光敏感的功能化固載相及其製備方法和應用的製作方法

2023-04-30 18:56:26 2

專利名稱：光敏感的功能化固載相及其製備方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及寡聚核苷酸的功能化固載相，尤其涉及光敏感的功能化化合物以及用該化合物製備的光敏感的功能化固載相及其製備方法，本發明還涉及所述光敏感的功能化固載相在寡聚核苷酸固相合成和功能化中的應用，屬於寡聚核苷酸的固相合成和功能化領域。
背景技術：
光活性基團指在光子激發下，能夠通過形成自由基或異裂中間體，發生化學變化的分子結構。它使在複雜體系中，尤其是在生理環境下，利用光控制小分子或生物大分子的變化成為可能。普遍認為，與溫度、酸鹼度等其它的調控手段相比，光調控具有定位準確，調控及時，對體系影響小等諸多優點。通常所指的光活性基團可分為兩類，即光異構化基團和光可切除基團。前者的光化學過程是可逆的，後者則是不可逆的化學過程。光可切除 基團(caged/caging moieties)的概念最早由J. F. Hoffman於1978年提出\這類基團對340-370nm範圍內的光敏感，能夠有效地吸收這種能量的光子。最常見的光可切除基團是鄰硝基苯基及其衍生物，此外還有對羥基苯乙醯氧基、香豆素類、咕噸酮乙酸類化合物等。由於鄰位硝基的存在，在光激發後，鄰硝基苯乙醇類化合物形成五元環狀中間體，進而得到鄰亞硝基苯乙酮類化合物，與化合物中的其它部分斷開。由於鄰硝基苯乙醇及其衍生物的結構相比其它光可切除基團在合成中或生理環境下較為穩定，因此在大多數生物體系中被廣泛採用，如ATP，DNA，RNA，蛋白質，適配體等。寡聚核苷酸可以用來做PCR引物，用於核酸序列檢測的探針、等位基因特異的寡聚核苷酸分析(Allele-specific oligonucleotide, AS0)、單喊基多樣性分析(Singlenucleotide polymorphism, SNP)、反義寡聚核苷酸,其在分子生物學領域有廣泛的應用。近幾十年來，寡聚核苷酸在分子生物學中發揮著越來越重要的作用，逐漸成為一種非常有效的研究工具。特別是近年來，相關的研究多集中在如何利用寡聚核苷酸從基因水平上研究各種疾病的產生機理及其相關基因的表達網絡，並使其通過調節基因的表達量來預防、診斷和治療相關疾病，作為藥物研發的另一種思路。當寡聚物需要雙標記或需要對3'內切酶穩定時，便需在3'端進行修飾。對於引入3，氨基的固相，其優點是Fmoc能在固相上選擇性地脫除，從而繼續在固相進行ODN的功能化綴合。同時，這種固相引入了一個手性碳原子，在HPLC純化時可能會發現其一對光學異構的寡聚物。其不足是，儘管在寡聚物合成過程中較為穩定，但如果處理失當，某些Fmoc保護基會脫去，這樣自由的氨基會與合成循環中封閉一步所用的醋酸酐發生反應，預期寡聚物的產率降低。另一種引入氨基的固相是利用鄰苯二甲醯亞胺分子，使用濃氨水即可將寡聚物從固相上切下暴露氨基。這種連接臂對合成循環穩定且不存在手性中心。此外還有在固相上第一個鹼基為具氨基側鏈的胞嘧啶或胸腺嘧啶的氨基化方法。對於3,巰基的修飾有二硫鍵保護的巰基修飾的CPG，在合成中為保證二硫鍵不被氧化，所有氧化步驟需使用O. 2M的碘液,合成後用濃氨水從固相上切下(55°C,4小時)，HPLC純化後用TCEP水溶液斷開二硫鍵，不需經HPLC純化即可使用。Shankar研究組曾報告經其修飾的固相先經高氯酸汞處理，然後在THF和甲醇的混合體系中350nm光照2小時可以高於70%的收率釋放固相上連接的Fmoc-氨基丙酸和膽固醇等小分子。而將固相直接暴露在日光下，7天僅釋放5%。此方法可降低固相對日光的敏感度,便於操作。Greenberg等人報告稱3,端為磷酸基的ODN不會被濃氨水從固相上切下，而固相上脫保護的ODN可作為雜交探針，光照後雜交後的雙螺旋寡聚物即從固相切下，有錯配鹼基的反義鏈側不能結合在固相上。3'羥基的固相用Pd°在pH為5. 5的環境下脫除鹼基和五價磷的保護基，然後用光從固相切割下。這種方法可以在ODN中引入對濃氨水敏感或不能經合成轉化而得到的非天然5-羥基胞嘧啶。用3'氨基固相合成0DN，而後光解，在液相中3'端連入芘、留體、生物素、三肽等小分子，再脫去鹼基保護基和5' -DMTr0或在固相合成後，脫DMTr保護基，5'
端連入功能分子，在液相中光解後在3'端連入其它分子，最後濃氨水脫鹼基保護基和乙腈氧基39。這在很大程度上豐富了寡聚核苷酸綴合物的合成方法。3,羧基的功能化也有報導。將鄰硝基苄醇結構保護的氨基和羧基與胸腺嘧啶單體的鹼基連接，寡聚核苷酸合成後並光照處理後，即可暴露氨基和羧基。在鏈中加入功能分子還可通過修飾的DNA單體實現，即先將光活性基團連入胸腺嘧啶2'位置進行DNA合成，光脫保護後再連入功能分子。

發明內容
本發明目的之一是提供光敏感的功能化小分子；本發明目的之二是提供光敏感的功能化固載相；本發明目的之三是提供合成所述光敏感的功能化小分子以及光敏感的功能化固載相的方法；本發明的目的之四是將所述光敏感的功能化小分子以及光敏感的功能化固載相應用於寡聚核苷酸的固相合成或功能化修飾。本發明的上述目的是通過以下技術方案來實現的光敏感的功能化化合物，其結構式為以下式I或式II所示
權利要求
1.光敏感的功能化化合物，其結構式為以下式I或式II所示
2.光敏感的功能化固載相，其為式III或式IV所示的化合物
3.一種合成權利要求I所述式II所示化合物的方法，包括將N-[2-羥基-2-(2-硝基苯基)乙基]4-炔丁醯胺和DMTr-Cl溶於吡啶，在室溫下反應，即得。
4.一種合成權利要求I所述式I所示化合物的方法，包括在無水環境下，1-(2-硝基苯基)-2- (4-炔丁醯胺基)乙基6-羥己基氨基碳酸酯和DMTr-Cl溶於二氯甲烷，滴加三乙胺，室溫下反應，即得。
5.一種合成權利要求I所述式I所示化合物的方法，包括在無水環境下，6-[貳(4-甲氧基苯基)(苯基)甲氧基]己酸三乙胺、1，3_ 二環己基碳二亞胺和4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶於二甲基甲醯胺中，在室溫下攪拌反應後加入N- [2-羥基-2- (2-硝基苯基)乙基]4-炔丁醯胺，在70°C下繼續攪拌反應，即得。
6.一種合成權利要求I所述式I所示化合物的方法，包括在無水環境下，將N-[2-羥基-2-(2-硝基苯基)乙基]4-炔丁醯胺、N，N' -二琥珀醯亞胺基碳酸酯(DSC)和4-二甲氨基吡啶(DMAP)溶解於乙腈，在室溫下攪拌反應後加入6-巰基己醇，繼續攪拌反應，得到S-6-羥己基0-1-(2-硝基苯基)-2-(4-炔丁醯胺基)乙基硫代碳酸酯；在無水環境下，S-6-羥己基0-1-(2-硝基苯基)-2-(4-炔丁醯胺基)乙基硫代碳酸酯和DMTr-Cl溶於二氯甲烷；滴加三乙胺，室溫下反應，即得。
7.一種合成權利要求2所述式III或式IV所示化合物的方法，包括以下步驟 (I)將4-溴丁酸甲酯進行疊氮化而後用LiOH的甲醇溶液水解，得到4-疊氮丁酸；將4-疊氮丁酸與LCAA-CPG形成醯胺鍵，疊氮基被修飾到氨基固相上；(2)用抗壞血酸、硫酸銅、二異丙基乙基胺將氨基固相上的疊氮與權利要求I所述式I化合物中的炔基進行Huisgen疊氮化物-炔烴環加成反應，封閉固相上未修飾的氨基，即得。
8.按照權利要求3-8任何一項所述的方法，其特徵在於所述的室溫為20-30°C，優選為 25。。。
9.一種寡聚核苷酸，其特徵在於含有權利要求I所述的光敏感的功能化化合物或權利要求2所述的光敏感的功能化固載相。
10.權利要求I所述的光敏感的功能化化合物或權利要求2所述的光敏感的功能化固載相在寡聚核苷酸固相合成或/和功能化中的應用。
全文摘要
本發明公開了光敏感的功能化固載相及其製備方法和應用。本發明首先提供了光敏感的功能化化合物，其結構式為式Ⅰ或式Ⅱ所示。本發明進一步將式Ⅰ或式Ⅱ所示化合物與氨基固相相連得到式Ⅲ或式Ⅳ所示的光敏感的功能化固載相，在寡聚核苷酸的固相合成中，將其作為寡聚核苷酸的ODN的3′端，寡聚核苷酸合成結束後，光照下能夠有效地將寡聚核苷酸從固相切除並脫去保護，暴露出對應功能基團連接染料小分子，或通過兩端雙修飾的產物自身形成環狀的寡聚核苷酸。固載率和光切割效率實驗結果表明，本發明式Ⅲ或式Ⅳ所示化合物具有較高的固載率和優異的光切割效率，能夠應用於寡聚核苷酸的固相合成和功能化。
文檔編號C07D249/04GK102702010SQ20121016297
公開日2012年10月3日 申請日期2012年5月23日 優先權日2012年5月23日
發明者湯新景, 蘇蒙 申請人:北京大學