利用土壤桿菌製作轉化植物的方法

2023-11-04 13:15:47 1

專利名稱：：利用土壤桿菌製作轉化植物的方法
技術領域：
：本申請要求2008年3月31日提出的日本國專利申請2008-094049的優先權。本發明涉及新的利用土壤桿菌(Agrobacterium)製作轉化植物的方法。
背景技術：
：作為主要穀類即玉米、稻等單子葉植物的轉化方法，傳統上已知有電穿孔法、粒子槍法等。但是，這些物理基因導入方法存在如下問題導入了多拷貝的基因，基因的插入不是完好形式，轉化植物多見畸形、不育，等等。利用土壤桿菌屬細菌的基因導入法作為雙子葉植物的轉化法有著普遍的應用。土壤桿菌屬細菌的宿主僅限於雙子葉植物，認為其不能寄生在單子葉植物中(DeCleeneandDeLey1976)，但正在嘗試用土壤桿菌轉化單子葉植物。Grimsley等人報告稱在土壤桿菌的T-DNA中插入玉米條紋病毒(Maizestreakvirus)的DNA，再將其接種至玉米生長點，確認了玉米條紋病毒的感染，而在僅接種玉米條紋病毒的DNA時，不能確認上述感染症狀。這可以解釋成以上現象表明土壤桿菌能夠向玉米中導入DNA(Grimsley等，1987)。但是，病毒在未整合入核基因組的情況下仍具有增殖可能性，該結果並不能說明T-DNA整合到核上。Grimsley等人進一步揭示感染效率以接種至玉米的莖頂部生長點時為最高(Grimsley等，1988)，感染需要土壤桿菌的質粒的VirC基因(Grimsley等，1989)。Gould等人用針損傷玉米的生長點後，接種帶有卡那黴素抗性基因和GUS基因的強病原性土壤桿菌EHA1，用卡那黴素選擇處理後的生長點，結果得到了顯示抗性的植物。為了確認其子代的種子中具有導入的基因而進行了Southern分析，結果對於一部分種子確認了導入基因(Gould等，1991)。這提示在用卡那黴素對經土壤桿菌處理的生長點進行選擇而得到的植物體中，混合存在有轉化細胞和非轉化細胞(嵌合現象)。Mooney等人嘗試了使用土壤桿菌對小麥的胚導入卡那黴素抗性基因。首先，通過用酶處理胚使其細胞壁損傷，然後接種土壤桿菌。處理後的愈傷組織中增殖出極少數的認為具有卡那黴素抗性的愈傷組織，但這些愈傷組織不能再生成植物體。此外，在通過Southern分析來確認卡那黴素抗性基因的存在時，在所有抗性愈傷組織中均觀察到導入基因的結構突變(Mooney等，1991)。Raineri等人在損傷稻的胚盤後，用強病原性的土壤桿菌A281(pTiBo542)處理了稻的8個品種，在日本晴、藤坂5號這2個品種中觀察到腫瘤狀組織的增殖。而且，將帶有下述質粒的土壤桿菌接種於稻胚，觀察到卡那黴素抗性愈傷組織的增殖，所述質粒是在從T-DNA中除去激素合成基因而得的Ti質粒中插入卡那黴素抗性基因和GUS基因而得到的。在該抗性愈傷組織中，確認到了⑶S基因的表達，但不能獲得轉化植物。這些可以解釋為土壤桿菌的T-DNA被導入到稻的細胞中(Raineri等，1990)。如上述，有研究報告揭示在稻、玉米、小麥等稻科作物中也能夠利用土壤桿菌進行基因導入。然而，其都存在再現性的問題，此外，關於導入基因的確認是不完全的、沒有給3出有說服力的結果(Potrykus1990)。Chan等人報告將在2，4_D共存下培養了2天的稻未成熟胚損傷後，在含馬鈴薯懸浮培養細胞的培養基中對其接種了帶有nptII基因和GUS基因的土壤桿菌。在含G418培養基上培養經過處理的未成熟胚，結果由誘導產生的愈傷組織得到了再分化植物體。在通過Southern分析確認再分化植物體及其子代植物體中的GUS基因的存在時，確認了無論是再分化本代還是子代植物體中均存在導入基因(Chan等，1993)。該結果支持用土壤桿菌轉化稻，但轉化效率非常低，僅為1.6%，相對於供試的250個未成熟胚，顯示正常生長的再生植物體只有1個個體。為了摘出稻的未成熟胚，需要大量勞力，因此很難說這樣的低轉化效率達到了實用水平。近年來，有報告稱通過利用具有強病原性土壤桿菌的一部分病原性基因的超級二元載體，即使在稻、玉米等單子葉植物中，也能夠進行穩定、高效率的轉化(Hiei等，1994，Ishida等，1996)。這些報告認為，利用土壤桿菌進行的轉化除了能夠實現穩定、高效率的轉化之外，還具有下述優點所得轉化植物的突變少，導入基因的拷貝數少、且多為完好形式。繼在稻、玉米中取得成功之後，還有報告稱在主要穀類即小麥(Cheng等，1997)、大麥(Tingay等，1997)和蜀黍(Zhao等，2000)中利用土壤桿菌進行了轉化。作為改善利用土壤桿菌轉化玉米的效率的嘗試，除上述之外還有在N6基本培養基中選擇轉化細胞(Zhao等，2001)、在培養基中添加AgNO3和羧苄西林(Zhao等，2001、Ishida等，2003)、在共存培養基中添加半胱氨酸(Frame等，2002)，等等。這樣，通過改變培養基組成、選擇標記基因，實現了利用土壤桿菌轉化稻或玉米的效率的提高。就目前報導的利用土壤桿菌轉化稻、玉米的方法而言，基本上都是經由下述步驟來獲得轉化植物針對接種了土壤桿菌的胚盤來源愈傷組織、或者從接種了土壤桿菌的未成熟胚誘導得到的愈傷組織，使用含除草劑成分、抗生素的培養基選擇性增殖轉化愈傷組織，並將所得轉化細胞塊著床於再分化培養基使其再分化(Deji等，2000；Negrotto等，2000；Nomura等，2000a；Nomura等，2000b；Taniguchi等，2000；Frame等，2002；Zhang等，2003；Frame等，2006)。在植物的轉化方法方面，轉化細胞的選擇對於轉化植物的製作而言是不可或缺的，沒有該步驟，植物的轉化就不可能成功(Potrykus等，1998；Erikson等，2005Joersbo等，2001)。多數情況下，轉化細胞的選擇利用下述方法進行將對抑制非轉化細胞增殖的藥物顯示抗性的基因導入植物材料的，並用含該藥物的培養基培養植物材料，從而僅選擇性地增殖藥物抗性基因重組入植物細胞基因組並表達的轉化細胞。在用於轉化細胞的選擇的基因(選擇標記基因)中，最常用的基因是賦予對除草劑或抗生素的抗性的基因(Kuiper等，2001)。作為賦予對除草劑的抗性的基因，bar基因、EPSP基因(DeBlock等，1987;Comai等，1985)是經常作為植物轉化的選擇標記基因使用的，而作為賦予對抗生素的抗性的基因，NPTII基因、HPT基因(Bevan等，1983；Waldron等，1985)是經常作為植物轉化的選擇標記基因使用的。此外，近年來有報告稱，利用了特定糖代謝能力的PMI基因、XylA基因(Joersbo等，1998；Haldrup等，1998)等作為選擇標記基因也是有效的。作為利用選擇性增殖轉化細胞的機制的選擇標記基因，除了上述基因以外，還報導了許多基因。而且，可以認為，在使用這些基因的轉化方法中，選擇性增殖轉化細胞的選擇步驟是必須的。4在採用減壓浸潤法對花芽組織實施轉化的Inplanta(7>^)轉化方法中，可以不經由選擇步驟而獲得轉化的種子(Bent，2000)。但是，為了從混有許多非轉化種子的種子之中得到作為目標的轉化種子，利用抗生素抗性基因等的選擇步驟則是必要的。已經報導了下述方法導入GFP基因，以紫外線照射下發射螢光的細胞為指標可視地選擇轉化部位，從而獲得轉化植物(Elliott等，1998；Zhu等，2004)。在該方法中，雖然無需根據增殖方面的差異將轉化細胞從混在的非轉化細胞中選擇出來，但根據有無GFP基因表達來區別轉化細胞與非轉化細胞並進一步將它們分開的選擇步驟則是必要的。作為從轉化植物除去選擇標記基因的技術，已經報導的有共轉化系統(Komari等，1996)、MAT載體系統(Ebinuma等，1997)和CreLox系統(Gleave等，1999；Zhang等，2003)。通過使用這些系統，能夠獲得不含選擇標記基因的轉化植物。但是，在製作無選擇標記的轉化植物的過程中，傳統上採用的、使用藥物抗性基因、植物激素合成基因等區別並選擇轉化細胞與非轉化細胞的步驟是必要的。如上述，在植物轉化方面的至今為止的方法中，分選轉化細胞與非轉化細胞的選擇步驟是不可或缺的。在該選擇步驟中，如上述，除了目的基因(G0I基因)以外還必須要有用於進行選擇的選擇標記基因。利用因該選擇標記基因表達所產生的蛋白質、酶的功能而發生的反應例如除草劑抗性、抗生素抗性或螢光發光等，可以區別出多數非轉化細胞中的很少一部分轉化細胞，然後使之增殖，即可獲得轉化植物。但是，選擇標記基因是製作出的轉化植物所不需要的，而且，如果任由轉化植物包含選擇標記基因，則不能說不存在除草劑抗性基因、抗生素抗性基因通過轉化體轉播到一般非重組植物的危險，這樣對轉化植物的應用抱有不安心態的一般消費者也很多。此外，雖然報告了多種選擇標記基因，選擇標記基因受到所適應的植物種類的限制，在分多個基因進行導入時會出現問題。而且，關於從轉化體除去選擇標記基因的技術雖有報導，但這些方法需要耗費相當大的勞力，例如與常規轉化方法相比培養期間長，需要從後代植物中選擇無選擇標記的個體等。如上述，儘管目前為止在轉化植物的製作方面已有許多相關報導，但是關於不經由未轉化的細胞、組織、器官或者個體分選出轉化的細胞、組織、器官或者個體的選擇步驟而獲得轉化體的方法尚未有報導。即，可以說截至目前，僅導入GOI(GeneofInterest)基因來獲得轉化植物是不可能的。專利文獻1:W098/54961專利文獻2:W002/12520專利文獻3:W002/12521專利文獻4:W02005/017169專利文獻5:W02005/017152專利文獻6:W02007/069643非專利文獻1:DeCleene,Μ.andgall.Bot.Rev.42:389_466.非專禾U文獻2=Grimsley,NAgrobacterium—mediateddeliveryofmaizeplants.Nature325:177-179.非專禾U文獻3=Grimsley,NDeLey,J.(1976)Thehostrangeofcrown.，Horn,T.，Davis,J.W.andHorn,B.(1987)infectiousmaizestreakvirusinto.H.,Ramos,C.,Hein,T.andHorn,B.(1988)5MeristematictissuesofmaizeplantsaremostsusceptibletoAgroinfectionwithmaizestreakvirus.Bio/tecnology6:185-189·非專禾Ij文獻4:Grimsley,N.，Horn，B.，Ramos，C.，Kado,C.andRogowsky,P.(1989)DNAtransferfromAgrobacteriumtoZeamaysorBrassicabyagroinfectionisdependentonbacterialvirulencefunctions.Mol.Gen.Genet.217:309-316.非專利文獻5Gould,J.，Devey,Μ.，Hasegawa，0.，Ulian，Ε.C.，Peterson，G.andSmith，R.H.(1991)TransformationofZeamaysLusingAgrobacteriumtumefaciensandshootapex.PlantPhysiol.95:426-434.非專禾U文獻6:Mooney,P.Α.，Goodwin,P.B.，Dennis，E.S.andLlewellyn,D.J.(1991)Agrobacteriumtumefaciens-genetransferintowheattissues.PlantCell,TissuesandOrganCulture25:209-218.非專利文獻7RaineriiD.Μ.,BottinoiP.，Gordon，Μ·Ρ·andNesteriE.W.(1990)Agrobacterium-mediatedtransformationofrice(OryzasativaL.).Bio/technology8:33-38.非專利文獻8:Potrycus,I(1990)Genetransfertocereals:anassessment.Bio/technology8:535_542·非專利文獻9:Chan，M-T.，Chang，H-H.，Ho，S-L.，Tong，W-F.andYu，S-M.(1993)Agrobacterium-mediatedproductionoftransgenicriceplantsexpressingachimericα-amylasepromoter/β-glucuronidasegene.PlantMol.Biol.22:491_506.非專利文獻10:Hiei，Y.，0hta，S·,KomariiT.andKumashiroiT.(1994)Efficienttransformationofrice(OryzasativaL.)mediatedbyAgrobacteriumandsequenceanalysisoftheboundariesoftheT-DNA.ThePlantJournal6:271-282.非專利文獻11:Ishida，Y.，Saito，H.，Ohta，S.，Hiei，Y.，Komari,Τ.andKumashiro,Τ.(1996)Highefficiencytransformationofmaize(ZeamaysL.)mediatedbyAgrobacteriumtumefaciens.NatureBiotechnology14:745_750.非專禾Ij文獻12:Cheng，Μ.，Fry,J.Ε.，Pang，S.，Zhou，H.，Hironaka，C.Μ.，Duncan，D.R.，Conner，Τ.W.，Wan,Y.(1997)GenetictransformationofwheatmediatedbyAgrobacteriumtumefaciens.PlantPhysiol.115:971_980·非專利文獻13:Tingay，S.,McElroyiD.,KallaiR.，Fieg，S.,Wang,Μ.，Thornton，S.，Brettell，R.(1997)Agrobacteriumtumefaciens-mediatedbarleytransformation.PlantJ.11:1369_1376·非專利文獻14:Zhao，Ζ._Υ·，Cai,Τ.，Tagliani，L，Miller,Μ.，Wang,N.，Peng，H.，Rudert，Μ.，Schoeder,S.，Hondred，D.，Seltzer,J.，Pierce，D.(2000)Agrobacterium-mediatedsorghumtransformation.PlantMol.Biol.44:789_798·非專利文獻15:Deji，Α.，Sakakibara，H.，Ishida，Y.，Yamada,S.，Komari,Τ.，Kubo，Τ·，Sugiyama，Τ·(2000)GenomicorganizationandtranscriptionalregulationofmaizeZmRRlandZmRR2encodingcytokinin-inducibleresponseregulators.Biochim.etBiophys.Acta1492:216-220.非專禾丨J文獻16:Negrotto,D.，Jolley,Μ.，Beer，S.，Wenck，A.R.，Hansen，G.(2000)Theuseofphosphomannose-isomeraseasaselectionmarkertorecovertransgenicmaizeplants(ZeamaysL.)viaAgrobacteriumtransformation.PlantCellReports19:798_803·非專禾"J文獻17Nomura,Μ.，Sentoku，N.，Nishimura，Α.，Lin,J-H.，Honda，C.，Taniguchi，Μ·，Ishida，Y.，Ohta，S.,Komari,Τ.,Miyao-Tokumori,Μ.，Κοηο—Murakami，Y.，Tajima，S.，Ku，Μ·S.B.，Matsuoka，Μ·(2000a)TheevolutionofC4plants!acquisitionofcis-regulatorysequencesinthepromoterofC4~typepyruvate,orthophosphatedikinasegene.PlantJ.22:211_221·非專禾丨J文獻18Nomura,Μ.，Katayama,K.，Nishimura，Α.，Ishida，Y.，Ohta，S.，Komari，Τ.，Miyao-Tokutomi,Μ.，Tajima，S.，Matsuoka，Μ.(2000b)ThepromoterofrbcSinaC3plant(rice)directsorgan-specific,light-dependentexpressioninaC4plant(maize),butdoesnotconferbundlesheathcell-specificexpression.PlantMol.Biol.44:99-106.非專利文獻19:Taniguchi，Μ.，Izawa,K.，Ku，Μ.S.B.，Lin,J-H.，Saito，H.，Ishida,Y.,Ohta,S.,Komari,Τ.，Matsuoka，Μ·,Sugiyama,Τ.(2000)ThepromoterforthemaizeC4pyruvate,orthophosphatedikinasegenedirectscell—andtissue-specifictranscriptionintransgenicmaizeplants.PlantCellPhysiol.4142~48.非專利文獻20:Zhao，Z.-Y.，Gu，W.，Cai，T.,TaglianiiL.,HondrediD.，Bond，D.，Schroeder,S.，Rudert,Μ.，Pierce，D.(2001)HighthroughputgenetictransformationmediatedbyAgrobacteriumtumefaciensinmaize.Mol.Breed.8:323-333.非專禾Ij文獻21Frame,B.R.，Shou,H.，Chikwamba，R.K.，Zhang，Ζ.，Xiang，C.，Fonger,Τ.Μ.，Pegg，S.Ε.K.，Li,B.，Nettleton,D.S.，Pei,D.，Wang,K.(2002)Agrobacteriumtumefaciens—mediatedtransformationofmaizeembryosusingastandardbinaryvectorsystem.PlantPhysiol.12913-22.非專利文獻22:Ishida，Y.，Saito,H.，Hiei，Y.，Komari,Τ.(2003)Improvedprotocolfortransformationofmaize(ZeamaysL.)mediatedbyAgrobacteriumtumefaciens.PlantBiotechnology20:57—66·非專禾丨J文獻23Zhang,W.，Subbarao,S.，Addae,P.，Shen,Α.，Armstrong，C.，Peschke,V.，Gilbertson，L.(2003)Cre/lox-mediatedmarkergeneexcisionintransgenicmaize(ZeamaysL.)plants.Theor.App1.Genet.1071157-1168.非專禾Ij文獻24Frame,B.R.，McMurray,J.Μ.，Fonger,Τ.Μ.，Main，Μ.L.，Taylor,K.W.，Torney,F.J.，Paz,Μ.Μ.，Wang,K.(2006)ImprovedAgrobacterium-mediatedtransformationofthreemaizeinbredlinesusingMSsalts.PlantCellRep.251024-1034.非專利文獻25:Hiei,Y.,Ishida,Y.，Kasaoka，K.&Komari,T.ImprovedfrequencyoftransformationinriceandmaizebytreatmentofimmatureembryoswithcentrifugationandheatpriortoinfectionwithAgrobacteriumtumefaciens.PlantCell，TissueandOrganCulture87，233-243(2006)·非專利文獻26:Hiei，Y.&Komari,Τ.ImprovedprotocolsfortransformationofindicaricemediatedbyAgrobacteriumtumefaciens.PlantCell,TissueandOrganCulture85，271-283(2006).非專利文獻27:Komari，T.TransformationofcallusculturesofnineplantspeciesmediatedbyAgrobacterium.PlantSci.60,223-229(1989).非專禾Ij文獻28:Bent，A.F.(2000)Arabidopsisinplantatransformation.Uses，mechanisms，andprospectsfortransformationofotherspecies.PlantPhysiol.，124:1540_1547.非專利文獻29:Bevan,Μ.W.，Flavell，R.B.，Chilton，Μ._D.(1983)Achimaericantibioticresistancegeneasaselectablemarkerforplantseelltransformation.Nature，304184-187.非專利文獻30:Comai，L，Facciotti，D.,Hiatt,W.R.,Thompson,G.,Rose,R.Ε.，Stalker,D.Μ.(1985)ExpressioninplantsofamutantaroAgenefromSalmonellatyphimuriumconferstolerancetoglyphosate.Nature,317:741-744.非專禾Ij文獻31:DeBlock，Μ.，Botterman,J.，Vandewiele,Μ.，Dockx，J.，Thoen，C.，Gossele，V.，Movva,N.R.，Thompson,C.，VanMontagu，M.，Leemans,J.(1987)Engineeringherbicideresistanceinplantsbyexpressionofadetoxifyingenzyme.EMBOJ.，6:2513_2518.非專禾U文獻32:Ebinuma，H.，Sugita，K.，Matsunaga，Ε.，Yamakado,Μ.(1997)Selectionofmarker-freetransgenicplantsusingtheisopentenyltransferasegeneasaselectablemarker.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,94:2117-2121.非專禾Ij文獻33:Elliott，A.R.，Campbell，J.Α.，BrettellR.I.S.，Grof，C.P.L.(1998)Agrobacterium-mediatedtransformationofsugarcaneusingGFPasascreenablemarker.Aust.J.PlantPhysiol.,25:739-743.非專禾Ij文獻34:Erikson，0.S.，Hertzberg，Μ.，Nasholm，Τ.(2005)ThedsdAgenefromEscherichiacoliprovidesanovelselectablemarkerforplanttransformation.PlantMol.Biol.，57:425_433·非專利文獻35:Gleave,Α.P.，Mitra，D.S.，Mudge,S.R.，Morris,B.Α.Μ.(1999)Selectablemarker-freetransgenicplantswithoutsexualcrossingtransientexpressionofererecombinaseanduseofaconditionallethaldominantgene.Plant.Mol.Biol.，40:223_235·非專利文獻36:Haldrup,Α.，Petersen,S.G.，Okkels，F.Τ.(1998)ThexyloseisomerasegenefromThermoanaerobacteriumthermosulfurogenesallowseffectiveselectionoftransgenicplantcellsusingD-xyloseastheselectionagent.PlantMol.Biol.，37:287_296.非專禾丨J文獻37Joersbo，Μ.，Donaldson,I.，Kreiberg，J.，Petersen，S.G.，Brunstedt,J.，Okkels,F.Τ.(1998)Analysisofmannoseselectionusedfortransformationofsugarbeet.Mol.Breed.,4:111-117.非專利文獻38Komari,Τ.，Hiei，Y.，Saito，Y.，MuraiiN.，Kumashiro,Τ.(1996)VectorscarryingtwoseparateT-DNAsforco-transformationofhigherplantsmediatedbyAgrobacteriumtumefaciensandsegregationoftransformantsfreefromselectionmarkers.ThePlantJournal,10165-174.非專利文獻39:Kuiper,H.Α.，Kleter,G.Α.，Notebom，H.P.J.M.，Kok，E.J.(2001)Assessmentofthefoodsafetyissuesrelatedtogeneticallymodifiedfood.ThePlantJournal，27:503-528.非專利文獻40:Potrykus,I.，Bilang，R.，FuttererJ.，Sautter，C.，Schrott，M.(1998)Geneticengineeringofcropplants.AgriculturalBiotechnology,MarcelDekerInc.，NewYork.119-159.非專利文獻41竹松哲夫(1982)除草剤研究総覧博友社79-154.非專禾丨J文獻42:Waldron,C.，Murphy,Ε.B.，Roberts，J.L.，Gustafson，G.D.，Armour,S.L.,Malcolm,S.K.(1985)ResistancetohygromycinB:Anewmarkerforplanttransformationstudies.PlantMol.Biol.,5:102-108.非專利文獻43:Zhu，Y.J.，Asbayani，R.，Moore,P.H.(2004)Greenfluorescentproteinasavisualselectionmarkerforpapaya(CaricapapayaL.)transformation.PlantCellRep.，22:660_667.非專禾Ij文獻44:Chu，C.-C.(1978)TheN6mediumanditsapplicationstoanthercultureofcerealcrops.InProc.Symp.PlantTissueCulture.PekingSciencePress，pp.43-50.非專禾Ij文獻45Sambrook,J.，Fritsch，Ε.F.，Maniatis，Τ.(1989)MolecularCloning:ΑLaboratoryManual,2nded.，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，NewYork.
發明內容發明所要解決的問題在傳統的利用土壤桿菌屬細菌的針對單子葉植物的基因導入方法中，利用選擇標記基因導入進行的轉化細胞、組織、器官或者個體的選擇步驟是不可或缺的。本發明的目的是開發並提供不經由這樣的選擇步驟的獲得轉化植物的方法。解決問題的方法本發明人等為解決上述課題進行了深入研究，結果發現通過對單子葉植物進行轉化效率提高處理，可以無需導入選擇標記基因而以實用效率得到轉化植物。具體地，本發明人等注意到一般來說在植物的轉化步驟中，重組了外源基因的植物細胞的數量非常少，可以認為如果能夠大幅提高轉化效率，提高非轉化細胞中轉化細胞所佔的比例，並將其保持到植物體再分化，那麼就可以獲得轉化植物，而無需經由利用選擇標記基因的選擇步驟。進行深入研究的結果發現通過適宜地進行轉化提高處理，能夠以充分實用的效率獲得轉化植物，從而完成了本發明。並非意欲限定本發明，但本發明包括下述實施方式作為優選實施方式。[實施方式1]—種轉化植物的製作方法，該製作方法是使用土壤桿菌的轉化植物的生產方法，該使用土壤桿菌的轉化植物的生產方法包括9(i)用共存培養基培養接種了土壤桿菌的植物材料的共存步驟；以及(ii)對於(i)中得到的組織，不進行愈傷組織增殖培養或者在進行愈傷組織增殖培養後，用再分化培養基進行培養，使其再分化成植物體的步驟；其中，所述轉化植物的製作方法中，1)進行轉化提高處理；以及2)在從共存直至再分化的任何步驟中，均不進行使用選擇藥物的轉化細胞的選擇。[實施方式2]實施方式1所述的轉化植物的製作方法，其中，3)在共存步驟與再分化步驟之間不包括用愈傷組織增殖培養基培養共存培養後的組織的步驟。[實施方式3]實施方式1或2所述的轉化植物的製作方法，其中，通過土壤桿菌導入的核酸不包括針對選擇藥物的抗性基因。[實施方式4]實施方式13中任一項所述的轉化植物的製作方法，其中，1)轉化提高處理是提高將目的基因導入植物細胞的效率的處理、提高始於未成熟胚等的愈傷組織誘導率的處理、或者提高始於轉化愈傷組織的再分化效率的處理。[實施方式5]實施方式14中任一項所述的轉化植物的製作方法，其中，1)轉化提高處理選自下組熱處理；離心處理；熱和離心處理；加壓處理；在共存培養基中添加硝酸銀和/或硫酸銅；在粉末存在下接種土壤桿菌的處理；在共存步驟後的、愈傷組織增殖和/或再分化步驟中的培養基中添加羧苄西林；在愈傷組織增殖培養基中添加N6無機鹽的處理；以及在共存培養基中添加半胱氨酸的處理。[實施方式6]實施方式15所述的轉化植物的製作方法，其中，共存步驟包括添加屬於苯甲酸類除草劑的化合物。[實施方式7]實施方式6所述的轉化植物的製作方法，其中，屬於苯甲酸類除草劑的化合物是苯甲酸型、水楊酸型或吡啶羧酸型。[實施方式8]實施方式6或7所述的轉化植物的製作方法，其中，屬於苯甲酸類除草劑的化合物是3，6-二氯-2-甲氧基苯甲酸(3，6-夕夕口口-ο-7二;y>酸，3，6-Dichloro-o-anisic10acid)或4-氨基-3，5，6-三氯吡啶羧酸。[實施方式9]實施方式18所述的轉化植物的製作方法，其中，植物是單子葉植物。[實施方式10]實施方式19所述的轉化植物的製作方法，其中，植物是玉米或稻。[用於實施本發明的優選實施方式]本發明提供利用土壤桿菌的轉化植物的製作方法。本發明基於下述發現在利用土壤桿菌屬細菌進行針對植物的基因導入的方法中，通過進行轉化效率提高處理，不需要選擇標記基因的導入。本發明的方法是利用土壤桿菌進行的轉化植物的生產方法，該轉化植物的生產方法包括(i)用共存培養基培養接種了土壤桿菌的植物材料的共存步驟，以及(ii)對於(i)中所得的組織，不進行愈傷組織增殖培養或者在進行愈傷組織增殖培養後，用再分化培養基進行培養，使其再分化成植物體的步驟；本發明的方法的特徵是1)進行轉化提高處理，以及2)在從共存直至再分化的全部步驟中，均不進行使用選擇藥物的轉化細胞的選擇。轉化提高處理本發明的特徵之一是進行轉化提高處理。在本發明的方法中，「轉化提高處理」是指通過進行該處理，所得轉化植物的比例提高的處理。並非進行限定，具體地可以列舉出提高目的基因針對植物細胞的導入效率的處理、提高未成熟胚等的愈傷組織誘導率的處理、提高轉化愈傷組織的再分化效率的處理等。作為這樣的轉化提高處理，不受限制，包含例如以下的處理或者它們的組合。熱處理(參照W098/54961)、離心處理(參照W002/12520)、熱和離心處理(參照W002/12521)、加壓處理(參照TO2005/017169)、在共存培養基中添加硝酸銀和/或硫酸銅(參照AgNO3(Zhac)等，2001、Ishida等，2003；CuSO4(W02005/017152)、在粉末的存在下接種土壤桿菌的處理(參照W02007/069643)、在共存步驟後的、愈傷組織增殖和/或再分化步驟中的培養基中添加羧苄西林(參照Zhao等，2001、Ishida等，2003)、在愈傷組織增殖培養基中添加N6無機鹽(Chu1978)的處理(Zhao等，2001)、以及在共存培養基中添加半胱氨酸的處理(Frame等，2002)。這其中，熱處理、離心處理、熱和離心處理、加壓處理、粉末的添加均是提高基因導入效率的處理，而硝酸銀、硫酸銅、羧苄西林的添加具有提高愈傷組織誘導率的效果。此外，在再分化培養基中添加硫酸銅，可以提高再分化效率。並非進行限定，熱處理可以採用例如W098/54961所述的方法來進行。例如，在使11植物材料與土壤桿菌接觸前，於33°C60°C、優選37°C52°C處理5秒24小時、優選1分鐘24小時。離心處理可以採用例如W002/12520所述的方法來進行。例如，在使植物材料與土壤桿菌接觸之前，以100G25萬G、優選500G20萬G、更優選1000G15萬G的離心加速度處理1秒4小時、更優選1秒2小時。熱和離心處理可以採用例如W002/12521所述的方法來進行。熱處理以及離心處理的條件可以採用例如上述條件。加壓處理可以採用例如W02005/017169所述的方法來進行。並非進行限定，加壓處理優選在1.7個大氣壓10個大氣壓的範圍、更優選2.4個大氣壓8個大氣壓的範圍進行。在共存培養基中添加硝酸銀和/或硫酸銅，記載於例如Zhao等，2001、Ishida等，2003、W02005/017152。硝酸銀和/或硫酸銅可以以例如1μM50μM、優選1μM10μM的濃度添加到共存培養基中。在粉末存在下接種土壤桿菌的處理，可以採用例如W02007/069643所述的方法。具體地，可以採用例如下述方法來進行將土壤桿菌懸濁液與粉末混合來接種植物材料，或者，將植物與粉末混合，並用土壤桿菌對其進行接種。對於粉末沒有限制，可以是多孔質粉末、玻璃棉或活性炭，優選多孔性陶瓷、玻璃棉或活性炭，更優選羥基磷灰石、矽膠、玻璃棉。在愈傷組織增殖培養基中添加Ν6無機鹽的處理(Zhao等，2001)，可以通過向愈傷組織增殖培養基中添加N6無機鹽(Chu1978)來進行。在共存培養基中添加半胱氨酸的處理，可以以10mg/Llg/L、優選50mg/L750mg/L、更優選100mg/L500mg/L在共存培養基中添加半胱氨酸。在共存步驟後的、愈傷組織增殖和/或再分化步驟中的培養基中添加羧苄西林，可以採用Zhao等，2001或Ishida等，2003所述的方法來進行。羧苄西林可以在愈傷組織增殖用培養基和/或再分化步驟中以例如50mg/L500mg/L、優選100mg/L300mg/L的濃度添加。而且，羧苄西林雖是抗生素，但其對植物基本上無毒性，可以利用它達到防止培養基中的微生物增殖的目的。本領域技術人員可以在適宜的時機/條件下進行這些處理。此外，從提高轉化效率的角度出發，更加優選對它們進行適宜組合。此外，例如，對於玉米而言，優選組合熱和離心處理、粉末處理、向共存培養基中添加AgNO3和/或CuSO4的處理、向愈傷組織增殖培養基和/或再分化培養基中添加羧苄西林作為抗生素的處理中的2種以上處理。而對於稻，優選包含熱處理和/或離心處理，最優選組合向愈傷組織增殖培養基和/或再分化培養基中添加羧苄西林作為抗生素的處理。因此，優選的轉化提高處理是熱處理、離心處理、熱和離心處理、加壓處理、在共存培養基中添加AgNO3和/或CuSO4的處理、或在粉末的存在下接種土壤桿菌的處理、以羧苄西林作為愈傷組織增殖培養基和/或再分化培養基中的抗生素的處理，或者所述處理的組合O本發明人等通過進行這些處理，在充分增加最終獲得的再分化個體中的轉化個體數方面取得了成功，發現即使不進行轉化細胞的選擇處理，也能夠獲得充分的轉化個體，從而確立了達到實用要求的無選擇轉化方法。可以通過採用PCR等方法確認導入基因的有無，此外，如果是後代個體，還可以通過確認導入基因的表型，容易地獲得所述轉化個體。轉化細胞的詵擇本發明的特點是在從共存直至再分化的用於植物轉化的任何步驟中，均不進行利用通過土壤桿菌導入的核酸的特性的轉化細胞的選擇。作為利用通過土壤桿菌導入的核酸的特性的轉化細胞的選擇的例子，可以列舉出使用選擇藥物抗性基因與選擇藥物的轉化細胞的選擇。「使用選擇藥物抗性基因與選擇藥物的轉化細胞的選擇」是指在從共存直至再分化的用於植物轉化的任何步驟中，用添加了用於選擇轉化植物的藥物的培養基進行培養，通過對選擇藥物的抗性的有無來選擇轉化的細胞。本發明完全不包含這樣的步驟。傳統技術中使用的選擇藥物的例子是抗生素和/或除草劑。作為抗生素，使用對植物有毒性的抗生素，例如潮黴素(〃4夕『π4*>，Hygromycin)、卡那黴素(力t」)或殺稻瘟菌素S(義，7卜寸4夕>S，BlasticidinS)等；作為除草劑，使用例如草胺膦(7才77477，>，phosphinothricin)、雙丙氨膦(匕·7，7才7，bialaphos)或草甘膦(夕'J'於、七一卜，glyphosate)等。為了進行本步驟，插入土壤桿菌中的T-DNA中的DNA，不僅要包含希望在植物中表達的基因，還必須包含選擇藥物抗性基因。這樣的選擇藥物抗性基因在本
技術領域：
是公知的。例如，對於在含潮黴素作為選擇藥物的再分化培養基中進行再分化步驟的情況，植物中必須由土壤桿菌導入潮黴素抗性基因。在本發明中，不進行使用藥物的選擇步驟，因此不需要具有如下的核酸，所述核酸是通過土壤桿菌導入了選擇藥物抗性基因、即選擇標記基因的核酸。因而，並非進行限定，在優選的實施方式中，本發明中不包含這樣的核酸。或者，作為傳統方法，轉化植物的選擇也可以基於植物細胞的「營養缺陷性(要求性)選擇」、例如「糖營養缺陷性(糖要求性)」來進行。關於糖營養缺陷性，已知植物細胞能夠利用的糖有蔗糖(一夕口一7)、葡萄糖等，但不能利用甘露糖。因此，用僅含甘露糖作為碳源的培養基培養植物組織時，由於沒有可利用的糖，植物組織會枯死。基於糖營養缺陷性的選擇正是利用了這一原理。在基於糖營養缺陷性進行轉化植物的選擇時，在植物組織中由土壤桿菌導入使通常植物細胞不能利用的糖類能夠得以利用的基因。這樣的基因是本
技術領域：
公知的，可以使用例如PMI基因、木糖異構酶基因等。本發明中，導入的核酸中不必包含這樣的基因。或者，作為傳統方法，還可以導入容易檢測的基因作為篩選的指標，並通過有無該基因的表達進行選擇。作為這樣的篩選的指標的基因可以列舉出GFP基因等。本發明中，導入的核酸中不必包含這樣的基因。在本發明的方法中，選擇標記基因是指需要轉化的目的基因(G0I基因)之外的其它導入到植物中的基因，導入選擇標記基因的目的是選擇處於大量非轉化細胞中的轉化細胞。對於選擇標記基因沒有限制，作為該選擇標記基因的例子，可以列舉出除草劑抗性基因、抗生素抗性基因、螢光基因等。轉化植物的製作方法利用土壤桿菌的轉化植物的製作方法一般包含以下IV的步驟的全部或一部13分。I.植物材料的製備步驟II.土壤桿菌的製備和接種步驟III.共存步驟IV.愈傷組織增殖步驟V.再分化步驟I.棺物材料的製備步驟本發明的對象植物是可以適用利用土壤桿菌的轉化導入方法的植物。優選為單子葉植物。用於本發明的方法的單子葉植物優選為稻科植物，其中包含稻、玉米、大麥、小麥、蜀黍等，但不限於此。用於本發明的方法的最優選植物為稻或玉米。在本發明的方法中，「植物材料」包括用於供試於利用土壤桿菌法的植物的轉化的該植物的細胞、葉、根、莖、芽、花(包括雄蕊、雌蕊等)、果實、種子、發芽種子或其它任何部位的植物組織、成長點、外植片、未成熟胚、愈傷組織或不定胚樣組織(以下，在本說明書中稱為愈傷組織等，或簡稱為愈傷組織)或完全植物體等的植物的所有形態。作為本發明的方法中使用的植物材料的形態，優選的是未成熟胚或愈傷組織，最優選的是未成熟胚。在本說明書中，植物的細胞、組織、完全植物體這樣的表述具有本
技術領域：
中通常採用的含義。在本說明書中，未成熟胚是指處於受粉後的成熟過程中的未成熟種子的胚和胚盤。此外，對於用於本發明的方法的未成熟胚的時期(熟期)沒有特殊限制，可以在受粉後的任何時期採集。最優選受粉後2日以後的未成熟胚。優選使用未成熟胚胚盤，所述未成熟胚胚盤能夠在後述的轉化後通過後述的方法增殖、並可以誘導出具有再生出正常個體能力的愈傷組織。此外，未成熟胚優選自交體(inbred)、自交體之間的F1、自交體與自然受粉品種間的F1、市售Fl品種的未成熟胚。在本說明書中，愈傷組織是指無序增殖的未分化狀態的細胞塊。為了獲得愈傷組織，可以將植物組織的分化後的細胞在包含生長素(例如2，4-D)或細胞分裂素等植物成長調節物質的培養基(稱為脫分化培養基)中進行培養而獲得。該為了獲得愈傷組織而進行的處理稱為脫分化處理，此外，該過程稱為脫分化過程。在本步驟中，視需要，將植物組織、未成熟胚等從植物體、種子等中取出，製備適於轉化的植物材料。植物材料的製備可以按照公知方法來進行。此外，根據需要，也可以在使植物材料被土壤桿菌感染之前進行培養。II.土壤桿菌的製備和接種步驟對本發明中使用的植物材料接種土壤桿菌。本說明書中使用的「接種」是指使土壤桿菌與植物材料接觸，本
技術領域：
中各種接種土壤桿菌的方法是公知的。作為本方法，可以列舉出例如在將土壤桿菌懸浮在液體培養基中而得到的懸濁液中加入植物材料的方法、將土壤桿菌的懸濁液直接滴加到共存培養基上的植物材料上的方法、向植物材料中注入土壤桿菌懸濁液的方法、和將植物材料浸漬在土壤桿菌懸濁液中並減壓的方法等。然而，本發明中使用的接種了土壤桿菌的植物材料並不限於採用這些方法接種了土壤桿菌的植物材料。在該土壤桿菌的接種步驟中，為了改善利用土壤桿菌的轉化效率，可以使土壤桿菌的懸濁液中包含例如乙醯丁香酮(acetosyringone)、表面活性劑、多孔性陶瓷等各種添加劑。本發明中可使用的土壤桿菌可以是公知的任何土壤桿菌屬細菌，但優選為根瘤土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)或毛根土壤桿菌(Agrobacteriumrhizogenes)。在本發明的優選實施方式中，土壤桿菌是例如LBA4404、EHAlOl和AGL1、C58C1等，但不限於此。很早就已知土壤細菌土壤桿菌(Agrobacteriumtumefaciens，根瘤土壤桿菌)能夠引發多種雙子葉植物的冠癭病(crowngalldisease)，在二十世紀70年代，發現Ti質粒與病原性相關，而且作為Ti質粒的一部分的T-DNA被重組到植物基因組。此後明白了該T-DNA上存在與合成誘發腫瘤所必要的激素(細胞分裂素和生長素)相關的基因，其儘管是細菌基因卻在植物中表達。在切除T-DNA與向植物的傳遞方面，在Ti質粒上的毒力(Virulence)區域(vir區域)中存在的基因群是必要的，此外，為了使T-DNA可被切出，T-DNA兩端上存在的邊界序列(#一夕『一配列)是必要的。作為其他土壤桿菌屬細菌的毛根土壤桿菌也具有基於Ri質粒的同樣的系統(例如日本特開2000-342256的圖3和圖4)。由於土壤桿菌的感染，T-DNA可以重組到植物染色體組中，因此，在T-DNA上插入期望的基因的話，可以預見該基因也重組到植物基因組中。然而，因為Ti質粒非常大，有190kb以上，用標準的基因工程方法在質粒上的T-DNA上插入基因是困難的。因此，開發了用於在T-DNA上插入外源基因的方法。首先，製備了LBA4404(參照Hoekema,A.，等，(1983)，Nature,Vol.303,p.179-180)、C58C1(pGV3850)、GV3TillSE等從腫瘤性Ti質粒的T-DNA上去除了激素合成基因而得到的解除型菌株(disarmedstrains)0通過使用這些，開發了將期望的基因導入到土壤桿菌的Ti質粒T-DNA中或者將具有期望基因的T-DNA導入到土壤桿菌中的2種方法。其中的一種是進行容易的基因操作就可能插入期望的基因的方法，該方法通過三系雜交法(triparentalmating)，通過同源重組，將在大腸桿菌中能夠複製的中間載體導入到土壤桿菌的解除型Ti質粒的T-DNA區域中，其稱作中間載體法。還有一種是稱作二元載體(binaryvector)法，該方法是基於下述結果在將T-DNA重組到植物中時，需要有vir區域，但發揮功能時卻沒有必要存在於相同質粒上。在該vir區域中存在有virA、virB、virC、virD、virE以及virG，(植物廣4才歹夕7口夕一事典(工>夕7°，4夂株式會社發行(1989)))，所謂vir區域，是指包含virA、virB、virC、virD,virE以及virG中的全部。因此，二元載體是將T-DNA重組到可在土壤桿菌和大腸菌雙方中複製的小質粒中而得到的，可以將其導入到具有解除型Ti質粒的土壤桿菌中來使用。在向土壤桿菌導入二元載體時，可以通過電穿孔法和三系雜交法等公知的方法進行。在二元載體中，有pBIN19、pBI121、pGA482等，以這些為基礎，構建了大量的新型二元載體用於轉化。此外，在Ri質粒系統中，也構建了同樣的載體用於轉化。土壤桿菌A281是強病原性(super-virulent)菌株，其宿主範圍廣，轉化效率比其他菌株高。該特性是由於A281具有的Ti質粒-PTiBo542。到目前，已經使用PTiBo542開發了2種新系統。一種使用了具有PTiBo542解除型Ti質粒的菌株EHA101以及EHA105，由於適用於上述二元載體系統，這些作為轉化能力高的系統而在各種植物的轉化中被利用。另一種使用了超級二元載體系統。超級二元載體(’super-binary'vector)記載15於例如本說明書中引用的以下文獻中。Hiei，Y·，等，(1994)，ThePlantJournal,Vol.6,p.271-282；Ishida，Y·，等，(1996),NatureBiotechnology,Vol.4,p.745-750；Komari,Τ.andKuboΤ.,(1999),MethodsofGeneticTransformationAgrobacteriumtumefaciens.InVasil,I.K.(ed.)Molecularimprovementofcerealcrops.,KluwerAcademicPublishers,Dordrecht,p.43-82；禾口國際公開第95/06722號小冊子，關於超級二元載體系統，記載於例如特開2000-342256的圖4。該系統由具有vir區域(virA、virB、virC、virD、virE以及virG(以下也分別稱做「vir片段區域」))的解除型Ti質粒以及具有T-DNA的質粒組成，因此是二元載體系統的一種。但在使用超級二元載體這點上是不同的，超級二元載體是在具有T-DNA的側的質粒上，即在二元載體上，重組了基本上去除vir片段區域中的至少一種vir片段區域而得到的vir區域的片段(其中，優選至少含有virB或virG的片段，更優選含有virB和virG的片段)。此外，在具有超級二元載體的土壤桿菌中導入重組了期望基因的T-DNA區域時，利用三系雜交法的同源重組可作為容易的方法來使用。在本發明方法中，對於作為宿主的土壤桿菌屬細菌，沒有特殊限制，可以優選使用根瘤土壤桿菌(例如上述的根瘤土壤桿菌LBA4404(參照H0ekema，A.，等，(1983),Nature,Vol.303,p.179-180)以及EHA101)。根據本發明的方法，只要是基於土壤桿菌屬細菌中病原性(vir)區域的基因群的表達的基因導入系統，則沒有特殊限制，均能夠獲得本發明的效果。例如，對於上述的中間載體、二元載體、強病原性二元載體、超級二元載體等中的任何載體系統都可以使用，並可以獲得本發明的效果。但從進一步提高轉化效率的觀點出發，優選強病原性的二元載體、超級二元載體(特別在導入針對的植物是玉米時，優選使用超級二元載體)。在使用將這些載體修飾而得到的不同載體系統時，也是同樣的(例如將土壤桿菌屬細菌vir區域的一部分或者全部切除，然後附加性地重組到質粒中，將vir區域的一部分或者全部切除，作為新的質粒的一部分導入到土壤桿菌中等)。期望向植物中導入的基因可以通過常規方法重組到上述質粒的T-DNA區域中的限制酶部位中。對於大型且具有多個限制部位的情況，有時以常規亞克隆方法將期望的DNA導入到T-DNA區域內並非易事。在這樣的情況下，可以通過三系雜交法，利用土壤桿菌屬細菌細胞內的同源重組，將目的DNA導入。儘管是非限定性的，但被導入的基因的大小優選是大約IOObp200kbp。此外，將質粒導入到根瘤土壤桿菌等土壤桿菌屬細菌中的操作可以通過現有方法進行，可以列舉出上述的三系雜交法、電穿孔法、電注射法以及基於PEG等化學處理的方法。要導入到植物中的基因，與現有技術一樣，基本上是配置在T-DNA的左右邊界序列之間的。然而，因為質粒是環狀的，邊界序列的數可以是1，在要將多個的基因配置在不同部位上時，邊界序列也可以是3個以上。此外，在土壤桿菌屬細菌中，可以配置在Ti或Ri質粒上，或者也可以配置在其他質粒上。甚至，也可以配置在多種質粒上。將土壤桿菌屬細菌接種於植物材料，例如可以通過使植物材料與土壤桿菌屬細菌簡單接觸來進行。接種可以通過常規接種來進行，此外，也可以通過滴加接種來進行。常規接種是通過下述方式進行接種的方法將植物材料與土壤桿菌屬細菌懸濁液(接種源)混合，將植物材料浸漬在該懸濁液中，取出浸漬後的植物材料，將其著床於培養基上，進行共存培養。例如可以這樣進行製備IO6IO11CfuAil左右細胞濃度的土壤桿菌屬細菌懸濁液，將植物材料在該懸濁液中浸漬310分鐘左右後，在固體培養基上進行數日的共存培養。滴加接種是通過下述方式進行接種的方法在著床於培養基上的植物材料上滴加土壤桿菌屬細菌懸濁液，待滴加的懸濁液乾燥後，將植物材料著床於培養基的其它位置或者其它培養基上，進行共存培養。III.共存步驟本步驟中，通過在土壤桿菌的共存下用含生長素類的培養基培養如上述地接種了土壤桿菌的植物細胞，來將DNA從土壤桿菌確實地導入植物細胞。優選地，在使植物材料感染土壤桿菌的同時或者感染後、除去土壤桿菌之前，將植物材料與土壤桿菌進行共存培養。本步驟中使用的培養基在本說明書中稱為「共存培養基」。在共存培養中可以使用公知的培養基。已知有例如LS-AS培養基、riN6-AS培養基、或者還有N6S3-AS培養基、2N6-AS培養基(參照Hiei，Y.，等，(1994)，ThePlantJournal,Vol.6，p.271-282)等培養基。在本發明中，優選在共存培養基中添加生長素類。生長素類通常具有使植物材料脫分化的作用，在本步驟中，基本上所有植物材料的一部分或全部成為脫分化組織(愈傷組織)。做為生長素類，可以列舉出例如3，6_二氯-2-甲氧基苯甲酸(麥草畏)、4_氨基-3，5，6-三氯吡啶羧酸(毒莠定)、2，4_二氯苯氧基乙酸(2，4-D)、2，4，5-三氯苯氧基乙酸(2，4,5-T)和/或三碘苯甲酸(ΤΙΒΑ)。在本發明的優選實施方式中，共存培養基中不含有麥草畏、毒莠定、2，4-D、2，4，5-T以外的生長素類。並非進行限定，麥草畏、毒莠定、2，4-D、2，4，5_T等生長素類在共存培養基中的總量優選為0.1-5.Omg/L、更優選0.5-3.Omg/L、更優選1.0-2.Omg/L、最優選1.5mg/L。本發明人等發現當植物材料為玉米時，通過在共存培養基中添加顯示生長素類中的特別是屬於苯甲酸類除草劑的生長素的活性的物質，轉化效率進一步提高，能夠在不導入選擇標記基因的情況下，獲得轉化植物。苯甲酸類除草劑按其基本結構可以分為(i)苯甲酸型、(ii)水楊酸型、(iii)吡啶羧酸型、(iv)對苯二甲酸型(TakematSu、1982)。然而，(iv)對苯二甲酸型不顯示生長素活性，因而優選屬於(i)苯甲酸型、(ii)水楊酸型、(iii)吡啶羧酸型中任何一種類型的除草劑，更優選為(ii)水楊酸型、(iii)吡啶羧酸型中的任何一種類型。更優選為麥草畏(Dicamba)(3,6-dichloro-o-anisicacid)或者毒莠定(Picloram)(4-amino_3,5,6-trichloropicolinicacid)。因此，對於玉米而言，最優選在共存培養基中添加顯示屬於苯甲酸類除草劑的生長素的活性的物質。或者，對於植物材料為稻的情況，優選添加2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)。本步驟中「培養」是指使植物組織著床(置床)於固體化的共存培養基上或液態共存培養基中，使之在合適的溫度、明暗條件和時間(期間)內生長繁育。共存培養基的固體化可以通過添加本
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公知的固體化劑來進行，作為這樣的固體化劑，已知有例如瓊脂糖等。本步驟中的培養溫度可以適宜地選擇，優選在20°C_35°C、更優選在25°C進行。此外，本步驟的培養優選在暗處進行，但不限於此。本步驟的培養時間也可以適宜選擇，優17選為1天-10天、更優選為7天。IV.愈傷組織增殖步驟在利用土壤桿菌的植物轉化方法中，一般認為愈傷組織增殖步驟是必要的。通過轉移至愈傷組織增殖培養基上並使愈傷組織增殖，能夠獲得「包含轉化了的細胞的集團的細胞塊」。愈傷組織增殖培養基是指包含適於使脫分化狀態的細胞分裂、增殖的植物激素和營養素的培養基，在通常的轉化試驗中，也用作添加抑制未轉化的細胞增殖的藥物(選擇壓力)、使轉化細胞選擇性增殖的「選擇培養基」。因而，該愈傷組織增殖步驟通常是將經過了上述共存步驟的植物材料用含生長素類的培養基進行培養，通過有無基因導入來選擇轉化體的步驟。本步驟中使用的培養基在本說明書中稱作「選擇培養基」，其中為了通過有無基因導入進行選擇而包含選擇藥物等。本步驟是在傳統方法中變更培養基的成分組成，並反覆進行多次。例如，在多次的選擇步驟中，通過在各選擇步驟中提高選擇藥物的濃度，能夠增加藥物選擇的切實性，提高獲得轉化植物體的可能性。本選擇步驟優選進行至少2次、更優選3次。在將本步驟進行多次時，本步驟進行1次需要10天-3星期左右的時間，進行多次選擇步驟總共需要5-10星期左右。因此，在利用土壤桿菌進行植物的轉化方法中，本步驟是最需要時間的步驟。在傳統的利用土壤桿菌的植物轉化方法中，可以認為本步驟是必需的步驟。然而，本發明人等首次發現通過「轉化提高處理」，可以在包括愈傷組織增殖步驟在內的、從共存直至再分化的任何一個步驟中均不進行使用選擇藥物的轉化細胞的選擇，而高效地進行轉化，從而想到了本發明。因此，在本發明中優選可以省略本步驟。即，在共存步驟與再分化步驟之間不包含將共存培養後的組織用愈傷組織增殖培養基進行培養的步驟。發現由此可以進一步提高作業效率，且能在更短時間內進行轉化步驟，從而更有效地獲得轉化植物。在本說明書中的實施例1-4、6-7中，記載了特別是對玉米而言，省略愈傷組織增殖步驟而獲得植物轉化成功的例子。或者，可以不在愈傷組織增殖培養基中添加選擇藥物，而進行愈傷組織增殖步驟。這種情況下，雖然發生愈傷組織增殖，但未進行轉化體的「選擇」。V.再分化步驟本步驟是進行所得細胞塊的再分化、使再分化個體生長繁育、並根據需要獲得完全植物體的步驟。為了從所得轉化細胞再生完全植物體，可以按照公知方法(例如，Hiei,Y·，等，(1994)，ThePlantJournal，Vol.6，ρ·271-282；和Ishida，Y.，等，(1996)，NatureBiotechnology,Vol.14，p.745—750)進行。本步驟在傳統方法和本發明中均是必需步驟。傳統上，可以認為即使在再分化步驟中，利用選擇藥物進行轉化體的選擇也是必要的。轉化植物的選擇可以通過用含選擇藥物的再分化培養基培養經過了共存步驟的植物材料，並根據有無對選擇藥物的抗性來進行。然而，本發明的特徵是在從共存至再分化的植物轉化的任何步驟中，均不使用選擇藥物選擇轉化細胞。因此，在本發明中，即使在再分化步驟中，也不使用選擇藥物進行選擇。本步驟中使用的培養基在本說明書中稱作「再分化培養基」，作為再分化培養基的特徵，可以列舉出不含生長素類。可以作為再分化培養基使用的培養基可以列舉出例如以LS無機鹽類、N6無機鹽類為基本成分的培養基，具體可以使用例如LSZ培養基等。但是，「再分化培養基」中不含選擇藥物。18本發明中「再分化」是指全部或部分脫分化的植物材料重新獲得原植物材料或植物體的性質。通過提供給再分化步驟，脫分化組織發生再分化，可以得到完全的轉化植物體。植物是否發生了再分化，可以通過觀察植物的形態容易地確定。例如，可以通過是否從脫分化組織中出現了莖、葉這樣的特定分化植物器官來確定。在本說明書中，「活力(vigor)」是指再分化出的植物的生長旺盛程度。植物的活力可以採用本
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通行的公知測定方法來測定。例如，對於玉米而言，可以通過進行評分並計算全部轉化植物組織的平均值來求出，其中，再分化步驟後未見再分化的轉化植物組織為0分，再分化出的莖葉的最大長度小於5mm的轉化植物組織為1分，再分化出的莖葉的最大長度為5mm以上且小於2cm的轉化植物組織為2分，再分化出的莖葉的最大長度為2cm以上的轉化植物組織為3分。但是，活力的評價方法並不限於此，可以根據評價對象等，對公知方法進行適當修正。本步驟中「培養」是指使植物組織著床於固體化的再分化培養基上或液體再分化培養基中，使之在合適的溫度、明暗條件和時間(期間)內生長繁育。再分化培養基的固體化可以諸如上述地利用瓊脂等進行。本步驟中的培養溫度可以適宜地選擇，優選在200C-35°C、更優選25°C進行。此外，本步驟的培養優選在16-24小時/天的照明下進行，但不限於此。本步驟的培養時間也可以適宜選擇，優選7天-21天，更優選14天。在進行本步驟之後，可以通過本
技術領域：
公知的方法容易地得到完全的轉化植物體。這是對於所得的再分化個體，確認有無導入基因，確定轉化個體的步驟。並非限定，但優選可以採用PCR、Southern分析等。此外，通過確認導入基因的表型，可以容易地進行選擇。發明的效果通過本發明，可以在單子葉植物的轉化方法中穩定且有效地對期望的植物進行轉化，而無需導入植物選擇標記基因。[圖1]圖1顯示了通過無選擇轉化獲得的雪光再分化植物體的Southern印跡分析結果。從用土壤桿菌LBA4404(pSB134)進行轉化、並由無選擇獲得的再分化植物體中抽提基因組DNA，並用限制酶HindIII進行了消化。將消化得到的DNA進行瓊脂糖凝膠電泳，並與GUS探針進行了雜交。種子來源雪光(對照)(泳道C)，GUS陽性表達(均勻表達GUS)再分化植物體(泳道1-11)、⑶S點狀表達再分化植物體(泳道12-17)。[圖2]圖2顯示了通過無選擇轉化獲得的A188再分化植物體的Southern印跡分析的結果。從用土壤桿菌LBA4404(pSB124)進行轉化、並無選擇獲得的再分化植物體(玉米)中抽提基因組DNA，並用限制酶BamHI進行了消化。將消化得到的DNA進行瓊脂糖凝膠電泳，並與⑶S探針進行了雜交。種子來源A188(對照)(泳道C)，⑶S陽性表達(均勻表達⑶S)再分化植物體(泳道1-13)。[圖3]圖3顯示了通過無選擇轉化獲得的A188再分化當代植物體和Tl後代植物體的Southern印跡分析的結果。將用土壤桿菌LBA4404(pSB124)進行轉化、並無選擇獲得的再分化當代植物體(玉米)與未轉化的A188植物的花粉進行交配，從所得Tl後代植物體中抽提基因組DNA，並用限制酶BamHI進行了消化。將消化所得的DNA進行瓊脂糖凝膠電泳，然後與GUS探針進行了雜交。品系編號195當代(TO)植物體(泳道1)，品系編號195的⑶S陽性表達的後代(Tl)植物體(泳道2-6)，品系編號195的GUS陰性的後代(Tl)植物體(泳道7)。品系編號169當代(TO)植物體(泳道8)，品系編號169的⑶S陽性表達的後代(Tl)植物體(泳道9-13)，品系編號195的⑶S陰性的後代(Tl)植物體(泳道14)。實施例以下，基於實施例對本發明進行具體說明，但本發明不受這些實施例的限定。實施例1從採用常規方法接種的玉米未成熟胚無詵擇地再分化出的棺物體中的基因表汰1.材料和方法無菌採集受粉後第714天的玉米(品種A188)的未成熟胚(大小1.0-1.5mm)，用LS-inf液體培養基(Ishida等，1996)洗滌1次。作為轉化提高處理，進行了用於提高基因導入效率的前處理(46°C、3分鐘的熱處理和20，OOOxgUO分鐘的離心處理)(Hiei等，2006)。在含100μM乙醯丁香酮的LS-inf液體培養基中以約1.0xl09cfu/ml懸浮土壤桿菌株LBA4404(pSB134)(HieiandKomari，2006)作為接種源。向經過了熱/離心處理的未成熟胚中加入接種源，攪拌30秒後，室溫靜置5分鐘。在除了包含2，4-D(2,4-dichlorophenoxy-aceticacid)、還包含5μMAgNO3和5μMCuSO4的LS-AS培養基(Ishida等，1996，固體化劑為8g/L瓊脂糖)中以1.5mg/L的濃度添加麥草畏(Dicamba)(3，6-dichloro-o-anisicacid)，從而得到了共存培養基，將接種了土壤桿菌的未成熟胚著床於該共存培養基上，並使得胚盤在上。將25°C、黑暗條件下培養7天而得到的未成熟胚著床於含10μMCuSO4WLSZ培養基(Ishida等，1996)，25°C、照明條件下培養約2星期。切取觀察到再分化的植物體的葉的一部分，浸漬於含0.的TritonX-100的0.IM磷酸緩衝液(pH6.8)中，37°C靜置1小時。除去磷酸緩衝液後，添加了包含1.OmM5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖醛酸(X_gluc)和20%甲醇的磷酸緩衝液。37°C處理24小時後，考察了⑶S基因的表達。以下總結了實施例1的條件。材料玉米未成熟胚方法常規方法進行土壤桿菌接種轉化提高處理熱和離心處理、培養基中添加Ag+、Cu2+離子的處理在共存培養基中添加的生長素麥草畏共存培養後，不經過愈傷組織增殖步驟，直接進入再分化步驟。載體具有pSB134⑶S基因、潮黴素抗性基因(選擇標記基因)以及部分強病原性菌株的病原性基因的超級二元載體選擇處理全程無2.結果對於著床於LSZ培養基的16個未成熟胚，均觀察到了植物體的再分化。從由各未20成熟胚再分化出來的植物採集413片葉片，考察了GUS基因的表達。其中的2個未成熟胚來源的葉片全部為GUS陰性。從餘下的14個未成熟胚採集的葉片中，有至少1片葉片能夠觀察到GUS基因的表達。在5個未成熟胚中觀察到了顯示點狀表達的葉片。在6個未成熟胚中觀察到了條紋狀表達GUS基因的葉片。發現有2個未成熟胚同時具有點狀表達的葉片和條紋狀表達的葉片。這裡，條紋狀表達的葉片可以認為是轉化細胞與非轉化細胞的嵌合體，而點狀表達的葉片可以認為是一部分轉化細胞中發生了基因沉默。由1個未成熟胚，獲得了切口被均勻染色成藍色的GUS陽性的葉片。本實施例的結果顯示獲得了玉米植物，所述玉米植物是在從共存直至再分化的任何步驟中均不進行使用抗生素等的選擇步驟的條件下用GUS基因轉化而得到的。實施例2從採用滴加法接種的玉米未成熟胚無詵擇地再分化出的棺物體中的基因表汰1.材料和方法向按照實施例1的方法製備的土壤桿菌株LBA4404(pSB134)的接種源Iml中添加約80mg的羥基磷灰石(Bio-Rad)。作為轉化提高處理，進行了用於提高基因導入效率的前處理(46°C、3分鐘的熱處理和20，OOOxgUO分鐘的離心處理)。將上述處理後的未成熟胚(品種A188)著床於共存培養基，並使得胚盤在上，所述共存培養基在是除了包含2，4-D、還包含5μMAgNO3和5μMCuSO4的LS-AS培養基(Ishida等，1996，固體化劑為8g/L瓊脂糖)中以1.5mg/L的濃度添加麥草畏而得到的。用漩渦混合器(VortexMixer)進行攪拌，使得接種源中的羥基磷灰石均勻分散，然後將5μ1的接種源滴加到未成熟胚上。滴加的接種源乾燥後，將未成熟胚移動到同一培養基上的其它位置。將培養器密封后，25°C、黑暗條件下進行7天的共存培養。採用以實施例1相同的方法培養共存培養後的未成熟胚，獲得再分化植物，並且考察了再分化植物的葉的⑶S基因表達。以下總結了實施例2的條件。材料玉米未成熟胚方法採用滴加法進行土壤桿菌接種轉化提高處理粉末處理、熱和離心處理、在培養基中添加Ag+、Cu2+離子的處理在共存步驟中添加的生長素麥草畏共存培養後，不經過愈傷組織增殖步驟，直接進入再分化步驟。載體具有PSB134GUS基因、潮黴素抗性基因(選擇標記基因)以及部分強病原性菌株的病原性基因的超級二元載體選擇處理全程無2.結果對於著床於LSZ培養基的12個未成熟胚均觀察到了植物體的再分化。從由各未成熟胚再分化出的植物採集317片葉片，考察了GUS基因的表達。有3個未成熟胚來源的葉片全部為GUS陰性。對於從餘下的9個未成熟胚採集的葉片，在至少1片葉片中觀察到了GUS基因的表達。在3個未成熟胚中，觀察到了顯示點狀表達的葉片。在4個未成熟胚中，觀察到了其同時具有點狀表達的葉片和條紋狀表達的葉片。由2個未成熟胚，獲得了切口被均勻染色成藍色的⑶S陽性的葉片。本實施例的結果顯示獲得了玉米植物，所述玉米植物是在從共存直至再分化的任何步驟中均不進行使用抗生素等的選擇步驟的條件下用GUS基因轉化而得到的。棚列3白姓綠謹地屏體__體中的某因表汰的效果1.材料以及方法無菌採集受粉後第714天的玉米(品種A188)的未成熟胚(大小1.0-1.5mm)，用LS-inf液體培養基洗滌1次。作為轉化提高處理，進行了能夠用於提高基因導入效率的前處理(46°C、3分鐘的熱處理)。在含100μM乙醯丁香酮的LS-inf液體培養基中懸浮土壤桿菌株LBA4404(pSB124)(Komari等，1996)作為接種源。在經熱處理的未成熟胚中加入接種源，攪拌30秒後，室溫靜置5分鐘。在共存培養基上著床接種了土壤桿菌的未成熟胚，並使得胚盤向上，共著床了24個未成熟胚，所述共存培養基是在除了包含2，4-D(2,4-dichlorophenoxy-aceticacid)、還包含5μMAgNO3禾口5μMCuSO4的LS-AS培養基(Ishida等，1996，固體化劑為8g/L瓊脂糖)中以6.8μM的濃度添加麥草畏(3，6-dichloro-o-anisicacid)或者毒莠定(Picloram)(4-amino_3，5，6-trichloropicolinicacid)而得至丨J的。另一方面，還使用在含5μMAgNO3和5μMCuSO4的LS-AS培養基中包含1.5mg/L(6.8yM)的2，4-D作為生長素的培養基進行了實驗。著床了24個未成熟胚。將25°C、黑暗條件下培養7天而得到的未成熟胚著床於含10μMCuSO4WLSZ培養基(Ishida等，1996)，25°C、照明條件下培養約2星期。切取觀察到再分化的植物體的葉的一部分，浸漬於含0.的TritonX-100的0.IM磷酸緩衝液(pH6.8)中，37°C靜置1小時。除去磷酸緩衝液後，添加了包含1.OmM5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖醛酸(X_gluc)和20%甲醇的磷酸緩衝液。37°C處理24小時後，考察了⑶S基因的表達。以下總結了實施例3的條件。材料玉米未成熟胚方法採用常規方法進行土壤桿菌接種轉化提高處理熱處理、在培養基中添加Ag+、Cu2+離子的處理在共存培養基中添加的生長素麥草畏、毒莠定或2，4_D共存培養後，不經過愈傷組織增殖步驟，直接進入再分化步驟。載體具有pSB124⑶S基因、但不具有選擇標記基因、且具有強病原性菌株的病原性基因的一部分的超級二元載體選擇處理全程無2.結果對於用含麥草畏的共存培養基培養的未成熟胚，著床於LSZ培養基上的24個未成熟胚均觀察到了植物體的再分化。從由各未成熟胚再分化出的植物採集葉，考察了GUS基因的表達。有13個未成熟胚來源的葉片全部為GUS陰性。從餘下的11個未成熟胚採集的葉片中，有至少1片葉片能夠觀察到GUS基因的表達。對於點狀表達、條紋狀表達等不完全表達的個體也進行了計數。對於用含毒莠定的共存培養基培養出的未成熟胚，也全部在LSZ培養基上觀察到了植物體的再分化。有15個未成熟胚來源的葉片全部為GUS陰性。對於從餘下的9個未成熟胚採集的葉片，有至少1片葉片中能夠觀察到⑶S基因的表達。在用含2，4_D的培養基進行共存培養的24個未成熟胚中，有3個未成熟胚未在LSZ培養基上觀察到植物的再分化。在觀察到再分化的21個未成熟胚中，有4個未成熟胚能夠在至少1片葉片中觀察到⑶S基因的表達。這樣，特別是在用含麥草畏和毒莠定的培養基進行了共存培養的未成熟胚中，觀察到了高效率的植物體再分化，且所得再分化植物顯示導入基因表達的比例高。而對於用含2，4_D的培養基進行了共存培養的未成熟胚，雖然也能觀察到導入基因的表達，但程度稍低。本實施例的結果顯示獲得了玉米植物，所述玉米植物是在從共存直至再分化的任何步驟中均不進行使用抗生素等的選擇步驟的條件下用GUS基因轉化而得到的。2，4-D、麥草畏和毒莠定均是具有除草活性的有機化合物中顯示生長素活性的物質。差別在於，2，4-D屬於苯氧基類除草劑，而麥草畏和毒莠定屬於苯甲酸類除草劑(竹松、1982)。以上結果顯示，對於玉米而言，為了從未成熟胚以無選擇的方式高效地獲得轉化植物，在對接種了土壤桿菌的未成熟胚進行共存培養的培養基中所包含的生長素方面，與屬於苯氧基類除草劑的物質相比，屬於苯甲酸類除草劑的物質更為合適。_仿丨丨4寸減心處麵碰価導至__體中的某因表汰的效果1.材料和方法無菌採集受粉後第714天的玉米(品種A188)的未成熟胚(大小1.0-1.5mm)，用LS-inf液體培養基洗滌1次。作為轉化提高處理，進行了用於提高基因導入效率的前處理(461、3分鐘的熱處理和20，000秘、41、10分鐘的離心處理)。作為對照，提供未進行上述前處理的未成熟胚。在含100μM乙醯丁香酮的LS-inf液體培養基中懸浮土壤桿菌株LBA4404(pSB124)作為接種源。在經過了熱和離心前處理的未成熟胚以及作為對照的未經過前處理的未成熟胚中分別加入接種源，攪拌30秒後，室溫靜置5分鐘。將接種了土壤桿菌的未成熟胚著床於共存培養基，並使得胚盤向上，所述共存培養基是在除了包含2，4-D(2，4-dichlorophenoxy-aceticacid)、還包含5μΜAgNO3禾口5μMCuSO4的LS-AS培養基(Ishida等，1996，固體化劑為8g/L瓊脂糖)中以6.8μM的濃度添加麥草畏(3，6-dichloro-o-anisicacid)而得到的。進行了前處理的未成熟胚與未進行前處理的未成熟胚分別提供75個。試驗進行了2次。將25°C、黑暗條件下培養7天而得到的未成熟胚著床於含10μMCuSO4WLSZ培養基(Ishida等，1996)，25°C、照明條件下培養約2星期。切取觀察到再分化的植物體的葉的一部分，浸漬於含0.的TritonX-100的0.IM磷酸緩衝液(pH6.8)中，37°C靜置1小時。除去磷酸緩衝液後，添加了包含1.OmM5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖醛酸(X_gluc)和20%甲醇的磷酸緩衝液。37°C處理24小時後，考察了⑶S基因的表達。以下，總結了實施例4的條件。材料玉米未成熟胚方法採用常規方法進行土壤桿菌接種轉化提高處理(1)熱和離心處理、在培養基中添加Ag+、Cu2+離子的處理(2)未進行熱和離心處理，但進行了在培養基中添加Ag+、Cu2+離子的處理在共存培養基中添加的生長素麥草畏共存培養後，不經過愈傷組織增殖步驟，直接進入再分化步驟。載體具有pSB124⑶S基因、但不具有選擇標記基因、且具有強病原性菌株的病原性基因的一部分的超級二元載體選擇處理全程無2.結果在第1次試驗中，從進行了熱和離心處理的75個未成熟胚中再分化出了296個苗(shoot)。這其中，葉的組織整體顯示出⑶S基因表達的有5個個體。與此相對，從未進行前處理的75個未成熟胚觀察到再分化出了291個苗，其中，葉的組織整體顯示出⑶S基因表達的個體為0。在第2次試驗中，從進行了熱/離心處理的未成熟胚再分化出了243個苗，其中，獲得了4個葉的組織整體顯示GUS基因表達的GUS陽性個體。對於未進行熱/離心處理的前處理的未成熟胚，觀察到再分化出了266個苗，這其中，葉的組織整體顯示出GUS基因表達的GUS陽性個體為1個個體。這些結果顯示，特別是通過對接種土壤桿菌前的未成熟胚進行熱/離心處理，能夠高效地獲得無選擇地再分化出的在植物的組織整體中表達導入基因的個體。只是，獲得僅有1個個體的基因導入的結果的原因可以認為是在共存培養基中添加硝酸銀和硫酸銅的效果。實施例5稻的無詵擇轉化1.材料和方法使開花後812天的稻(品種雪光)未成熟種子脫穎，用70%乙醇處理數秒，再用含1滴Tween20(註冊商標)的次氯酸鈉處理5分鐘。將未成熟種子用滅菌水洗滌數次，收集1.3-1.8mm長的未成熟胚。接著，作為轉化提高處理，為提高基因導入效率，對未成熟胚進行了20，OOOxgUO分鐘的離心處理(Hiei等，2006)。在含100μM乙醯丁香酮的AA-inf液體培養基(HieiandKomari,2006)中以約1.0xl09cfu/ml的濃度懸浮土壤桿菌LBA4404(pSB134)(HieiandKomari,2006)作為接種源。將經過了離心處理的未成熟胚以胚盤側向上的方式著床於nN6-As培養基(Hiei等，2006)上。向各未成熟胚分別滴加接種源5μ1，25黑暗條件下進行了7天的共存培養。共存培養後，將各未成熟胚用手術刀分割成45份。將分割後的未成熟胚以胚盤側向上的方式著床於含250mg/L頭孢噻肟(cefotaxime)與100mg/L羧苄西林的nN6培養基(Hiei等，2006)，30°C、明條件下培養約10天。對於主要因胚盤細胞的增殖而肥大起來的切片，分別將其再分割成45份。在該階段，相對於每個未成熟胚，獲得了18-25個切片。將切片以胚盤側向上的方式著床於含250mg/L頭孢噻肟和100mg/L羧苄西林的nN6培養基(Hiei等，2006)，30°C、明條件下培養約2星期。共存培養後，通過2次培養使愈傷組織增殖，每個胚盤的細胞約增殖了140倍，切片被愈傷組織覆蓋。而且，細胞的增殖比率可以從各切片的大小來推定。從形成於切片的愈傷組織中，每個切片僅取1個愈傷組織(O.5-lmm大)，著床於N6R再分化培養基(Hiei等，2006)，30°C、明條件下培養2星期。從各切片僅取1個愈傷組織著床於再分化培養基的原因是為了獲得來源於隨機且獨立的細胞的植物體。將從各愈傷組織再分化出的叢生芽(Shoot24clump)移植於N6F生根培養基(Hiei等，2006)，30°C、明條件下培養約10天，得到了完全的再分化植物體。而且，上述培養基中一概不含潮黴素、雙丙氨膦(bialaphos)等選擇藥物。切取所得植物體的葉的一部分，將其浸漬於含0.的TritonX_100(註冊商標)的0.IM磷酸緩衝液(pH6.8)中，37°C靜置1小時。除去磷酸緩衝液後，添加含1.OmM5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖醛酸(X-gluc)和20%甲醇的磷酸緩衝液。37°C處理24小時後，考察了⑶S基因的表達。而且，⑶S基因表達的考察是在來自於由1個切片產生的最大的1個植物體的1片葉中實施的。轉化效率採用顯示GUS陽性(均勻表達GUS)的植物體數/考察GUS基因表達的植物數的比例，來進行評價。此外，為了確認導入基因是否重組到再分化植物體的基因組中，通過以下方法進行了Southern印跡分析。採用Komari(1989)的方法從再分化植物體的葉抽提DNA，對於各植物體，用限制酶Hindi11消化7μg的DNA。對於消化得到的DNA，進行0.7%瓊脂糖凝膠電泳(1.5￥/11、15小時)。Southern雜交按照Sambrook等(1989)的方法實施。而且，探針使用的是作為GUS基因片段的pGL2-IG(Hiei等，1994)的SalI-SacI(1.9kb)片段。以下總結了實施例5的條件。材料稻未成熟胚方法採用常規方法進行土壤桿菌接種轉化提高處理離心處理、在培養基中添加頭孢噻肟、羧苄西林的處理共存步驟中添加的生長素2，4_D共存培養後，經過愈傷組織增殖步驟，然後進入再分化步驟。載體具有pSB134⑶S基因、潮黴素抗性基因(選擇標記基因)以及強病原性菌株的病原性基因的一部分的超級二元載體選擇處理全程無2.結果試驗進行了2次(試驗1和2)。試驗1的結果示於表1。在試驗1中，從5個未成熟胚獲得了100個分割切片，並由此分別將100個愈傷組織著床於再分化培養基，從而得到了92個植物體。對於其中的73個植物體，分別取1片葉考察了GUS基因的表達，結果其中的9個植物體是在葉的組織整體中均勻表達⑶S的(⑶S陽性)轉化體。轉化效率相對於再分化植物體為12.3%。試驗2的結果示於表2。在試驗2中，從5個未成熟胚獲得了107個分割切片，並由此分別將107個愈傷組織著床於再分化培養基，從而得到了100個植物體。這其中，對於95個植物體分別取1片葉考察了GUS基因的表達，結果有16個植物體是以均勻表達GUS的轉化體。其轉化效率相對於再分化植物體為16.8%。如上述，完全不經過選擇步驟，而以相對於再分化植物體為10%以上的非常高的效率獲得了轉化體。試驗1和試驗2中均有數個植物體的葉片中GUS基因的表達呈點狀(表1和表2)。該異常表達可以認為是由基因沉默引起的。而且，該顯示點狀表達的植物體不視為轉化體。Southern印跡分析的結果如圖1所示。在⑶S基因表達顯示陽性的再分化植物體中，所考察的11個體全部確認了導入GUS基因的存在(圖1)。對於GUS基因表達顯示點狀的再分化植物體，所考察的6個體也全部確認了GUS基因的存在，但任何一個個體中均存在25導入基因的拷貝數多的傾向(圖1)。此外，對於⑶S基因表達為陰性的再分化植物體，也實施了Southern印跡分析，但在供試的7個植物體中均未檢測出與GUS探針雜交的條帶。在本實施例中，使基因導入後的未成熟胚的胚盤細胞增殖，並由從其中隨機選取得愈傷組織獲得了再分化植物體。這其中，有10%以上是轉化了的植物體。該事實表明，通過土壤桿菌感染未成熟胚的胚盤細胞的10%以上發生了轉化。[表1]使用稻未成熟胚利用土壤桿菌LBA4404(pSB134)製作無選擇轉化體(試驗1)供試未著床於再分化得到再分化植物體數轉化率成熟胚培養基的愈傷組織數(=分割切片數)植物體的愈傷組織數GUS表達GUS陽性考察(a)(均勻表達Xb)GUS點狀表達GUS陰性「(b/a%)1201816201412.52201913301023.Λ3201814101317.14201818201611.1520191211108.3合計1009273916412.3[表2]使用稻未成熟胚利用土壤桿菌LBA4404(pSB134)製作無選擇轉化體(試驗2)供試未著床於再分化得到再分化_植物體數_轉化率成熟胚培養基的愈傷植物體的GUS表達GUS陽性~GUSGUS(b/a%)組織數(=分割愈傷組織數考察⑷(均勻點狀表達陰性切片數)表達)(b)12321931845252220181724211818172121332261216.33231212171216.711.79.528.6合計101009516146516.8mm^^Amtm^Southern分析261.材料和方法將實施例3和4中獲得的轉化玉米(品種A188)於溫室進行栽培。採用Komari等的方法(Komari等，(1989))從這些植物的葉提取DNA，對於各植物體，將10μg的DNA用限制酶BamHI進行消化。對於消化得到的DNA，進行0.7%瓊脂糖凝膠電泳(1.5V/cm、15小時)。Southern雜交按照Sambrook等的方法(Sambrook，J.，等，(1989)MolecularCloning:ALaboratoryManual,2nded.,ColdSpringHarborLaboratoryPress,ColdSpringHarbor,NewYork.)實施。而且，探針使用的是作為⑶S基因片段的pGL2_IG(Hiei等，1994)的SalI-SacId.9kb)片段。2.結果任何一個轉化體均顯示出與⑶S探針雜交的條帶。該圖案因轉化體而異，這表明導入基因隨機插入到植物的染色體上。由此，通過分子水平的方法確認了採用無選擇方法獲得的玉米植物是轉化體(圖2)。實施例7無詵擇獲得的轉化玉米中的導入基因向後代棺物的遺傳1.材料和方法將實施例3和4中獲得的轉化玉米(品種A188)於溫室進行栽培。採集未轉化的AlSS植物的花粉，與轉化植物的絨毛(絹糸)進行交配，得到了後代種子(Tl代)。將所得種子播種在加入了培養土的乙烯缽中。取播種後第11日幼苗的葉，將其浸漬於含0.的TritonX-100的0.IM磷酸緩衝液(pH6.8)中，37°C靜置1小時。除去磷酸緩衝液後，添加含1.OmM5-溴-4-氯-3-吲哚基-β-D-葡糖醛酸(X-gluc)和20%甲醇的磷酸緩衝液。37°C處理24小時後，考察了⑶S基因的表達。採用Komari(1989)的方法從轉化當代植物和上述的Tl植物的葉抽提DNA，對於各植物體，將10μg的DNA用限制酶BamHI消化。對於消化得到的DNA，進行0.7%瓊脂糖凝膠電泳(1.5￥/11、15小時)。Southern雜交按照Sambrook等(1989)的方法實施。而且，探針使用的是作為GUS基因片段的pGL2-IG(Hiei等，1994)的SalI-SacI(1.9kb)片段。2.結果表3顯示了對通過無選擇轉化獲得的玉米轉化植物的後代植物中的GUS基因的分離進行考察的結果。[表3]通過無選擇轉化獲得的玉米轉化植物的後代植物中的⑶S基因的分離權利要求一種轉化植物的製作方法，其利用土壤桿菌來生產轉化植物，該方法包括(i)用共存培養基培養接種了土壤桿菌的植物材料的共存步驟；以及(ii)對於(i)中得到的組織，不進行愈傷組織增殖培養，用再分化培養基進行培養，使其再分化成植物體的步驟，或者對於(i)中得到的組織，在進行愈傷組織增殖培養後，用再分化培養基進行培養，使其再分化成植物體的步驟；其中，在所述轉化植物的製作方法中，1)進行轉化提高處理，以及2)在從共存直至再分化的任何步驟中，均不利用通過土壤桿菌導入的核酸的特性來選擇轉化細胞。2.根據權利要求1所述的轉化植物的製作方法，其中，在該轉化植物的製作方法中，3)在共存步驟與再分化步驟之間不包括用愈傷組織增殖培養基培養共存培養後的組織的步驟。3.根據權利要求1或2所述的轉化植物的製作方法，其中，利用通過土壤桿菌所導入核酸的特性選擇轉化細胞是利用選擇藥物抗性基因與選擇藥物進行選擇的。4.根據權利要求13中任一項所述的轉化植物的製作方法，其中，1)轉化提高處理是提高向植物細胞導入目的基因的效率的處理、提高針對未成熟胚等的愈傷組織誘導率的處理、或者提高針對轉化愈傷組織的再分化效率的處理。5.根據權利要求14中任一項所述的轉化植物的製作方法，其中，1)轉化提高處理選自熱處理；離心處理；熱和離心處理；加壓處理；在共存培養基中添加硝酸銀和/或硫酸銅；在粉末存在下接種土壤桿菌的處理；在共存步驟後的、愈傷組織增殖和/或再分化步驟中的培養基中添加羧苄西林；在愈傷組織增殖培養基中添加N6無機鹽的處理；以及在共存培養基中添加半胱氨酸的處理。6.根據權利要求15所述的轉化植物的製作方法，其中，共存步驟包括添加屬於苯甲酸類除草劑的化合物。7.根據權利要求6所述的轉化植物的製作方法，其中，屬於苯甲酸類除草劑的化合物是苯甲酸型、水楊酸型或吡啶羧酸型。8.根據權利要求6或7所述的轉化植物的製作方法，其中，屬於苯甲酸類除草劑的化合物是3，6-二氯-2-甲氧基苯甲酸或4-氨基-3，5，6-三氯吡啶羧酸。9.根據權利要求18所述的轉化植物的製作方法，其中，植物是單子葉植物。10.根據權利要求19所述的轉化植物的製作方法，其中，植物是玉米或稻。全文摘要本發明的目的是提供新的利用土壤桿菌的轉化植物的製作方法。本發明的製作方法是利用土壤桿菌生產轉化植物的方法，該方法包括(i)用共存培養基培養接種了土壤桿菌的植物材料的共存步驟；以及(ii)對於(i)中得到的組織，不進行愈傷組織增殖培養，用再分化培養基進行培養，使其再分化成植物體的步驟，或者，對於(i)中得到的組織，在進行愈傷組織增殖培養後，用再分化培養基進行培養，使其再分化成植物體的步驟；其中，所述轉化植物的製作方法中，1)進行轉化提高處理，以及2)在從共存直至再分化的任何步驟中，均不利用通過土壤桿菌導入的核酸的特性選擇轉化細胞。文檔編號A01H1/00GK101983007SQ200980112149公開日2011年3月2日申請日期2009年3月24日優先權日2008年3月31日發明者樋江井佑弘,石田佑二申請人:日本菸草產業株式會社