來
限制蛋白質水解。"胺基酸序列"和"序列"是指有至少兩個胺基酸長的多肽 鏈的連續長度。"殘基"是指多聚體或寡聚體中的胺基酸；它是可形成多聚 體的胺基酸單體的殘基。多肽合成涉及脫水反應，也就是說，肽鏈上每 增加一個胺基酸會失去一個水分子。"胺基酸序列基元"是指含有n個殘基的連續胺基酸序列，n 是5-15。在一實施例中，胺基酸序列基元中每個殘基的淨電荷數量大於 或等於0.4。在另一實施例中，胺基酸序列基元中每個殘基的淨電荷數量 大於或等於0.5。本文中，淨電荷數量是指淨電荷的絕對值，也就是說， 所述淨電荷可以是正電荷，也可以是負電荷。"設計出的多肽"(以下簡稱"設計多肽")是指含有一個或 多個胺基酸序列基元的多肽，該多肽有至少15個胺基酸長，pH7.0時，相同極性的帶電殘基和與其極性相反的殘基的數量差與多肽中殘基總數 的比值大於或等於0.4。換句話說，多肽中每個殘基的淨電荷數量大於或
等於0.4。在一實施例中，pH7.0時，相同極性的帶電殘基和與其極性相 反的殘基的數量差與多肽中殘基總數的比值大於或等於0.5。換句話說， 多肽中每個殘基的淨電荷數量大於或等於0.5。雖然多肽長度沒有絕對上 限，但總的來說，適於ELBL沉積的設計多肽的實際長度上限為1,000個 殘基。"—級結構"是指多肽鏈中連續的線性胺基酸序列，"二級結 構"是指多肽鏈中基本上規則的結構類型，通過非共價相互作用(通常 為氫鍵)保持穩定。二級結構例如包括oi-螺旋、P-摺疊和P-轉角。"多肽多層膜"是指含有上述一條或多條設計多肽的膜。例 如，多肽多層膜包括含設計多肽的第一層和含帶有極性與該設計多肽相 反的淨電荷的聚電解質的第二層。例如，如果第一層的淨電荷為負電荷， 則第二層的淨電荷為正電荷。第二層含有另一種設計多肽或另一種聚電 解質。"基底"是指一種固體材料，具有適於吸附水溶液中聚電解 質的表面。基底表面基本上可以是平面、球形、棒狀等任何形狀。基底 表面可以是規則或不規則的面。基底可以是晶體，可以是生物活性分子， 其尺寸從納米級到宏觀級大小不等。另外，基底中也可以含一些微小的 亞粒子。基底可以由有機材料、無機材料、生物活性材料或這些材料的 組合製成。基底例如包括但不限於矽晶片；CaC03微粒或三聚氰胺甲醛微 粒等帶電膠體粒子；紅細胞、肝細胞、細菌細胞或酵母細胞等生物細胞； 聚苯乙烯或苯乙烯共聚物等有機聚合物點陣結構體(polymer lattice);脂 質體；細胞器和病毒。在一實施例中，基底是人工起搏器、人工耳蝸或 支架等醫療器械。如果在膜形成期間或形成之後，將基底分離，或用其它方式 去除，這時候將基底稱為"模板"(用於膜的形成)。模板粒子可以用合 適的溶劑溶解或加熱去除。舉例來說，如果使用部分交聯的三聚氰胺甲醛模板粒子，可以用較為溫和的化學方法，如使用DMSO或改變pH值 來溶解模板。模板粒子溶解後，留下由聚電解質層交替構成的中空多層 夕卜殼。"微膠囊"是指呈中空外殼或包覆核心的塗層形式的聚電解 質膜。所述核心含有各種不同的膠囊填充劑，如蛋白質、藥物或其組合。"生物活性分子"是指有生物學效應的分子、大分子或大分 子組裝體。利用合適的試驗，並經每單位重量或每分子標準化後，可以 測出生物活性分子的特定生物學效應。可以將生物活性分子裝入膠囊、 固定在後面或者置於聚電解質膜內。生物活性分子例如包括但不限於藥 物、藥物晶體、蛋白質、蛋白質功能片段、複合蛋白、脂蛋白、寡肽、 寡核苷酸、核酸、核糖體、活性治療劑、磷脂、多糖、脂多糖。本文中， "生物活性分子"進一步包括有生物活性的結構組成，如功能性膜碎片、 膜結構組成、病毒、病原體、細胞、細胞團和細胞器。能被封裝在膠囊 內或固定在多肽膜後面的蛋白質例如有血紅球蛋白；葡萄糖氧化酶、脲 酶和溶菌酶等酶；纖維連接蛋白、層粘蛋白、玻連蛋白和膠原蛋白等胞 外基質蛋白；以及抗體。能被封裝在膠囊內或固定在多肽膜後面的細胞 例如包括移植胰島細胞、真核細胞、細菌細胞、植物細胞和酵母細胞。"生物相容性"是指經口服、局部給藥、透皮給藥、皮下注 射、肌內注射、吸入、植入或靜脈內注射後不會對健康產生實質性的不 良影響。例如，生物相容性膜包括那些與免疫系統(如人的免疫系統) 接觸後不會引起實質性免疫應答的膜。"免疫應答"是指細胞或體液免疫系統對體內任何部位出現 的物質所產生的反應。免疫應答可以表現為很多方式，如血流中識別某 種抗原的抗體數量增加。抗體是由B細胞分泌的蛋白質，而抗原是誘導 產生免疫應答的物體。人體通過增加血流或其它部位的抗體數量來抵抗 感染和抑制再感染。
"表位"和"抗原決定簇"可互換使用，是指被抗體識別的 抗原(如蛋白質或設計肽)的結構或序列。表位通常位於蛋白質表面。"連 續表位"是指表位中包括的若干胺基酸殘基相互連接、而不是在摺疊蛋 白中碰巧接觸或處於有限的空間區域內。"高分子沉澱劑"是指一種化學物質，如可溶性聚合物，它 能影響生物活性分子的溶解性。在一實施例中，高分子沉澱劑是指一種 能降低模板上吸附的生物活性分子水溶性和/或降低模板上制膜所用的聚 電解質的水溶性聚合物。水溶液中，高分子沉澱劑能將外部包覆生物活 性分子的模板表面的溶劑水分子吸走，所以在聚電解質膜組裝工藝中能 增加留置在模板上的生物活性分子的量。改變跨膠囊壁滲透壓梯度，使 膠囊模板分解時，這種高分子沉澱劑還有助於保持膠囊的穩定性。高分子沉澱劑例如有聚乙二醇(PEG)、聚(丙烯酸)鈉鹽、 聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯垸酮、聚丙二醇(PPG)、 二乙氨基乙基葡
聚糖和聚乙烯亞胺(PEI)，以及前述一種或多種高分子沉澱劑的組合。
高分子沉澱劑的優選分子量因不同聚合物而異。 一定要注意，分子量是 決定高分子聚合物溶解性的關鍵因素，分子量越高，其可溶性越低。上
面某些用作生物大分子高分子沉澱劑的聚合物所實際使用的分子量為
PPG425 Da、 PVA5，000Da、 PEI 40-60 kDa。從科學文獻中很容易查閱到 有關這些聚合物溶解性的詳細內容。本發明的一個方面是提供一種製備多層膜的方法。該方法包 括在基底上沉積多個帶相反電荷的聚電解質層。沉積這些帶相反電荷 的聚電解質層時，至少有一層的沉積過程中使用了高分子沉澱劑。某些 實施例中沉積過程採用層疊組裝(LBL)工藝完成。依次沉積的各個層帶 有不同符號的淨電荷。在一實施例中， 一個或多個層含有設計多肽。在 另一實施例中，帶不同電荷的多肽中，至少有一條多肽含有同聚多肽， 如聚(L-賴氨酸)或聚(L-穀氨酸)。適於靜電層疊沉積工藝用的多肽的設計原理在美國專利(公 開號2005/0069950)有所記載，該文通過引用併入本文。簡單說來，設計時首先要考慮多肽的長度和電荷。靜電是多肽設計時需要考慮的最重 要因素，因為它是ELBL的基礎。如果一個多肽的電荷特性不合適，那麼
它在pH4-10時基本上不溶於水溶液，所以不能很容易地通過ELBL工藝 製備多層膜。其他考慮因素包括多肽的物理結構、由多肽形成的膜的物 理穩定性，以及膜與組成該膜的多肽之間的生物相容性和生物活性。如上所述，設計多肽是指包含一個或多個胺基酸序列基元的 多肽，其中，所述多肽有至少15個胺基酸殘基長，pH7.0時，多肽中每 個殘基的淨電荷數量大於或等於0.4。"胺基酸序列基元"是指含n個氨 基酸殘基的連續胺基酸序列，其中n是5-15。 pH7.0時，天然存在的正電 荷胺基酸(鹼性)是Arg、 His和Lys，天然存在的負電荷胺基酸(酸性) 是Glu和Asp。使用的胺基酸基元中可以包含帶相反電荷的混合胺基酸殘 基，只要整個電荷比例滿足以上規定的標準即可。在一實施例中，設計 多肽不是同聚多肽。在一典型實施例中，胺基酸序列基元含7個胺基酸。對長7 個胺基酸的基元來說，含4個帶電胺基酸是較為合適的最低限度，因為 少於4個電荷，肽的可溶性和對ELBL工藝的控制能力會降低。而且，關 於生物相容性，基因組數據中述及的各胺基酸序列基元都比7個胺基酸 長，足以構成連續表位，但並沒有長到基本上與蛋白質表面和其內部的 殘基相對應。所以，胺基酸序列基元的電荷和長度有助於確保基因組數 據中提到的序列基元可能出現在該序列基元所來源的摺疊蛋白表面上。 相反，非常短的序列基元在機體看來有可能是隨機序列，或者是非特定 "自體"的隨機序列，從而會誘導免疫應答。某些情況下，設計胺基酸序列基元和設計多肽時，需要考慮 形成二級結構尤其是a-螺旋或P-摺疊的傾向性。某些實施例中，最好能 控制水介質中設計多肽形成二級結構的可能性，如最大程度降低這種可 能性，以便儘可能地控制薄膜層形成工藝。首先，序列基元最好比較短， 約5-15個氮基酸殘基，因為長基元在溶液中更有可能形成穩定的三維結 構。第二，設計多肽中共價連接相鄰胺基酸序列基元的接頭，如甘氨酸或脯氨酸殘基，會降低多肽在水溶液中形成二級結構的傾向。例如，甘 氨酸的a-螺旋和(3-摺疊傾向性很低，非常不利於甘氨酸和其相鄰胺基酸
在水溶液中形成規則二級結構。第三，選擇a-螺旋總體傾向性小於7.5、 卩-摺疊總體傾向性小於8的胺基酸序列基元，可將設計多肽本身的cc-螺旋 和P-摺疊傾向性降到最低。"總體"傾向性是指基元中所有胺基酸的a-螺旋或(3-摺疊的傾向性總和。a-螺旋和/或(3-摺疊的總體傾向性稍高的氨 基酸序列基元適用於ELBL工藝，尤其是由Gly或Pro等接頭連接時更是 如此。某些應用中，如果作為薄膜製備中的特定設計特徵，多肽形成二 級結構的傾向可以較高。用Chou和Fasman法(參見P. Chou and G. Fasman Biochemistry 13:211 (1974)，其整體通過引用併入本文)可以計算出所有 20種天然存在的胺基酸的二級結構傾向性。另一考慮因素是多肽ELBL膜的穩定性控制。離子鍵、氫鍵、 範德華力和憎水作用都有助於多層膜的穩定性。另外，同一層內或相鄰 層中多肽的含巰基胺基酸之間形成的共價二硫鍵可以增加結構強度。含 巰基的胺基酸包括半胱氨酸和同型半胱氨酸。另外，可以往(3-胺基酸中 加入巰基，如D，L-(3-氨基-P-環己基丙酸、D，L-3-氨基丁酸或5-(甲基硫 代)-3-氨基戊酸。使用含巰基的胺基酸，通過改變氧化電位，可以將多肽 多層膜各層"鎖住"(結合在一起)和"脫離"。另外，設計多肽中序列 基元中加入含巰基的胺基酸後，由於分子內形成二硫鍵，所以可以在薄 膜製備中使用較短的肽。可以使用下面敘述的方法從基元文庫中選取包 括含巰基胺基酸的胺基酸序列基元，或者可以從頭設計。在一實施例中，將無論是化學合成還是宿主體內產生的含巰 基的設計多肽，在含有用於防止二硫鍵過早形成的還原劑條件下，採用 ELBL法進行組裝。然後除去還原劑，再加入氧化劑。氧化劑使巰基之間 形成二硫鍵，將各層內多肽"鎖"在一起，而且存在硫醇基團時還會將 各層之間的多肽"鎖"在一起。合適的還原劑包括二硫蘇糖醇("DTT")、 2-巰基乙醇(2-ME)、還原穀胱甘肽、三(2-甲醯乙基)膦鹽酸鹽(TCEP) 和前述一種以上化學物質的組合。合適的氧化劑包括氧化穀胱甘肽、叔丁基過氧化氫(t-BHP)、硫柳汞、肼、5，5'-二硫代-雙-(2-硝基-安息香酸)
(DTNB)、 4，4'-二硫代二吡啶、溴酸鈉、過氧化氫、連四硫酸鈉、 porphyrindin、鄰碘苯甲酸鈉，及前述一種以上化學物質的組合。生物相容性是生物藥學應用中所考慮的一個因素。這類應用 中，首先利用作為多聚體設計基礎的基因組或蛋白質信息，得到我們需 要的"免疫惰性"多肽。如果生產出的或外覆塗層的物體要與循環血接 觸，則這一方法特別有用。由於胺基酸序列基元的極性較高，所以它們 通常位於其來源蛋白質天然摺疊結構的表面。"表面"是指摺疊蛋白質中 與溶劑接觸或因水的微粒性而難以單獨靠近溶劑的那一部分。已鑑定出 的血液蛋白胺基酸序列基元在血液中總是能與細胞有效接觸。所以，來 源於血液摺疊蛋白質的多肽有免疫原性的可能性低於隨機選擇的序列。 設計多肽一般都有生物相容性，但免疫應答或其它任何類型的生物應答 所達到的程度可能完全取決於序列基元的具體細節。可以用很多方法使膜、塗層或微膠囊具備生物活性。例如， 含設計多肽的膜可以含有功能域。或者，具有多肽薄膜塗層或裝在多肽 薄膜膠囊內的其它生物活性分子也可能有生物活性。在一實施例中，所 述模板包含蛋白晶體等生物活性分子。這裡提到的功能域是指蛋白質中一段有特定生物功能(如結 合磷酸化酪氨酸)的獨立耐熱區域。多結構域蛋白質中可能存在多功能 域，例如，張力蛋白中就包含磷酸酪氨酸結合域和蛋白酪氨酸磷酸酶域。 多層膜內加入的設計多肽中包含功能域，可以使膜具有與特異性配體結 合、體內靶定、生物感應和生物催化等所需功能。生物活性分子可以是蛋白質，蛋白質功能片段，非設計多肽 構成部分的蛋白質功能片段、複合蛋白、寡肽、寡核苷酸、核酸、核糖 體、活性治療劑、磷脂、多糖、脂多糖、功能性膜碎片、膜結構組成、 病毒、病原體、細胞、細胞團、細胞器、脂、碳水化合物、藥物或抗菌 劑。生物活性分子可以是規則排列的結晶型或無定形。所述蛋白質可以 是酶或抗體。所述基底可以包含這類生物活性分子。在一實施例中，在帶相反電荷的各多肽層沉積前，基底表面含有生物活性分子。在另一實 施例中，基底是含生物活性分子的晶體。在一實施例中，胺基酸序列基元採用從頭設計。在另一實施 例中，胺基酸序列基元選自特定生物的基因組或蛋白質組信息，如人的
基因組。例如，可以利用補體C3 (gi|68766)或乳轉鐵蛋白(gi|4505043) 的一級結構，從人血液蛋白中檢索胺基酸序列基元。鑑定多肽內第一個胺基酸序列基元的方法包含選擇多肽的 起始胺基酸殘基；檢査多肽內含該起始胺基酸殘基和後面n - 1個(即n 減l)胺基酸殘基的胺基酸序列中存在的正電荷和負電荷，其中n是5-15; 如果pH7.0時，這5-15個胺基酸殘基側鏈的淨電荷大於或等於0.4xn，則 將這些胺基酸殘基確定為胺基酸序列基元；或者，如果pH7.0時，這5-15 個胺基酸殘基側鏈的淨電荷小於0.4xn，則捨棄該序列。下面敘述在一實施例中從胺基酸序列數據中檢索含n個氨基 酸、僅包含中性或負電荷胺基酸的負電荷胺基酸序列基元的方法。第一 步，從蛋白質序列中選擇起始胺基酸殘基。第二步，檢査起始胺基酸殘 基和後面n-l個胺基酸殘基中是否含有精氨酸、組氨酸或賴氨酸(中性 pH時，這三種天然存在的胺基酸可能帶正電荷)，其中n是5-15。第三 步，如果發現這n個胺基酸殘基中有一個或多個精氨酸、組氨酸或賴氨 酸，則從第二個胺基酸殘基重新開始上述步驟。但如果這n個胺基酸中 不含精氨酸、組氨酸或賴氨酸，則檢査並確定n個胺基酸殘基中穀氨酸 (Glu)和/或天冬氨酸(Asp)(中性pH時這兩個胺基酸帶負電荷)出現 的數量。第四步，如果這n個殘基中有至少0.4xn個Glu禾n/或Asp，則將 該序列歸類為負電荷胺基酸序列基元。但如果發現負電荷胺基酸數量少 於0.4xn個，則捨棄從第一個胺基酸殘基開始的序列，然後再重新開始以 上步驟，例如，立即從與第一個胺基酸殘基相鄰的第二個胺基酸殘基開 始以上步驟。將基元歸好類後，再從第二個胺基酸殘基開始，重複以上 步驟。
鑑定正電荷序列基元的方法大致是從蛋白序列數據中檢索僅 含中性或正電荷胺基酸、n個胺基酸長而且中性pH時這些胺基酸殘基側 鏈的淨電荷數量大於或等於0.4xn的胺基酸序列。鑑定含n個胺基酸、允許同時存在正電荷和負電荷胺基酸殘 基的負電荷胺基酸序列基元或正電荷胺基酸序列基元的方法也差不多類
似。例如，鑑定含n個胺基酸的正電荷胺基酸序列基元的步驟也是從多 肽中選擇起始胺基酸殘基。然後，檢査該胺基酸殘基和後面n- l個氨基 酸殘基中是否有pH7時帶正電荷或負電荷的殘基。確定這n個胺基酸殘 基側鏈的淨電荷數。如果淨電荷的絕對值小於0.4xn，則捨棄該序列，從 另一個胺基酸重新開始檢索。但如果淨電荷的絕對值大於或等於0.4xn， 則該序列為一個胺基酸序列基元。若淨電荷大於0，該基元為正電荷基元， 若小於O，該基元為負電荷基元。本文述及的胺基酸序列基元的從頭設計方法與上面的原理大 體相同，不同在於設計用的序列並不限於天然發現的序列。首先，選 擇基元長度n和所需的淨電荷符號和數量。然後，選定n個能作為氨基 酸序列基元而得到所需電荷符號和數量的胺基酸，這n個胺基酸的淨電 荷絕對值大於或等於0.4xn。從頭設計胺基酸序列基元的潛在優點是，操 作者可以從所有胺基酸(20種天然存在的和所有非天然的胺基酸)中挑 選以獲取所需的淨電荷，而不僅限於特定已知胺基酸序列中發現的那些 胺基酸。與從基因組序列中鑑定胺基酸基元相比，大型胺基酸池擴大了 基元序列設計時可供選擇的物理、化學和/或生物學特徵的潛在範圍。本文所述的設計多肽包含一個或多個胺基酸序列基元。設計 用於ELBL工藝的多肽時，可以重複同一基元，或者將不同基元連在一起。 在一實施例中，胺基酸序列基元之間共價連接，無插入序列。在另一實 施例中，設計多肽包含兩個或兩個以上由接頭共價連接的胺基酸序列基 元。該接頭可以是胺基酸型接頭，如一個或多個胺基酸殘基，如賴氨酸 或脯氨酸，或者可以是適於共價連接兩個胺基酸序列基元的其它任何化 合物。在一實施例中，接頭包含l-4個胺基酸，如l-4個賴氨酸和/或脯氨酸殘基。該接頭包含合適的長度或組成，使設計多肽中每個殘基的淨電 荷數量大於或等於0.4。在一實施例中，設計多肽的長度大於或等於15個胺基酸殘基。
在其它實施例中，設計多肽的長度大於18、 20、 25、 30、 32或35個氨 基酸。實際使用的多肽長度上限為1,000個殘基。胺基酸序列基元被選出或從頭設計後，即可利用本領域熟知 的方法，如固相合成和F-moc化學合成法，或者通過基因克隆、轉化及 細菌異源表達的方法，合成帶有胺基酸型接頭的設計多肽。可以委託肽 合成公司如SynPep公司(Dublin, California),在實驗室內用肽合成器合 成，或者採用重組DNA的方法合成。任何新型開發的肽合成法可能會增 加肽的產量，但對本文所述的肽設計方法應該不會有實質性改變。製備聚電解質多層膜的方法包含將多個帶相反電荷的聚電 解質層沉積到基底上，其中至少一個層含有設計多肽。在一實施例中， 至少一種聚電解質含有多肽，如一種帶電荷的同聚多肽或一種設計多肽。 依次沉積的聚電解質的淨電荷相反。圖1是ELBL沉積過程的示意圖。在 一實施例中，設計多肽(或其它聚電解質)的沉積過程包括將基底暴露 在水溶液中，水溶液中含有設計多肽(或其它聚電解質)，其pH值使設 計多肽帶有適於進行ELBL工藝的淨電荷。在另一實施例中，將設計多肽 或其它聚電解質沉積到基底上的方法是將帶有相反電荷的多肽溶液先後 噴塗到基底上。在其它實施例中，沉積到基底上的方法是將帶有相反電 荷的多肽溶液同時噴塗到基底上。在形成多層膜的ELBL方法中，相鄰層的相反電荷能驅動組裝 發生。其關鍵因素不是相對層中聚電解質的淨線性電荷密度相同，而是 相對層帶有相反電荷。 一種用於沉積的標準膜組裝程序包括在能使聚 電解質以離子形式存在的pH值(即pH4-10)條件下，形成聚電解質水 溶液，然後選用帶有表面電荷的基底，最後將基底交替浸入帶電荷的聚 電解質溶液內。視情況可以在各層交替沉積步驟之間洗滌基底。
本領域普通技術人員可以很容易地確定適於聚電解質沉積的
聚電解質濃度。典型的濃度為0.1-10mg/mL。 一般來說，制出的層厚基本
上不受沉積過程中所述範圍內聚電解質溶液濃度的影響。對於典型的非
多肽聚電解質如聚(丙烯酸)和聚(烯丙胺鹽酸鹽)，層厚通常約3-5A， 具體視溶液離子強度而定。較短的聚電解質通常比較長的電解質形成的 層薄。聚電解質膜的厚度與溼度、層數和膜組成有關。例如，50nm厚的 PLL/PLGA膜經氮氣乾燥後收縮到1.6nm。 一般來說，可以形成l-100nm 或更厚的膜，具體取決於膜的水合狀態和組裝體中所用聚電解質的分子另外，形成穩定聚電解質多層膜所需的層數取決於膜內的聚 電解質。對僅含有低分子量多肽層的膜來說，通常要有4個或4個以上 帶相反電荷的多肽雙層。而對於含高分子量聚電解質如聚(丙烯酸)和 聚(烯丙胺鹽酸鹽)的膜來說，含一個帶相反電荷聚電解質的雙層就可 以保持穩定。如本文所述，在含有高分子沉澱劑，通常在pH4-10的水溶液 中，將一種或多種聚電解質沉積到基底上。使用高分子沉澱劑的一個優 點例如是，能最大程度的減少多層膜內所含生物活性分子的損失。對於所給定的整個沉積條件，可以選擇具特定分子量的高分 子沉澱劑的用量，使模板吸附的生物活性分子的損失儘可能減少，同時 不影響適合特定沉積工藝的沉積溶液粘度。 一般來說，高分子沉澱劑的 合適濃度依沉澱劑的分子結構及其分子量而定。通常，高分子沉澱劑的 濃度越高，大分子的可溶性越低。高分子沉澱劑實際使用的具有代表性 的濃度值可列舉如下對於分子量3500-4000 Da的PEG、分子量425 Da 的PPG、分子量5000 Da的PVA和分子量40-60 kDa的PEI，其使用濃度 為5-15重量％。 300 Da的PEG的可溶性要遠遠地高於3500-4000 Da的 PEG，前一PEG在水溶液中的溶解度達到約50重量％。特定沉澱劑能夠 發揮效用的濃度上限會隨共沉澱劑濃度增加而降低。例如，如果同時含 有PVA， PEG 300的有效濃度會有所降低。如果含高分子沉澱劑和肽的溶液過於粘稠，則無法很好地控制溶液的噴塗操作。對於LBL方法，粘度 能影響沉積溶液中聚電解質的擴散速度。可以權衡任何一整套特定沉積 條件對所吸附生物活性分子的留置和對沉積溶液粘度的影響，以此確定 其他聚合物用作高分子沉澱劑的濃度和分子量。以PEG作高分子沉澱劑為例，在使溶液保持液態的整個溫度
範圍內(對純水來說，約latm氣壓下，標稱溫度約0-10(TC)，溶液中 PEG300濃度可以達到約50% (v/v)。當溶液中含有沉澱劑而且生物活性 分子的功能活性不會發生非可逆失活時，溫度範圍可以稍微再寬些。要 確定能夠在這些方法中、在整個給定沉積條件下發揮作用的特定分子量 PEG的濃度，至少一定程度上應根據該濃度是否維持適當的溶液粘度而 定。在一實施例中，多層膜或微膠囊中含有生物活性分子。在一 實施例中，將生物活性分子與一個或多個聚電解質層進行共沉積。在另 一實施例中，基底含有生物活性分子，例如，基底可以是含有液態或結 晶生物活性分子的模板，如藥物或蛋白質。在另一實施例中，生物活性 分子包覆在基底外部。例如，在進行聚電解質層沉積前，先將生物活性 分子包覆在惰性核如CaC03粒子外部。聚電解質沉積完後可以除去CaC03 粒子，形成含有生物活性分子的中空微膠囊。 —實施例中，在制膜時，高分子沉澱劑有助於聚電解質的沉 積，能降低所吸附生物活性分子的可溶性，從而增加被封裝材料的量。 在根據經驗確定所用高分子沉澱劑的合適濃度時，可以使用一種合適的 分析法來測定生物活性分子從模板上脫離的損失。例如，可以用螢光基 團如螢光素或CY3、螢光菁藍化合物(Amersham Biosciences),或者用 具有吸附光譜特徵的基團如酪氨酸標記生物活性分子。利用試驗方法確 定附著在模板上的螢光或吸收量，以此評價含或不含特定濃度的給定高 分子沉澱劑時生物活性分子的留置情況。
本發明進一步包括用本發明的方法製備的膜。製備工藝中將 某些高分子沉澱劑加到膜內，是有可能的。某些情況下，這種加入可能 是有益或有用的。另一方面，本發明提供了在製備聚電解質多層膜過程中改善 生物活性分子留置的方法。在某些實施例中，這一方法包括將多個帶 相反電荷的聚電解質層沉積到含有生物活性分子的基底上，其中， 一種 或多種帶相反電荷的聚電解質的沉積過程是在含有高分子沉澱劑的條件 下進行。在一實施例中， 一種或多種聚電解質含有多肽。在另一實施例 中，這一方法包括將生物活性分子吸附到基底上，然後將多個帶相反 電荷的聚電解質層沉積到外面包覆生物活性分子的基底上。 一種或多種 帶相反電荷的聚電解質的沉積過程和/或生物活性分子的吸附過程均在含 有高分子沉澱劑條件下進行。含高分子沉澱劑時沉積一層聚電解質過程 中生物活性分子的留置量與不含高分子沉澱劑相比，至少增加15%、30%、 50%、 67%、 100%或200%。某些實施例中，帶相反電荷的聚電解質的沉積是在水溶液中 通過LBL沉積工藝完成。在另一實施例中，沉積在模板上的帶相反電荷 的聚電解質含有胺基酸序列基元，其中，胺基酸序列基元含有n個氨基 酸，胺基酸基元中相同電荷的電荷平衡值大於或等於0.4xn。在另一實施 例中，帶相反電荷的多肽中，至少一個多肽含有PLL或PLGA。生物活性分子例如是蛋白質、寡肽、核酸、寡核苷酸、月旨、 碳水化合物、藥物、抗菌劑、膜結構組成、細胞、病毒、組織，或其組 合。蛋白質可以是酶。在某些實施例中，酶是葡萄糖氧化酶。某些實施例中，將生物活性分子沉積到模板上。合適的模板 包括有機基底和/或無機基底。模板可以含有一種材料，改變基底或含基 底的溶液的化學或物理特性，可以使這種材料溶解或崩解。例如，某些 實施例中，模板含有CaC03微粒，與EDTA混合後，CaC03微粒能被溶 解。另一實施例中，模板是結晶生物活性分子，如蛋白質或藥物。
本發明的這一方面進一步提供利用這些方法製得的留置生物 活性分子的多肽膜。現用以下非限制性實施例進一步闡述本發明。
實施例l:葡萄糖氧化酶(GOx)吸附到CaC03和MF粒子上考慮到要利用GOx的酶學特性，所以選用GOx作模板蛋白質。 GOx吸附實驗中，將5mgCaC03粒子(德國PlasmChem GmbH公司)或 三聚氰胺甲醛(MF)粒子與100 pL、含有來自A m'gw的37,300 U/glI-S 型GOx (美國SIGMA公司)的10mM Tris緩衝液(pH7.4)混合。進行 GOx吸附的溫度為使GOx溶液保持液態的溫度(對純水來說，約l atm 氣壓下，標稱溫度約0-10(TC)，而且該溫度下，GOx的酶活性不會非可 逆失活。粒子終濃度是5% (w/v)。使用Jasco V-430分光光度計(日本)， 280nm，測定液相吸光度，通過吸光度減小，來確定微粒表面對酶的吸附 量。離心，將多肽吸附溶液中負載有GOx的微粒分離出來。粒子吸附量 與進料溶液中GOx濃度和鹽濃度的函數關係如圖2所示。假定粒子體積 為4.6 x 10—"cm3，則負載到CaC03粒子上的GOx最大量約為76 ng/mg 粒子或9.4 x 10—''2克酶/粒子。圖2顯示，在所不沉積條件卜任一模板在 不加單價鹽時的吸附量達到最大。
實施例2:將酶封裝到多肽微膠囊內本例封裝試驗研究中，由於從市場上很容易買到聚(L-賴氨酸) (PLL) (MW約14.6 kDa)和聚(L-穀氨酸)(PLGA) (MW約13.6 kDa)， 所以選用它們作為帶相反電荷的多肽，進行層沉積操作。用設計多肽代 替PLL和/或PLGA進行封裝的過程也基本類似。Li和Haynie (2004) Aowacramo/ecw/^ 5:1667-1670中記載了一對發揮同樣作用的帶相反電荷 肽的例子。
使GOx吸附到CaC03微粒上的操作如下向5mg CaC03微粒 中加入0.10mL5mg/mLGOx溶液，充分混合2小時，1000 x g離心5分 鍾，除去液相。各多肽多層沉積到吸附了 GOx的CaC03微粒上的操作過程包 括4°C、輕微搖動10分鐘，進行自組裝；離心，將粒子與液相中未結 合的肽分開。在4°C ，將O.lmL含lmg/mL PLL(MW約14.6 kDa)或PLGA (MW約13.6kDa)、 10 mM Tris和0.5 M NaCl的溶液(pH7.4)加到微 粒中，充分混合。將PLL層和PLGA層交替沉積到微粒上。多肽溶液中 含有50% (v/v) PEG 300 (Fluka)。如果PEG的平均分子量太高，形成 的溶液相對本例來說，會過於粘稠。繼各多肽吸附、液相與粒子分離步 驟之後，對組裝液上清進行芳烴吸光度分析。PLL和PLGA中不含芳烴 殘基，所以在280nm無吸光度；而GOx可以吸收這個波長的光。在各個 多肽組裝循環之間，用4"C去離子水洗滌兩次。重複這一過程，直到獲得 所需的沉積層數(一般6個雙層)。最後一層多肽組裝完後，漂洗被包覆 的粒子，並離心收集。然後用0.2MEDTA (pH7.4)處理，使粒子核溶 解。溶解過程需要10-20分鐘。2000 xg離心5分鐘，收集微粒，去離子 水漂洗，重懸在0.25mL、 10mMTris緩衝液中。各份樣品的酶活性分析 如下所述。後續實驗用的樣品濃度估測為1.5 x 1S個膠囊/mL。用Cy3 標記的GOx代替GOx，按相同程序進行共焦螢光實驗，如圖7所示。圖3顯示，分別在不含高分子沉澱劑、含40% PEG300和含 50e/。PEG300的緩衝液中組裝時，由於洗滌液、PLL組裝緩衝液和PLGA 組裝緩衝液中含有釋放出來的GOx，所以通過280nm處吸光度來反映在 PLL/PLGA封裝膜的沉積過程中CaC03模板上所吸附GOx的損失。40% 或50%的PEG 300存在時，第一個PLGA層沉積過程中因GOx釋放而產 生的280nm吸光度明顯小於不含PEG300的吸光度。將沉積緩衝液中的 PEG300的濃度從10%增加到50%，結果發現，膜組裝過程中從模板上解 吸附的GOx量減少。
與PEG300相對應的PEG8000濃度所產生的溶液粘度使多肽 層的自組裝過程耗費時間較長。具有室溫下為液體的分子量的PEG,如 PEG300，在用作高分子沉澱劑時，適於在4TM吏用。圖4表示PLL/PLGA封裝膜沉積過程中CaC03模板上GOx的 留置情況。第一個點表示負載在模板上的GOx起始量。後面的點表示後 續肽組裝和離子漂洗步驟中模板上GOx的剩餘量。圖中只表示了兩個沉 積循環過程。所插入小圖中的補充數據表示洗滌液和組裝液上清中GOx 負載模板所釋放出的GOx量。使用以Amplex Red作底物的比色酶聯分析試驗測定GOx的 活性。圖5是表示該試驗的反應圖。葡萄糖和氧氣擴散到膠囊內，被GOx 氧化成葡萄糖醛酸和H202。 11202擴散到膠囊外，然後通過Amplex Red 以間接方式檢測11202。 AmplexRed試劑最開始是無色的，在辣根過氧化 物酶(HRP)存在條件下，被11202氧化成試滷靈(resorufm)，在^ = 563 nm可以測定出試滷靈的吸光度。先配製下述母液用DMSO配製10mM AmplexRed試劑(美國Molecular Probes公司)；50mM磷酸鹽緩衝液(含 0.15MNaCl) (PBS)中含10U/mLHRP; 50 mM PBS中含400mM葡萄糖， 以及50mM PBS中含100 U/mL GOx。將30 jaL Amplex Red、 75 (iL HRP 和450 pL葡萄糖三種溶液混合，製得工作溶液。將100 U/mLGOx母液 稀釋，製備GOx標準溶液，每份500pL，含GOxO-10mU/mL。用50mM PBS緩衝液將膠囊樣品和不含GOx的對照樣品稀釋到500(iL。將40pL AmplexRed/HRP/葡萄糖工作溶液分別加到裝有標準、對照和膠囊樣品的 試管內，開始反應。環境溫度、黑暗中輕微搖動，反應30分鐘。測定試 滷靈在563nm的吸光度。根據GOx已知量對應的活性值，將測定的酶活 性轉換成活性GOx的量。圖6表示利用酶學分析試驗測定出的被封裝活性GOx的量與 多肽層數的函數關係。圖中顯示了模板溶解後，多肽組裝溶液中加入和 未加PEG時留置在膠囊內的材料量。層數少於6的膠囊在溶液中不穩定。 如圖6所示，不含PEG條件下進行多肽組裝時，與微膠囊相關的GOx活性在PLL/PLGA沉積到2個雙層時顯著降低。測定出的活性往往達到恆 定值(例如，多肽沉積前約11%)，這個值在3-6個雙層範圍內不隨層數 而變化。往PLL和PLGA組裝溶液中加入PEG後，由多肽構成的"人工 細胞"的GOx負載量顯著增加。6個雙層沉積完之後，固液相分離前， 有約70%的酶活性留置在細胞內。將含6個雙層的細胞用超聲波處理20 分鐘，其效果與使用PEG類似，酶活性沒有降低。這一結果暗示，用多 肽多層膜封裝GOx，既不會抑制酶活性，也不會阻止小分子(如葡萄糖 (酶底物)和反應產物)通過屏障擴散。GOx進入人工細胞壁的程度尚 未確定。通過以下操作可以確定，所測定的酶活性事實上與人工細胞 相關。用0.22 pm過濾器將有6個雙層的細胞與液相分離後，測定溶液中 GOx的活性。在不含PEG時，沒有檢測到濾液中的GOx活性，但檢測到 人工細胞內的GOx活性。使用PEG時，檢測到部分酶(約1.5 x 10—12g/ 膠囊)。這可能是由於反覆離心和洗滌過程中模板/細胞出現部分裂解所 致。細胞重懸後，沒有在濾液中進一步檢測到活性，表明負載的GOx沒 有被濾除。再用相同方法測定細胞內GOx的留置量。用螢光染料Cy3單活性基NHS-酯(英國Amersham Biosciences)標記GOx以便肉眼觀察GOx負載微粒。將Cy3-GOx吸附 到CaC03微粒上，然後封裝到PLL/PLGA膜內。通過螢光顯微技術研究 層數對人工細胞穩定性的影響，結果表明，少於3個雙層的塗層在粒子 核溶解後往往容易分離，而3個或3個以上雙層通常在水溶液中能穩定 數周。這一結果與本文所述的GOx活性測定值吻合。膜厚與層數直接相 關。利用共焦雷射螢光顯微技術進一步證明Cy3標記的GOx被裝載到含 6個雙層的PLL/PLGA微膠囊內(圖7a，左半塊)。亮視場照明得到的右 半塊顯示，用EDTA處理後，微粒模板完全溶解。含6個雙層的膠囊的 螢光密度剖視圖揭示，微粒內充滿大量不受約束的Cy3標記GOx(圖7b， 左)。細胞直徑與原始模板的直徑近似(圖7b，右)。密度範圍內出現兩個峰，說明一些GOX與細胞"膜"結合，這可能是由靜電引力和耗散現 象引起。運用圓二色譜法進一步證明GOx被封裝到多肽細胞內。
實施例3:將酶封裝到聚電解質微膠囊內另一實施例中，在磷酸鹽緩衝生理鹽水(pH7.0)中將血紅蛋
白負載到碳酸鈣粒子上，然後用非肽類聚電解質封裝。向蛋白質溶液中
加入高分子沉澱劑如40Q/。PEG300，蛋白負載效率增加。用兩種帶相反電 荷的聚電解質，按LBL工藝，對吸附蛋白進行封裝。適合本例用的聚合 物有聚(苯乙烯磺酸酯)、聚陰離子和聚(烯丙胺)、聚陽離子。用分光 光度計在可見光範圍內可以證明蛋白質已被負載由於血紅蛋白含有血 紅素，所以在近410nm處有一個大的吸收譜。本發明提出一種通過往組裝緩衝液中加入高分子沉澱劑，而 將功能性生物活性分子高效留置在納米工程聚電解質膜內的方法。聚電 解質多層膜是半透膜，可以阻止生物分子向外洩漏，但不會阻止小分子 滲透。與LBL工藝製備薄膜時更普遍使用的不能生物降解的合成聚電解 質相比，封裝多肽所固有的生物相容性更有利於在生物醫藥方面應用。本文中"第一"和"第二"等詞不表示任何特定順序，而僅 便於表示例如多個層。除非另外說明，"包含"、"具有"、"包括"和"含 有"等詞均應理解為開放式用語(即意指"包括但不限於")。文中表示 數值範圍的方式僅僅是作為單獨談及落在該範圍內的每個分散數值的簡 略表示法，除非本文另外指明，而且每個分散值就好比文中以一一敘述 的方式被引入本說明書。所有範圍的端點包含在該範圍內，而且可獨立 組合。文中所述所有方法均按合適的順序操作，除非文中另外指明或上 下文清楚地出現不同說法。任一和所有實施例或典型用語(如"例如/如") 僅僅是為了更好地闡述本發明，而非對本發明範圍予以限制，除非另外 要求。說明書中任何語言均不應解釋為將任何未要求權利保護的特徵作 為實施本文所述發明的必要特徵。
雖然參照典型實施例對本發明進行了描述，但本領域技術人 員應當明白，在本發明範圍內可以進行各種改動而且可以將本發明的特 徵用等同特徵替代。另外，根據本發明的教導有可能在本發明的範圍內 進行多種改進以適應特定情況或材料，所以，本發明並非要局限於本文 公開的作為實施本發明最佳模式的特定實施例，而是要包括權利要求範 圍內的所有實施例。本發明涵蓋上述特徵所有可能變化形式的任一組合， 除非本文另外指明或有清楚的相反敘述。
權利要求
1.一種制膜方法，該方法包括將第一層聚電解質沉積到基底表面上，形成第一層；以及將第二層聚電解質沉積到第一層聚電解質上，形成第二層；其中，在高分子沉澱劑存在條件下，將第一層聚電解質或第二層聚電解質沉積到基底上，或者將這兩層聚電解質都沉積到基底上；以及第一層聚電解質和第二層聚電解質的淨電荷極性相反。
2. 根據權利要求1所述的方法，其中，所述第一層聚電解質或第二 層聚電解質含有，或者這兩層聚電解質都含有設計多肽，其中所述設計多肽含有一個或多個第一胺基酸序列基元，所述一個或多 個第一胺基酸序列基元由5-15個胺基酸殘基組成，每個殘基的淨電荷數 量大於或等於0.4;所述設計多肽不是同聚多肽，有至少15個胺基酸殘基長，每個殘基的淨電荷數量大於或等於0.4。
3. 根據權利要求1所述的方法，其中，所述第一層聚電解質或第二 層聚電解質，或者這兩層聚電解質在生物活性分子存在條件下被沉積。
4. 根據權利要求1所述的方法，其中，所述基底含有生物活性分子。
5. 根據權利要求4所述的方法，其中，所述生物活性分子以基底表 面的塗層形式存在。
6. 根據權利要求5所述的方法，其中，所述基底含有適於在聚電解 質多層膜沉積完後發生崩解的模板。
7. 根據權利要求4所述的方法，其中，所述生物活性分子以核的形 式存在。
8. 根據權利要求1所述的方法，其進一步包括在沉積第一層聚電 解質之前，將生物活性分子沉積到所述基底的表面上。
9. 根據權利要求1所述的方法，其中，所述高分子沉澱劑包含聚乙 二醇、聚(丙烯酸)、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚丙二醇，或者前述 一種或多種高分子沉澱劑的組合。
10. 根據權利要求l所述的方法，其中，所述膜是微膠囊形式。
11. 根據權利要求IO所述的方法，其中，生物活性分子被所述微膠 囊封裝在內。
12. —種在聚電解質多層膜製備過程中改善生物活性分子留置的方 法，該方法包括將第一層聚電解質沉積到基底表面上，形成第一層；以及將第二層聚電解質沉積到第一層聚電解質上，形成第二層；其中，在高分子沉澱劑存在條件下，將第一層聚電解質或第二層聚 電解質沉積到基底上，或者將這兩層聚電解質都沉積到基底上；第一層聚電解質和第二層聚電解質的淨電荷極性相反；以及所述基底含有生物活性分子。
13. 根據權利要求12所述的方法，其中，所述第一層聚電解質或第 二層聚電解質含有，或者這兩層聚電解質都含有設計多肽，其中所述設計多肽含有一個或多個第一胺基酸序列基元，所述一個或多 個第一胺基酸序列基元由5-15個胺基酸殘基組成，每個殘基的淨電荷數 量大於或等於0.4;所述設計多肽不是同聚多肽，有至少15個胺基酸殘基長，每個殘基 的淨電荷數量大於或等於0.4。
14. 根據權利要求12所述的方法，其中，在沉積第一層聚電解質之 前，將生物活性分子沉積到所述基底的表面上。
15. 根據權利要求12所述的方法 表面的塗層形式存在。
16. 根據權利要求12所述的方法解質多層膜沉積完後發生崩解的模板。
17. 根據權利要求12所述的方法 形式存在。
18. —種制膜方法，該方法包括在高分子沉澱劑存在條件下，將生物活性分子沉積到基底表面上； 將第一層聚電解質沉積到基底表面上，形成第一層；以及 將第二層聚電解質沉積到第一層聚電解質上，形成第二層； 其中，所述第一層聚電解質和第二層聚電解質的淨電荷極性相反。
19. 根據權利要求18所述的方法，其中，所述第一層聚電解質或第 二層聚電解質，或者這兩層聚電解質在高分子沉澱劑存在條件下被沉積。
20. 根據權利要求18所述的方法，其中，所述基底含有適於在聚電 解質多層膜沉積完後發生崩解的模板。，其中，所述生物活性分子以基底 ，其中，所述基底含有適於在聚電 ，其中，所述生物活性分子以核的
全文摘要
本文公開了一種制膜方法，該方法包括將第一層聚電解質沉積到基底表面上，形成第一層；以及將第二層聚電解質沉積到第一層聚電解質上，形成第二層。第一層聚電解質或第二層聚電解質，或者這兩層聚電解質在高分子沉澱劑存在條件下被沉積。第一層聚電解質和第二層聚電解質的淨電荷極性相反。本文還公開了在聚電解質多層膜製備過程中改善生物活性分子留置的方法。
文檔編號A61K9/28GK101309670SQ200680042346
公開日2008年11月19日 申請日期2006年11月13日 優先權日2005年11月14日
發明者唐納德·坦普爾頓·海尼, 郅政亮 申請人:路易斯安那科技大學研究基金會