一種快速抽提純化rna的試劑盒以及方法
2023-12-07 20:20:06
專利名稱：一種快速抽提純化rna的試劑盒以及方法
技術領域：
本發明涉及分子生物學領域，尤其涉及一種快速抽提純化RNA的試劑盒及方法。
背景技術：
RNA是遺傳的基本物質之一，也是蛋白合成的模板，分離高純度的RNA是 現代分子生物學研究(包括臨床醫學診斷等)和分子治療(如RNAi治療)的必要 技術手段，也是不可逾越的試驗過程。RNA具有易降解，難純化的特點。它極易 被無處不在RNase降解，也很容易在抽提過程中被DNA和蛋白汙染；傳統的方法， 如AGPC法或酸性酚法、氯化銫密度梯度離心法等以及現在常用的Trizol法， 必須用到毒性極強的酚和氯仿等，對環境和試驗人員易造成危害。並且操作過程 複雜、操作時間長，這樣都容易導致提純的RNA被汙染降解，並且這些方法對操 作環境的要求都十分的苛刻，為了保證RNA不被汙染，在提取之前，需要做大量 的配液、處理環境及耗材的工作，費時又費力，增加的提取成本，且不利於大規 模操作，限制了大規模臨床檢測應用及分子和基因組學的發展。
發明內容
因此，為了解決上述問題，本發明的發明人提出並完成了本發明。 本發明的目的為提供一種快速抽提純化RNA的試劑盒。 本發明的另 一 目的為提供一種快速抽提純化RNA的方法。 根據本發明的快速抽提純化RNA的試劑盒包括-1)樣品裂解液，
所述裂解液針對含多糖的材料的配方為 4.0-6 M GuCl
20-80 mM MES-NaOH， pH 5.2-6.510-50 mM擰檬酸鈉 0.1-0.6 % TritonX-100 0.5-2% N-月桂醯肌氨酸 5-20ul/ml (3-巰基乙醇 所述裂解液針對其它材料的配方為 3.5-5.5 M GuSCN
20-80 mM MES-NaOH， pH5.2-6.3 10-50 mM擰檬酸鈉 0.1-0.6 % TritonX-100 0.5-2% N-月桂醯肌氨酸 5-20ul/ml (3-巰基乙醇；
2) RNA結合柱前處理溶液，其配方為: 3.5-4.5 M LiCl
0.005-0.02M HC1 0.05-0.3% TritonX-100;
3) RNA結合溶液，其配方為；
a) 200-500 mM MES pH4.5-5.5
b) 90-100%乙醇，且a:b=l-5:95-99;
4) RNA洗液I，其配方為 50-200mM MES-NaOH， pH5~6， 3.5-4.5 M GuSCN
0.1-1% TritonX-100 15-30%乙醇；
5) RNA洗液II，
對於植物材料所述洗液II的配方為 70-85 %乙醇0.5-1.5%丙酮 0.005-0.05% DEPC，
對於其它材料所述洗液II的配方為
70-85%乙醇和0.005-0.05% DEPC;
6) Rnase-free H2O;
7) RNA過濾柱。
8) RNA結合柱。
根據本發明的試劑盒，所述RNA結合柱的材料為二氧化矽纖維膜。
根據本發明的試劑盒，所述RNA過濾柱的過濾介質為14M孔徑的氧化 鋁濾片。
根據本發明的試劑盒，所述RNA結合柱由孔徑為0.5WVI的酸化玻璃纖 維材料製成。
根據本發明的快速抽提純化RNA的方法包括以下步驟
1)裂解樣品，將樣品研磨，並加入樣品裂解液進行裂解，
所述裂解液針對含多糖的材料的配方為-4.0-6 M GuCl
20-80 mM MES-NaOH， pH 5.2-6.5 10-50 mM檸檬酸鈉 0.1-0.6 % TritonX-lOO 0.5-2% N-月桂醯肌氨酸 5-20ul/ml p-巰基乙醇 所述裂解液針對其它材料的配方為-3.5-5.5 M GuSCN
20-80 mM MES-NaOH, pH5.2- 6.3 10-50 mM檸檬酸鈉 0.1-0.6 % TritonX-lOO0.5-2% N-月桂醯肌氨酸 5-20ul/ml p-巰基乙醇；
2) 前處理，將200|iLRNA結合柱前處理液注入RNA結合柱中，然後 離心去除溶液，
所述RNA結合柱前處理溶液的配方為
35-4.5 M LiCI
0.005-0.02M HC1
0.05-0.3% TritonX-100;
3) 過濾，將裂解樣品用過濾柱過濾，在濾液中加入0.5倍體積的RNA 結合溶液並混勻，
所述RNA結合液的配方為
a) 200-500 mM MES pH4.5-5.5
b) 卯-1000/。乙醇，且a:b=l-5:95-99;
4) 結合RNA，將步驟3)獲得的溶液加入到RNA結合柱上，並離心去 除溶液；
5) 清洗提純RNA，力Q 500pLRNA洗液I於RNA結合柱中，並離心去除 溶液，然後再加750nLRNA洗液II於RNA結合柱中，並離心去除溶液，
所述RNA洗液I的配方為
50-200mM MES-NaOH， pH5~6,
3.5-4.5 M GuSCN
0.1-1% TritonX-lOO
15-30%乙醇，
對於植物材料所述洗液II的配方為 70-85 %乙醇0.5-1.5%丙酮
0. 005、0.05% DEPC，
對於其它材料所述洗液II的配方為
70-85%乙醇和0.005-0.05% DEPC;
6)洗脫RNA，向經步驟5)處理的RNA結合柱中加入Rnase-free的 H20，靜止，並離心收集溶液，得到高純度的RNA。
根據本發明的方法，所述RNA過濾柱的過濾介質為1WVI孔徑的氧化鋁 濾片。
根據本發明的方法，所述RNA結合柱由孔徑為0.5PM的酸化玻璃纖維 材料製成。
本發明摒棄了以往經典的酸性酚法及大公司的Trizol法，創造了一種全新的 RNA抽提純化方法，它使抽提純化的時間大大縮短，只需10分鐘，即可從各種材 料中提純可用於下遊各種實驗的高純度RNA，如cDNA的轉錄、Northernblot、 RNAi等。
綜上，本發明具有以下優點
1、 摒棄以往商用"Trizol"法、氯化銫密度梯度離心法和酸性酚法所用的酚抽 提步驟，採用溫和變性劑裂解法，輔助氧化鋁剪切，不使用任何對環境造成汙染 的藥品。
2、 不離心沉澱收集收集樣品，直接裂解， 一步過濾， 一步結合，兩步特異清 洗純化。
3、 採用特殊的全新溶液配方前處理二氧化矽纖維膜，使蛋白、DNA等雜質更 易清除，而且RNA更易結合。
4、 大大縮短抽分離提純時間，10分鐘即可完成。
5、 此法為RNA抽提的自動化和大規模化奠定了技術基礎。
具體實施例方式
實施例使用本發明的試劑盒快速抽提純化菸草葉的總RNA一、配製溶液 配製以下溶液
1) 樣品裂解液，
針對含多糖的材料的裂解液-5 M GuCl
50 mM Mes-NaOH， pH 6.3 20 mM擰檬酸鈉 0.5 % TritonX隱100 r/。N-月桂醯肌氨酸 10ul/ml (3-巰基乙醇
針對其它材料的裂解液
4.25 M GuSCN
50 mM MES-NaOH， pH 6.3
20 mM擰檬酸鈉
0.5 %TritonX-100
0.5n/。N-月桂醯肌氨酸
10ul/ml (3-巰基乙醇；
2) RNA結合柱前處理溶液 4 M LiCl
0.01M HC1 0.1% TritonX-100;
3) RNA結合溶液，其配方為;
a) 500 mM MES pH5.0
b) 100%乙醇，且a:b=l:96;
4) RNA洗液I: 100mMMES-NaOH， pH5~6， 4 M GuSCN
110.7% TritonX-100
20%乙醇；
5) RNA洗液II，
對於植物材料的洗液II:
78%乙醇
1%丙酮
0. 01、 DEPC，
對於其它材料的洗液II為
78%乙醇和0.01%DEPC; 6) Rnase-free H2O;
二、提取菸草的總RNA
1、 裂解樣品
取樣品(約為50mg)放入液氮輪動磨碎，加入裂解液450 W，劇烈震蕩， 溫育60° C，靜置2分鐘。
2、 同時前處理DNA結合柱將200u L DNA前處理溶液加入柱中， 11000rpm離心10秒，棄除溶液。
3、 過濾
將裂解樣品用RNA過濾柱過濾(剪切基因組DNA)，濾液中加入0.5 倍體積的結合溶液，混勻。
4、 特異結合RNA
將以上得到的所有樣品上樣到RNA結合柱上，11， 000rpm(8200 X g)離 心20秒，棄除溶液。
5、 清洗提純RNA力口 500 W洗液I於RNA結合柱，11， 000rpm(8200Xg)離心20秒，棄 除溶液。再加750W洗液n， 11， 000rpm(8200Xg)離心10秒，棄除溶液， 再離心1分鐘。
6、洗脫高純度RNA
將己結合RNA的乾燥柱，加入RNAse-free的H20，靜置1分鐘，11， 000rpm(8200Xg)離心1分鐘，收集溶液，得高純度RNA約為50 PL (0.叫g/叱)。
實施例二提取酵母細胞的總RNA
以與實施例一相同的方法，提取酵母細胞的總RNA。 實施例三使用本發明的試劑盒快速抽提純化菸草葉的總RNA
一、配製溶液
配製以下溶液
1)樣品裂解液，
針對含多糖的材料的裂解液
4.0 M GuCl
20 mM Mes-NaOH， pH 6.3 10 mM擰檬酸鈉 0.1 % TritonX-lOO 0.5n/。N-月桂醯肌氨酸 5ul/ml p-巰基乙醇
針對其它材料的裂解液
3.5 M GuSCN
20 mM MES-NaOH， pH 5.2 10 mM檸檬酸鈉 0.1 % TritonX陽lOO 0.5y。N-月桂醯肌氨酸 5ul/ml卩-巰基乙醇；2) RNA結合柱前處理溶液 3.5 M LiCl
0.005M HC1 0.05% TritonX-100;
3) RNA結合溶液，其配方為；
a) 200 mM MES pH5.0
b) 90%乙醇，且a:b=l:96;
4) RNA洗液I:
50mM MES-NaOH， pH5~6, 3.5 M GuSCN 0.1% TritonX-100
15%乙醇；
5) RNA洗液II，
對於植物材料的洗液II:
70%乙醇
0.5%丙酮
0. 005% DEPC，
對於其它材料的洗液II為
70%乙醇和0.005% DEPC; 6) Rnase-free H2O;
二、提取菸草的總RNA
1、 裂解樣品
取樣品(約為50mg)放入液氮輪動磨碎，加入裂解液450 W，劇烈震蕩， 溫育60° C，靜置2分鐘。2、 同時前處理DNA結合柱將200 nL DNA前處理溶液加入柱中， 11000rpm離心10秒，棄除溶液。
3、 過濾
將裂解樣品用RNA過濾柱過濾(剪切基因組DNA)，濾液中加入0.5 倍體積的結合溶液，混勻。
4、 特異結合RNA
將以上得到的所有樣品上樣到RNA結合柱上，11， 000rpm(8200 X g)離 心20秒，棄除溶液。
5、 清洗提純RNA
力口 500 W洗液I於RNA結合柱，11， 000rpm(8200Xg)離心20秒，棄 除溶液。再加750W洗液II， 11， 000rpm(8200Xg)離心10秒，棄除溶液， 再離心1分鐘。
6、 洗脫高純度RNA
將已結合RNA的乾燥柱，加入RNAse-free的H20，靜置1分鐘，11， 000rpm(8200Xg)離心1分鐘，收集溶液，得高純度RNA約為50化 (0-4lV禮)。
實施例四使用本發明的試劑盒快速抽提純化菸草葉的總RNA
一、配製溶液 配製以下溶液 1)樣品裂解液，
針對含多糖的材料的裂解液
6 M GuCl
80 mM Mes-NaOH， pH 6.3 50 mM檸檬酸鈉 0.6%TritonX-100 2。/oN-月桂醯肌氨酸20ul/ml (3-巰基乙醇 針對其它材料的裂解液-5.5 M GuSCN
80 mM MES隱NaOH， pH 6.3 50 mM檸檬酸鈉 0.6%TritonX-100 2YoN-月桂醯肌氨酸 20ul/ml (3-巰基乙醇；
2) RNA結合柱前處理溶液 4.5 M LiCl
0.02M HC1 0.3% TritonX-100;
3) RNA結合溶液，其配方為；
a) 500 mM MES pH5.5
b) 100%乙醇，且a:b=l:96;
4) RNA洗液I:
200mM MES-NaOH， pH5 6, 4.5 M GuSCN 1% TritonX-100 30%乙醇；
5) RNA洗液II，
對於植物材料的洗液II:
85 %乙醇
1.5%丙酮 0.05% DEPC,
對於其它材料的洗液II為
1685%乙醇和0.05% DEPC; 6) Rnase-free H2O;
二、提取菸草的總RNA
1、 裂解樣品
取樣品(約為50mg)放入液氮輪動磨碎，加入裂解液450 W，劇烈震蕩， 溫育60° C，靜置2分鐘。
2、 同時前處理DNA結合柱將200 PL DNA前處理溶液加入柱中， 11000rpm離心10秒，棄除溶液。
3、 過濾
將裂解樣品用RNA過濾柱過濾(剪切基因組DNA)，濾液中加入0.5 倍體積的結合溶液，混勻。
4、 特異結合RNA
將以上得到的所有樣品上樣到RNA結合柱上，11， 000rpm(8200Xg)離 心20秒，棄除溶液。
5、 清洗提純RNA
力口 500 W洗液I於RNA結合柱，11， 000rpm(8200Xg)離心20秒，棄 除溶液。再加750W洗液I1， 11， 000rpm(8200Xg)離心10秒，棄除溶液， 再離心1分鐘。
6、 洗脫高純度RNA
將已結合RNA的乾燥柱，加入RNAse-ftee的H20，靜置1分鐘，11， 000rpm(8200Xg)離心1分鐘，收集溶液，得高純度RNA約為50叱 (0.叫g/禮)。
權利要求
1、一種快速抽提純化RNA的試劑盒，其特徵在於，所述試劑盒包括以下組分1)樣品裂解液，所述裂解液針對含多糖的材料的配方為4. 0-6M GuCl20-80mM MES-NaOH，pH5.2-6.510-50mM檸檬酸鈉0. 1-0.6％ TritonX-1000. 5-2％ N-月桂醯肌氨酸5-20ul/ml β-巰基乙醇所述裂解液針對其它材料的配方為3. 5-5.5M GuSCN20-80mM MES-NaOH，pH5.2-6.310-50mM檸檬酸鈉0. 1-0.6％ TritonX-1000. 5-2％N-月桂醯肌氨酸5-20ul/ml β-巰基乙醇；2)RNA結合柱前處理溶液，其配方為3. 5-4.5M LiCl0. 005-0.02M HCl0. 05-0.3％ TritonX-100；3)RNA結合溶液，其配方為；a)200-500mM MES pH4.5-5.5b)90-100％乙醇，且a∶b＝1∶96；4)RNA洗液I，其配方為50-200mM MES-NaOH，pH5～6，3. 5-4.5M GuSCN0. 1-1％ TritonX-10015-30％ 乙醇(如上述，請最好給出上述濃度的取值範圍)；5)RNA洗液II，對於植物材料所述洗液II的配方為70-85％乙醇0. 5-1.5％丙酮0. 005-0.05％ DEPC，對於其它材料所述洗液II的配方為70-85％乙醇和0. 005-0.05％DEPC；(如上述，請最好給出上述濃度的取值範圍)6)Rnase-free H2O；7)RNA過濾柱；以及8)RNA結合柱。
2、 根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，所述RNA結合柱的材 料為二氧化矽纖維膜-
3、 根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，所述RNA過濾柱的過 濾介質為0.5-2Wv4孔徑的氧化鋁濾片。
4、 根據權利要求1所述的試劑盒，其特徵在於，所述RNA結合柱由孔 徑為0.3-0.8WVI的酸化玻璃纖維材料製成。
5、 一種快速抽提純化RNA的方法，其特徵在於，所述方法包括以下步驟1)裂解樣品，將樣品研磨，並加入樣品裂解液進行裂解，所述裂解液針對含多糖的材料的配方為 4.0-6 M GuCl 20-80 mM MES-NaOH， pH 5.2-6.510-50 mM檸檬酸鈉 0.1-0.6 % TritonX-100 0.5-2% N-月桂醯肌氨酸 5-20ul/ml (3-巰基乙醇所述裂解液針對其它材料的配方為3.5-5.5 M GuSCN20-80 mM MES-NaOH， pH5.2- 6.3 10-50 mM擰檬酸鈉 0.1-0.6 % TritonX-100 0.5-2% N-月桂醯肌氨酸 5-20ul/ml p-巰基乙醇2) 前處理，將200nL RNA結合柱前處理液注入RNA結合柱中，然後 離心去除溶液，所述RNA結合柱前處理溶液的配方為 35-4.5 M LiCl 0.005-0.02M HC10.05-0.3% TritonX隱100;3) 過濾，將裂解樣品用過濾柱過濾，在濾液中加入0.5倍體積的RNA 結合溶液並混勻，所述RNA結合液的配方為 a) 200-500 mM MES pH4.5-5.51))卯-100%乙醇，且a:b=l-5:95-99;4) 結合RNA，將步驟3)獲得的溶液加入到RNA結合柱上，並離心去 除溶液；5) 清洗提純RNA，加500|iLRNA洗液I於RNA結合柱中，並離心去除 溶液，然後再加750nLRNA洗液II於RNA結合柱中，並離心去除溶液，所述RNA洗液I的配方為(50-200mM MES-NaOH， pH5~6， 3.5-4.5 M GuSCN 0.1-1% TritonX-100 15-30%乙醇，對於植物材料所述洗液II的配方為70-85 %乙醇 0.5-1.5%丙酮 0.005-0.05% DEPC，對於其它材料所述洗液II的配方為70隱85°/。乙醇和0.005-0.05% DEPC;(6)洗脫RNA，向經步驟5)處理的RNA結合柱中加入Rnase-free的 H20，靜止，並離心收集溶液，得到高純度的RNA。
6、 根據權利要求5所述的方法，其特徵在於，所述RNA結合柱的材料 為二氧化矽纖維膜。
7、 根據權利要求5所述的方法，其特徵在於，所述RNA過濾柱的過濾 介質為0.5-2PM孔徑的氧化鋁濾片。
8、 根據權利要求5所述的方法，其特徵在於，所述RNA結合柱由孔徑 為0.3-0.8PM的酸化玻璃纖維材料製成。
全文摘要
本發明涉及分子生物學領域，尤其涉及一種快速抽提純化RNA的試劑盒及方法。本發明的試劑盒包括裂解液、前處理液、RNA結合液、RNA洗液I和II、以及RNA過濾柱和結合柱。本發明的方法包括裂解、前處理、過濾、結合RNA、清洗提純和洗脫等步驟。本發明摒棄了以往經典的酸性酚法及大公司的Trizol法，創造了一種全新的RNA抽提純化方法，它使抽提純化的時間大大縮短，只需10分鐘，即可從各種材料中提純可用於下遊各種實驗的高純度RNA，如cDNA的轉錄、Northern blot、RNAi等。
文檔編號C12N15/10GK101532012SQ20081010160
公開日2009年9月16日 申請日期2008年3月10日 優先權日2008年3月10日
發明者李樂攻 申請人:首都師範大學