SiO₂/Au核殼結構納米材料-生物蛋白藥物複合物及其製備方法

2023-12-06 09:53:26 1

專利名稱：SiO2/Au核殼結構納米材料-生物蛋白藥物複合物及其製備方法
技術領域：
本發明涉及一種Si02/Au核殼結構納米材料-生物蛋白藥物複合物及其 製備方法，屬於生物納米技術領域。
背景技術：
近年來，納米技術在生物醫藥學方面的應用有著十分重要的地位及美好
前景，納米技術在生物醫藥學領域的應用主要包括如下幾個領域藥物釋放 與靶向定位；細胞與蛋白質檢測；疾病診斷與治療；醫用納米機器人等。
核殼結構貴金屬納米材料近紅外吸收特性的發現，引起了物理、化學、 生物學等相關領域的廣泛重視，使人們看到了金屬納米材料在生物醫學領域 裡的廣闊的應用前景。近紅外區(800-1200 nm)是肌體組織的透射窗口，近 紅外雷射對人體的傷害與其它波段的雷射相比要小得多。應用納米技術製成 的核殼結構納米材料可吸收近紅外光並把光轉化為熱。基於這個思路，世界 上研究較多的是將核殼結構納米金屬組裝為納米給藥系統並被腫瘤組織吸 收並滯留，給藥後在腫瘤部位進行近紅外光照射。經近紅外雷射照射後，金 屬納米材料將吸收的光能轉化成熱能，使局域範圍內的溫度升高，以殺死腫 瘤細胞(腫瘤細胞在42。C左右可被殺死)。另外，將哮殼結構納米金屬與抗 體結合，賦予這種光熱治療腫瘤的納米材料一定的靶向性，以提高抗癌效果。
一直以來，臨床上癌症的治療方案都是以手術、放療、化療為主。上個 世紀70年代美國科學家提出了癌症的"餓死學說"，即通過阻斷腫瘤新生血 管的生成，切斷腫瘤的營養供給，達到遏制腫瘤侵襲、複製和轉移的目的。 美國科學家Judah Folkman教授課題組首次發現一種叫做Endostatin (血管 內皮抑制素)的蛋白質，具有強烈抑制新生血管生成的作用以及一定的靶向 識別作用，然而在小鼠體內試驗成功後卻無法攻克蛋白質復性的難關，無法 實現Endostatin的大規模生產。1999年末羅永章博士在新成立的煙臺麥得 津生物工程股份有限公司首次將Endostatin大規模成功複製，並通過改變 胺基酸序列顯著提高該蛋白的藥用性和療效，之後將某命名為Endostar即恩度。經過一系列技術攻關，於2005年9月12日被國家食品藥品監督管理 局批准為生物製品一類抗腫瘤新藥，成為世界上首例血管內皮抑制素抗癌新 藥。"恩度"這一國家一類新藥，在世界抗腫瘤領域佔據絕對的領先地位。 然而目前恩度的使用都是配用其它常規藥物以期增強藥效，還未見有將恩度 藥物與無機納米材料複合使用的報導。

發明內容
本發明的目的在於克服現有技術存在的缺點和不足，提供一種Si02/Au 核殼結構納米材料-生物蛋白藥物複合物。
本發明的另一目的在於提供一種上述複合物的製備方法。 本發明的目的通過下述技術方案實現本發明提供的一種Si02/Au核殼 結構納米材料-生物蛋白藥物複合物是將Si02/Au核殼結構納米材料通過 Au-S鍵嫁接生物蛋白藥物，並通過硫垸聚乙二醇封閉Si02/Au核殼結構納米 材料的剩餘的非活性位點，以增加體系的生物相容性，延長藥物在體內的循 環時間。
上述複合物的製備方法，其特徵在於包括以下操作步驟
(1) 將氨基聚乙二醇(PEG-NH2)與2-亞氨基硫垸按摩爾比l: l在碳酸 鉀溶液中反應1 2 h，將反應物用水透析提純，得到硫烷聚乙二醇(PEG-SH);
(2) 取Si(VAu核殼結構納米材料、生物蛋白藥物和偶聯劑在碳酸鉀溶 液中混合，靜置過夜，加入步驟(1)所得的硫垸聚乙二醇，在弱鹼性的緩 衝溶液條件下反應1 2 h，得到Si02/Au核殼結構納米材料-生物蛋白藥物 複合物。
步驟(1)所述氨基聚乙二醇(PEG-NH2)的製備方法包括以下操作步驟 將100 mL環氧乙垸溶於50mL的四氫呋喃(THF)溶液中，加入76 mL濃度 為0.5mol/L的雙(三甲基矽烷基)氨基鉀甲苯溶液中，在氮氣保護條件下， 於18 25°C攪拌72 96 h，加入lmL濃度為lmol/L的鹽酸，將上述混合液 倒入500 800 mL二乙醚中，將沉澱物用二乙醚洗滌後真空乾燥，得到分子 量為4800 5200的氨基聚乙二醇。
步驟(2)所述生物蛋白藥物是血管內皮抑制素；所述偶聯劑的一端能 夠和蛋白質偶合，另一端含有巰基-SH或者S-S鍵能夠與金屬偶合，優選2-亞氨基硫烷、正吡啶基二硫化物-聚乙二醇-N-羥基琥珀亞醯胺；所述緩衝溶 液是磷酸鹽(PBS)緩衝液；所述Si02/Au核殼結構納米材料、生物蛋白藥物和偶聯劑的摩爾比為l: 100 200: 100 200。
步驟(2)所述Si(VAu核殼結構納米材料的製備方法包括以下步驟
a、 單分散的二氧化矽納米粒子的製備在磁力攪拌作用下，將體積比 為20: 50: 3: 10的水、無水乙醇、正矽酸乙酯和氨水混合反應，得到粒徑 為110 120nm的單分散的二氧化矽納米粒子；
b、 氨基化的二氧化矽納米粒子的製備將步驟a所得二氧化矽納米粒 子分散於17 19 mL無水乙醇中，加入70 90pL氨丙基三甲氧基矽烷
(APTMS)，攪拌，靜置8 h，水浴煮沸，離心洗滌，得到氨基化的二氧化矽 納米粒子；
c、 二氧化矽金種溶液的製備將粒徑為1 2 mn金膠體與步驟b所得 氨基化的二氧化矽納米粒子混合，觸點超聲30 s，於2 8°C沉化8 h，離 心洗滌，分散於18mL水中，得到二氧化矽金種溶液；
d、 Si(VAu核殼結構納米材料的製備將40 60 mg無水碳酸鉀溶於200 ml高純水中，加入3 mL濃度為25 mmol/L的氯金酸溶液，沉化8 h，得到 氯金酸/碳酸鉀沉化液；取體積比為l: 1000的二氧化矽金種溶液和氯金酸 /碳酸鉀沉化液混合，加入還原劑，得到粒徑為130 150nm的Si02/Au核殼 結構納米材料。
步驟d所述還原劑是甲醛、硼氫化鈉、鹽酸羥胺、四羥甲基氯化磷或抗 壞血酸。
步驟d所述氯金酸和還原劑的摩爾比為1: 100 300。控制氯金酸與還 原劑的用量比，可以實現光學性質在近紅外光區的調節。
上述方法製備的Si02/Au核殼結構納米材料-生物蛋白藥物複合物可用 於製備抗癌藥物。
本發明的原理是首先使用St5ber法製備了單分散的納米二氧化矽球， 然後將氨丙基三甲氧基矽垸(APTMS)嫁接到二氧化矽球表面，在二氧化矽 表面覆蓋約為5-10層，其向外伸出的胺基作為氧化矽表面新的功能基團。 洗滌後，加入細小的金膠體溶液(1-2 nm)，Si02核球表面來自於APTMS中的 -NH2基通過靜電作用吸附金膠體並作為金種，形成金的成核與還原部位。隨 後，通過加入還原劑引發HAuCl4還原反應，生成的Au在金種部位不斷生長、 相連，最終在二氧化矽球表面形成完整的包覆金殼層，'形成的納米殼層連續 性好、緻密度高。然後將生物蛋白藥物使用簡單的偶聯劑2-亞氨基硫垸嫁接 到Si02/Au納米核殼結構表面，2-亞氨基硫烷(2-iminothiolane)是常用的多肽藥物偶聯劑，蛋白質或者多肽上的NH2首先進攻2-亞氨基硫烷中的C+，使 之開環放出巰基，而多肽則連接在C+—端。釋放出的巰基可以很容易偶聯到 金納米殼層表面，最後用PEG-SH封閉Si(VAu上的殘餘非活性位點，增加體 系的生物相容性，。
本發明相對於現有技術，具有如下的優點及有益效果(1)本發明提供 了一種Si(VAu核殼結構納米材料-生物蛋白藥物複合物，複合了無機納米粒 子的物理治療與蛋白藥物的生物治療作用，顯著提高了對腫瘤的治療效果， 可以作為一種新的抗癌藥物；(2)本發明使用簡單的方法製成了包裹緊密、 分布均勻的Si(VAu納米核殼結構，通過簡單可行的方法調諧其表面等離子 共振吸收峰位在近紅外光區移動；(3)充分利用我國恩度等生物蛋白藥物在 世界佔據領先地位這一優勢，將恩度藥物的餓殺癌細胞作用與Si02/Au核殼 結構的光熱治療腫瘤的作用複合到一起，填補了恩度藥物在使用上與無機納 米材料複合這一項空白；(4)使用最簡單的蛋白偶聯劑(2-亞氨基硫烷)將 蛋白藥物嫁接到Si(VAu納米核殼結構上，為實現以後更多的生物藥物與無 機納米材料複合提供了簡單、可行的方案。


圖1是粒徑為120nm的氨基化的二氧化矽納米粒子的透視電鏡(TEM)形 貌圖。
圖2是二氧化矽金種的透視電鏡(TEM)形貌圖； 圖3是Si(VAu納米核殼結構的透視電鏡(TEM)形貌圖； 圖4是氯金酸與甲醛的摩爾比為1:100時製備的Si02/Au納米核殼結構 納米材料的表面等離子共振吸收光譜圖。
圖5是氯金酸與甲醛的摩爾比不同時製備的Si02/Au納米核殼結構納米
材料-恩度複合物的表面等離子共振吸收光譜圖。
圖6是Si(VAu核殼結構納米粒子與Si02/Au-血管內皮抑制素複合粒子 對A549肺腺癌細胞增殖的抑制率曲線圖。
圖7是Si02/Au-血管內皮抑制素複合粒子作用體外細胞48小時後經 808nm紅外光照射7分鐘後的原子力顯微鏡圖，其中左圖為正常細胞，中 圖為經濃度為lmg/L的Si02/Aii-血管內皮抑制素複合粒子作用的細胞，右圖 為經濃度為3mg/L的Si02/Au-血管內皮抑制素複合粒子作用的細胞。
具體實施例方式
下面結合實施例對本發明作進一步詳細的描述，但發明的實施方式不限 於此。
實施例1
Si02/Au核殼結構納米材料的製備
a、 單分散的納米二氧化矽球的製備取10 ml高純水加入到三角燒瓶 中，加入25ml無水乙醇，5ml氨水，磁力攪拌均勻後加入1. 5ml正矽酸乙 酯，室溫下攪拌12 h，得到粒徑為120 nm的Si02納米粒子；
b、 氨基化的二氧化矽納米粒子的製備..加入80 ul氨丙基三甲氧基矽 垸，攪拌10min，靜置8h，水浴煮沸2h，以6000 r/min的轉速離心洗滌， 得到氨基化的二氧化矽納米粒子，TEM形貌圖如圖1所示，分布較均勻；
c、 二氧化矽金種溶液的製備將粒徑為1-2nm金膠體與步驟b所得氨 基化的二氧化矽納米粒子混合，觸點超聲30s，於4t:下沉化8h，以3000 r/min的轉速離心洗滌，得到濃度為3. 89x1012 m1—1的二氧化矽金種溶液，TEM 形貌圖如圖2所示，可以清楚的看到細小的金納米膠體均勻吸附在Si02表面，
提供進一步包金所需的成核位點；
d、 Si(VAu核殼結構納米材料的製備將200ml高純水中加入50mg無 水碳酸鉀，然後加入3ml 25mmol/L的HAuCl4溶液沉化8 h，得到氯金酸/碳 酸鉀沉化液；取25 uL步驟c所得二氧化矽金種溶液與24 mL氯金酸/碳酸 鉀沉化液混合後，加入甲醛，所述氯金酸和甲醛的摩爾比為1: 100，片刻即 可觀察到顏色變化，得到Si02/Au核殼結構納米材料，TEM形貌圖如圖3所 示；測定其表面等離子共振吸收光譜如圖4所示，可以看到在近紅外區出現 較寬吸收峰，最高峰位在824 nm處。 '
Si02/Au核殼結構納米材料-血管內皮抑制素複合物的製備. (l) 將IOO mL環氧乙烷溶於50 mL THF中，加入0. 5 M溶在甲苯溶液 中的雙(三甲基矽烷基)氮基鉀76 mL，混合液在氮氣保護下，於20 。C攪 拌96 h後，用1N的鹽酸處理，將混合液倒入500 mL 二乙醚中，將沉澱物 用二乙醚洗滌並真空乾燥，得到分子量為4800-5200的氨基聚乙二醇；
(2) 將氨基聚乙二醇與2-亞氨基硫烷按摩爾比1: 1在碳酸鉀水溶液中 反應lh，將反應物用二次蒸餾水透析提純，得到硫垸聚乙二醇；
(3) 取Si02/Au核殼結構納米材料、血管內皮抑制素和2-亞氨基硫垸 在碳酸鉀溶液中混合，其中Si02/Au、血管內皮抑制素與2-亞氨基硫垸反應的摩爾比為l: 100: 100，靜置過夜，加入步驟(2)所得的硫烷聚乙二醇，
在弱鹼性的PBS緩衝溶液種反應，得到Si02/Au核殼結構納米材料-血管內皮 抑制素複合物。
將上述表面修飾好的樣品真空乾燥後，進行紅外吸收光譜測定，可以確 認恩度藥物血管內皮抑制素己被成功嫁接到Si02/Au納米核殼結構上。 將產物用PBS緩衝液洗滌，最後分散於PBS緩衝液中，4'C保存。
實施例2
步驟d採用氯金酸與甲醛的摩爾比分別為1:100、 1:150、1:200、 1:250; 或1:300，其餘步驟同實施例l，所得產物Si(VAu核殼結構納米材料-恩度 複合物測得表面等離子共振吸收光譜如圖5所示，發現產物的吸收峰隨著還 原劑甲醛用量的提高而向長波方向移動，吸收峰紅移了 130mn。曲線a、 b 、 c、 d和e分別代表氯金酸與甲醛的摩爾比分別為1:100、 1:150、 1:200、 1:250和1:300時的吸收曲線，說明此反應可進一步通過調節還原速率控制 吸收峰位置，該現象未見文獻報導。
實施例3
將實施例1所得Si02/Au-血管內皮抑制素複合物用於進行體外肺癌細胞 殺滅試驗使用波長為808 nm紅外雷射器，照射時間為7分鐘，肺癌細胞 抑制率採用MTT法測得，結果如圖6所示當用單純Si02/Au核殼結構納米 材料進行體外肺癌細胞殺滅試驗時，其對肺癌細胞的抑制率為30%;而 Si02/Au核殼結構納米材料-血管內皮抑制素複合物進行體外肺癌細胞殺滅 試驗時，其在相同條件下對肺癌細胞的抑制率提高到88%。可見，Si02/Au_ 血管內皮抑制素複合物對體外癌細胞的抑制率確實有非常顯著的效果。
實施例4
將實施例1所得Si02/Au-血管內皮抑制素複合物作用體外細胞48小時 後，經808nm紅外光照射7分鐘後，將體外細胞用原子力顯微鏡觀察，如圖 7所示，左圖為正常細胞，中圖為經濃度為lmg/L的Si02/Au-血管內皮抑制 素複合粒子作用的細胞，右圖為經濃度為3mg/L的Si02/Au-血管內皮抑制素 複合粒子作用的細胞，可以看出在滅殺試驗前細胞表面光滑、平整；而在用 Si02/Au-血管內皮抑制素複合納米藥物試驗後，細胞變得坑窪，皺縮，細胞邊緣絨毛掉落，當提高藥物濃度時，細胞甚至出現孔洞，呈現死亡狀態。所以
Si02/Au-血管內皮抑制素複合粒子對癌細胞的抑制除具有一定的時間依賴性， 還具有一定的濃度依賴性。
上述實施例為本發明較佳的實施方式，但本發明的實施方式並不受上述 實施例的限制，其他的任何未背離本發明的精神實質與原理下所作的改變、 修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發明的保護 範圍之內。
權利要求
1、一種SiO2/Au核殼結構納米材料-生物蛋白藥物複合物，其特徵在於所述複合物是將SiO2/Au核殼結構納米材料通過Au-S鍵嫁接生物蛋白藥物，並通過硫烷聚乙二醇封閉SiO2/Au核殼結構納米材料的剩餘的非活性位點。
2、 根據權利要求1所述的複合物的製備方法，其特徵在於包括以下操作步驟(1) 將氨基聚乙二醇與2-亞氨基硫垸按摩爾比1: 1在碳酸鉀溶液中反應 1 2 h，將反應物用水透析提純，得到硫垸聚乙二醇；(2) 取Si02/Au核殼結構納米材料、生物蛋白藥物和偶聯劑在碳酸鉀溶液中混合，靜置過夜，加入步驟(1)所得的硫垸聚乙二醇，在弱鹼性的緩衝溶液條件下反應1 2 h，得到Si02/Au核殼結構納米材料-生物蛋白藥物複合物。
3、 根據權利要求2所述的複合物的製備方法，其特徵在於步驟(1)所 述氨基聚乙二醇的製備方法包括以下操作步驟將IOO mL環氧乙垸溶於50mL 的四氫呋喃溶液中，加入76mL濃度為0.5mol/L的雙(三甲基矽烷基)氨基 鉀甲苯溶液中，在氮氣保護條件下，於18 25°C攪拌72 96 h，加入l.mL濃 度為lmol/L的鹽酸，將上述混合液倒入500 800 mL 二乙醚中，將沉澱物用 二乙醚洗滌後真空乾燥，得到分子量為4800 5200的氨基聚乙二醇。
4、 根據權利要求2所述的複合物的製備方法，其特徵在於步驟(2)所 述生物蛋白藥物是血管內皮抑制素；所述偶聯劑是2-亞氨基硫烷或正吡啶基二 硫化物-聚乙二醇-N-羥基琥珀亞醯胺；所述緩衝溶液是磷酸鹽緩衝液。
5、 根據權利要求2所述的複合物的製備方法，其特徵在於步驟(2)所 述Si02/Au核殼結構納米材料、生物蛋白藥物和偶聯劑的摩爾比為1:100 200: 100 200。
6、 根據權利要求2所述的複合物的製備方法，其特徵在於步驟(2)所 述Si02/Au核殼結構納米材料的製備方法包括以下步驟a、 單分散的二氧化矽納米粒子的製備在磁力攪拌作用下，將體積比為20: 50: 3: 10的水、無水乙醇、正矽酸乙酯和氨水混合反應，得到單分散的 二氧化矽納米粒子；b、 氨基化的二氧化矽納米粒子的製備將步驟a所得二氧化矽納米粒子分散於17 19mL無水乙醇中，加入70 9(^L氨丙基三甲氧基矽垸，攪拌，靜 置8 h，水浴煮沸，離心洗滌，得到氨基化的二氧化矽納米粒子；c、 二氧化矽金種溶液的製備將粒徑為1 2 nm的金膠體與步驟b所得 氨基化的二氧化矽納米粒子混合，觸點超聲30 s，於2 8 。C沉化8 h，離心 洗滌，得到二氧化矽金種溶液；d、 Si02/Au核殼結構納米材料的製備將40 60 mg無水碳酸鉀溶於200 ml 高純水中，加入3 mL濃度為25 mraol/L的氯金酸溶液，沉化8 h，得到氯金酸 /碳酸鉀沉化液；取體積比為l: 1000的二氧化矽金種溶液和氯金酸/碳酸鉀沉 化液混合，加入還原劑，得到Si02/Au核殼結構納米材料。
7、 根據權利要求6所述的複合物的製備方法，其特徵在於步驟a所得 二氧化矽納米粒子的粒徑為110 120nm;步驟d所得Si02/An核殼結構納米材 料粒徑為130 150 nm。
8、 根據權利要求6所述的複合物的製備方法，其特徵在於步驟d所述 還原劑是甲醛、硼氫化鈉、鹽酸羥胺、四羥甲基氯化磷或抗壞血酸。
9、 根據權利要求6或8所述的複合物的製備方法，其特徵在於步驟d 所述氯金酸和還原劑的摩爾比為1: 100 300。
10、 根據權利要求1所述的複合物作為製備抗癌藥物的用途。
全文摘要
本發明涉及一種SiO2/Au核殼結構納米材料-生物蛋白藥物複合物，所述複合物是將SiO2/Au核殼結構納米材料通過Au-S鍵嫁接生物蛋白藥物，並通過硫烷聚乙二醇封閉SiO2/Au核殼結構納米材料的剩餘的非活性位點。其製備方法包括(1)將氨基聚乙二醇與2-亞氨基硫烷按摩爾比1∶1在碳酸鉀溶液中反應1h，將反應物用二次蒸餾水透析提純，得到硫烷聚乙二醇；(2)取SiO2/Au核殼結構納米材料、生物蛋白藥物和2-亞氨基硫烷在碳酸鉀溶液中混合，靜置過夜，加入步驟(1)所得的硫烷聚乙二醇，在弱鹼性的緩衝溶液條件下反應，得到複合物。本發明複合了無機納米粒子的物理治療與蛋白藥物的生物治療作用，顯著提高了對腫瘤的治療效果，可以作為一種新的抗癌藥物。
文檔編號A61K47/02GK101411879SQ200810219518
公開日2009年4月22日 申請日期2008年11月28日 優先權日2008年11月28日
發明者張浩然, 萌 徐, 滿石清 申請人:暨南大學